人类小血管卒中自发模型中多种神经、炎症和结缔组织通路的差异基因表达

摘要

介绍

中风是全世界成年人第二常见的死亡原因和最常见的依赖性原因。五分之一的中风，四分之一的缺血性中风，属于腔隙性类型，属于脑小血管病（SVD）的一部分[1]SVD还会导致认知和身体残疾[2]，痴呆风险增加一倍，中风风险增加三倍[3].

大脑SVD影响供应大脑白质和深灰质的穿透性小动脉[1].人类病理学，通常处于晚期，因此很难解开[4]包括小动脉血管壁增厚、血管周围炎症、小动脉壁崩解[5]血管周围损伤，尤其是水肿和脱髓鞘[6]通常被认为是缺血的结果[4]高血压是SVD的主要已知血管危险因素[7]然而，一些有SVD病理学证据的患者缺乏生活中高血压的证据[8]和抗高血压药物试验在预防SVD进展9-11方面取得了喜忧参半的成功。

我们认为，对实验模型中不同潜在SVD机制的研究可能会为人类SVD的发病机制提供见解。尽管存在几种模型，但我们将重点放在了自发性高血压卒中大鼠（SHRSP）上，SHRSP基因稳定，已知能自发模拟人类微血管和脑组织的变化[12],[13]SHRSP是由Wistar-Kyoto大鼠（WKY）通过自发性高血压大鼠（SHR）繁殖而来[14]6周后开始出现高血压，20周左右开始出现中风[12]它会自发性地发展成脂肪透明症和纤维蛋白样坏死、小的深部梗死、出血、白质异常和血管周围间隙扩大，类似于人类SVD相关的病理变化[12],[14]虽然传统上认为高血压是其原因，但我们发现SHRSP中的蛋白质表达存在差异(与。年龄匹配的WKY对照组），仅在5周龄时，即血压升高之前，血压在16周龄和21周龄时持续升高[15]这些内皮细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和基质蛋白异常为解释SHRSP易受脑微血管和实质损伤提供了潜在机制[15].

人类SVD的成分具有高度遗传性，但迄今为止，人类全基因组关联研究（GWAS）已确定与白质高信号相关的基因很少（大多功能未知），而到目前为止，还没有发现与腔隙性卒中16-18相关的基因。导致SHRSP中风发作的遗传因素也知之甚少。SHRSP和WKY之间已知的差异包括5号染色体上的STR-2数量性状基因座与编码心房和脑钠肽19-21的基因共定位，2号染色体（R202H）上的单核苷酸多态性（SNP）与谷胱甘肽S-转移酶的表达相关[22]和，根据最近的GWAS，自发性高血压大鼠亚群中的一些高血压候选基因[23]，但目前尚不清楚哪些因素会直接影响中风[24].

我们假设SHRSP对脑微血管和脑组织病理的易感性是多因素的，涉及多种途径，没有单一的基因缺陷可解释所有的结构和病理变化。我们通过微阵列、定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）和通路分析评估了SHRSP和WKY在5周、16周和21周时在两个大脑区域（额部和冠状中部）正常饮食的脑组织中的mRNA表达，这两个区域已知表达最大病理学[15].

材料和方法

结果

在5周时（血压升高之前），SHRSP和WKY之间的差异表达基因比16周或21周时更多：162个基因在两个脑区差异表达，202个仅在额叶，88个仅在冠状中段差异表达（共452个）。16周（两个区域71个基因，仅额叶30个，仅冠状中叶20个，总计121个）或21周（两区域63个基因，只有额叶131个，只有冠状中叶47个，总计241个）时差异表达的基因要少得多。

在5周时对所有452个差异表达基因进行的灵巧路径分析表明，这些基因涉及多个功能路径（表1)其中许多在16周和21周时仍受影响（表2). 这两个大脑区域的一个共同特征是“神经疾病”基因的显著过度表达（图1)尤其是那些参与脑病,(打、击等的)一下,抑郁和血脑屏障泄漏（表三; 更多详情见表S1和S2）。

