肝病的表观遗传学

摘要

肝病学中一个尚未回答的问题是，为什么只有极少数的肝脏患者进展到严重的症状状态，而大多数患者仍然相对健康。当我们找到这个问题的答案时，随着疾病预后、患者分层和治疗方面的预期进展，患者管理将真正转变。毫无疑问，在全基因组关联研究（GWAS）中，存在着越来越明显的遗传影响。然而，对于肝病发展为肝硬化、肝细胞癌（HCC）和器官衰竭的人群变异性，我们仍然缺乏可靠的遗传学解释。更深入的GWAS可能更好地阐明不同疾病进展的机制基础，以及与纤维化和肿瘤发生相关的罕见遗传多态性的发现。此外，对细胞表型和疾病有许多表观遗传影响。这些信号在DNA序列上方（希腊语中“epi”意为“on”）起作用。表观遗传机制可以在全基因组水平上影响基因表达和细胞行为，它们具有高度的动态性，对细胞微环境作出响应，并在细胞、组织和生物体水平上表现出相当大的分子多样性。

表观遗传学及其组成调控机制简述

表观遗传性状的现代公认定义是“一种稳定遗传的表型，由染色体的变化引起，而DNA序列没有改变“通过“遗传”，这一定义适用于有丝分裂和减数分裂的表型传递。目前关于表观遗传学的大多数综述都提供了一个狭义的描述，通常侧重于三个组成调控系统；DNA（CpG）甲基化、组蛋白翻译后修饰和微RNA（miRNAs）。事实上，读者应该意识到额外的表观遗传影响，如转录因子、组蛋白重塑复合物和非编码RNA的整个范围，包括最近作为染色质结构和功能调节器出现的长非编码RNA（lncRNAs）(图1)。至关重要的是，这些不同的表观遗传元素之间存在着大量的功能性串扰，它们结合起来决定了细胞表型。

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图1

影响基因表达的表观遗传机制综述。DNA被包装成组蛋白八聚体（或核小体），在DNA“串”上被描述为“珠”或“卷轴”。核小体在调控序列中的紧密程度由组蛋白尾部的修饰控制，如磷酸化（P）、乙酰化（Ac）和甲基化（Me）。RNA聚合酶II和相关转录调控因子与基因启动子处的染色质的结合取决于染色质重塑蛋白（SWI/SNF）所指示的核小体结构的间距和组织。随着转录的进行，RNA聚合酶II