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图1

通过对5周龄SHRSP和WKY动物个体生物复制品中所有显著差异表达的神经基因进行分级聚类，生成热图。每个基因的相对表达由颜色强度表示，其中（a）额叶区的79个基因中红色上调，绿色下调，（b）冠状中段的48个基因。

差异基因表达的网络分析显示转录因子的SHRSP显著上调（图2)包括福斯,6月B日,Btg2型和早期生长反应基因(埃及1,第二阶段,埃及4)，细胞信号传导的核心基因(第2页[Cox2公司],Nfkbia公司,铂族,Sgk1公司)和C3；其他则下调（例如胰岛素样生长因子[免疫球蛋白2]，白蛋白[阿尔布],Gfap公司和14毫米).

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图2

来自“神经疾病”功能组的网络，代表SHRSP差异表达基因之间的相互作用与通过Ingenuity Pathway Analysis软件生成的5周龄WKY大鼠。与WKY相比，SHRSP中以红色突出显示的基因表达下调，而以绿色突出的基因表达上调。实线表示直接相互作用。虚线表示间接相互作用。受影响基因的详细信息见表S1和S2。

在所有年龄段，使用IPA进行的生物途径分析表明，最显著差异表达的基因位于急性期反应信号途径中，但包括昼夜节律和补体在内的其他途径也受到影响（图三). 在急性期通路中，补体因子3（C3）上调，而阿尔布和转录因子4被下调。补体途径的三个组成部分（经典、凝集素和替代）均受到影响(C3类上调，指挥与控制和补体第四成份下调）（图4). 在16周龄和21周龄SHRSP中，前五个受影响的通路还包括与紧密连接结构和信号传递相关的基因。

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图3

Ingenuity pathway Analysis中确定的“急性期反应”生物途径中的基因细节，这些基因在SHRSP的额叶部分有差异表达与。 5周龄WKY大鼠。与WKY相比，SHRSP中红色突出的基因下调，绿色突出的基因上调。实线表示直接相互作用。虚线表示间接相互作用。

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图4

Ingenuity pathway Analysis中确定的“补体”生物途径中的基因细节，这些基因在SHRSP的额叶部分有差异表达与。 5周龄WKY大鼠。与WKY相比，SHRSP中红色突出的基因下调，绿色突出的基因上调。实线表示直接相互作用。虚线表示间接的相互作用。

在最高度上调基因是（表4)：大鼠基因组数据库（RGD）基因1564649与尿白蛋白分泌有关（高达48倍）；核糖体蛋白S9(9卢比)参与细胞增殖的翻译调节因子（高达26倍）；和鸟苷酸环化酶可溶性亚基α-3(古西1a3，高达20倍），细胞内一氧化氮（NO）血管平滑肌受体。在大多数下调基因是：阿尔布（各年龄段下降约三倍）；精氨酸加压素(平均值，5周时下降四倍）；鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α抑制1(Gnai1号机组16周时下降了三倍）；和催产素（21周时下降了约三倍）。

与之前观察到的蛋白质免疫反应性相比[15]，我们发现claudin-5、I型胶原或Iba-1的mRNA表达没有差异。然而，14毫米5周时SHRSP中mRNA表达下调，基质金属蛋白酶14（MMP14）已被证明通过与血管分子相互作用在调节血管稳定性和血管对组织损伤的反应中起关键作用[27].下调兆比特21周时mRNA表达（2.6倍）与之前观察到的所有年龄段髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫反应性降低一致[15]没有相关的免疫组织化学抗体可用于检测AVP或GUCY1a3的差异蛋白表达，但mRNA数据与其他结果20–22一致。

qRT-PCR（表S3）证实了MMP14的微阵列数据（5周时下降了5倍，P（P） < 0.01); GFAP（5周时下降两倍，P（P） = 0.01); 和AVP（5周时下降了四倍，P（P） < 0.001）（图5). qRT-PCR未确认阿尔布,古西1a3,兆比特或Gpr98型调查结果。这个阿尔布差异可能是一种“底线效应”，即mRNA微阵列的更大动态范围检测到的低mRNA表达无法通过qRT-PCR检测到。尽管一致性>15倍古西1a3各年龄段SHRSP mRNA表达上调，qRT-PCR显示无显著差异。微阵列和qRT-PCR探针检测由>1000个核苷酸分开的不同基因片段。全基因测序显示，该基因的3′非翻译区（UTR）存在SNP古西1a3位于4379位的基因（WKY胞嘧啶，SHRSP胸腺嘧啶）。mRNA微阵列、qRT-PCR和免疫组织化学之间的差异可以通过microRNA与3′UTR区结合引起的真正功能差异进一步解释[28]，或通过翻译后修饰[29]翻译后修饰可能是过度暴露于神经递质或活性氧水平增加的结果[30]已知存在于SHRSP中[22].

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图5

使用qRT-PCR验证5周龄大鼠（a）GFAP、（b）MMP14和（c）AVP基因表达的显著变化。条形图表示WKY和SHRSP之间折叠变化的差异。误差条形图表示平均值的标准误差。每个条形代表n个 = 4只大鼠*P（P） < 0.05. **P（P） < 0.01. ***P（P） < 0.001. （a） GFAP mRNA在SHRSP额叶的表达显著降低。

讨论

SHRSP和WKY之间的差异基因表达已被证实，前10个差异表达基因的折叠变化大于2.5，并且通过了P（P） < 0.05. 这些差异在5周时最为明显，并随着年龄的增长而减弱。基因表达的最大差异出现在最年轻的高血压前期年龄组，这一事实支持了这样一种假设，即存在与原发性高血压无关的遗传因素，这些因素是神经血管单位易受损的基础，并且其中一些基因的表达随着年龄的增长而减少。虽然需要进一步的基因组分析来评估这一点，但其中一些途径可能与特定年龄的过程有关，例如发育生长。

我们证明了神经血管单元周围的几个关键功能和生物路径之间的多重转录调节差异，这解释了SHRSP复杂的脑部病理学。受影响的主要生物途径是“神经”和“炎症”。受影响最严重的基因在所有三个受检年龄段中普遍保守。这些差异表达的基因组合可能共同增加微血管损伤和中风的易感性。本研究数据和免疫组织化学提示可能涉及的机制[15]包括：内皮完整性受损（claudin 5、MMP14降低），增加血管内皮对血浆成分的通透性，损伤小动脉壁，继而损伤血管周围脑；白蛋白减少通过降低血浆渗透压促进液体渗入血管壁和脑间质[31]; 小胶质细胞炎症反应增强，由于超氧物22、32–34中NO降解增加，NO生物利用度降低；髓鞘化（MBP降低）受损，胶质增生（GFAP增加）增加，脑损伤加重；血管调节受损（降低平均值和Gnai1号机组)并且可能降低NO的生物利用度（NO受体的功能性增加古西1a3)通过受损的脑血管扩张进一步增加缺血的易感性。

上调的炎症途径基因表明早期免疫系统受到慢性挑战，其他研究也表明了这一点[12]与对照菌株相比，这可能触发或加重老年SHRSP中观察到的血管和血管周围损伤。SHRSP和WKY之间有显著差异表达的几个基因是cAMP反应元件结合蛋白（CREB）的下游转录靶点，尤其是转录因子（图6). CREB调节的基因与盐诱导高血压病的血管重塑有关[35]。我们发现Creb1号机组，但不同的磷酸化Creb1号机组，由NO启动[36]可能是转录因子表达增加的来源，如果在未来的实验中显示出来，将为改变细胞内NO信号传导提供进一步的中心作用证据。

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图6

使用5周、16周和21周SHRSP和WKY cAMP反应元件结合蛋白下游转录靶点的中位数表达的层次聚类生成的热图(奶油色). 每个探针的相对表达由颜色强度表示，其中（a）额叶（F）区的17个基因中红色上调，绿色下调，（b）中冠状（M）区的18个基因。基因列在右侧。

减少平均值与STR-2基因座的报告异常一致[19]与SHRSP首次卒中时间相关[20]强调完整血管调节的重要性。潜在的功能差异古西1a3与观察到的内皮素1A受体增加相一致[34]由于超氧物对NO的降解增加，SHRSP中NO的生物利用度较低[22],[32],[33].古西1a3最近的一项关于人类血压和心血管疾病风险的GWAS中也发现了[37].

紧密连接通路缺陷与旧SHRSP的数据一致[38]显著且持续异常的急性期反应途径与蛋白尿的报告一致，并在高血压之前升高血清炎性蛋白[39]尽管食盐补充使这些研究陷入混乱[12]补体和其他炎症基因表达的增加与一个多世纪以来在人类病理学上观察到的血管周围炎症一致[4].10个月龄无中风SHRSP升高的同一群体大鼠的一项研究中的MBP[40]与目前的研究相反。两项研究中的大鼠都以相同的饮食喂养，并保持在相同的条件下，因此不同的发现不能像早期的一些研究那样归因于盐负荷。Brittain研究的老鼠等.[40]在10个月龄时，幸存下来的是少数无中风患者，因为格拉斯哥SHRSP群体中约有70%的人在9个月前中风并死亡。由于我们的大鼠是在幼年时被处死的，我们无法知道它们是否在9个月前中风的70%中。值得注意的是，我们确实在一个用于基因表达分析的SHRSP（EL Bailey和C Smith，unpub.obs.）中发现了早期小动脉纤维蛋白样微血管变化的组织学证据，与Brittain相比等.

虽然在这项研究中，我们的大鼠数量有限，但我们让对照动物处于相同的条件下，仔细地对所有分析进行盲法处理，对同一只大鼠的对侧大脑半球进行免疫组化，并使用多种重叠方法检查我们的发现。

我们认为SHRSP大鼠数据是有效的动物模型数据，有助于集中翻译研究。在人类中，中风是一种复杂的多因素疾病，这使得复杂的自发性疾病模型具有高度相关性。METASTROKE对中风GWAS数据的大型荟萃分析强调了特定中风亚型的必要性，并强烈建议不同的中风亚型背后有不同的致病机制[18]大多数人类脑小血管卒中的遗传结构尚不清楚，因为卒中表型不准确以及与年龄相关的多种累积性共病阻碍了其遗传结构。老年痴呆患者的脑微阵列研究显示多血管壁、内皮和脑实质异常，包括内皮渗漏[41]但诱发因素和潜在易感性很难从终末期疾病中分离出来。人类GWAS支持SVD的多因素性质[17]SHRSP在疾病发展早期血脑屏障通透性增加[42]在一些初步研究中，是与人类SVD相关的一个关键特征[1].血管调节异常，长期被怀疑存在于人类SVD中，并与SHRSP首次卒中时间相关[19]一旦上述多因素环境建立，可能是导致SVD脑损伤的最终因素。莱顿长寿研究的人类数据表明，活到晚年（相当于SHRSP中的10个月）的人不太容易受到白质损伤和腔隙性梗死的影响[43]我们有兴趣研究年龄较大（10个月）的无中风SHRSP大鼠，以评估髓鞘完整性。

总之，我们的数据支持SVD的多因素理论，许多遗传易感性和生物途径可能会导致典型的病理改变。应考虑使用新的单细胞mRNA技术的类似靶向方法，以确定神经血管单元的几个组成部分中类似的低水平多因素缺陷模式是否可以解释人类SVD的易感性。

致谢

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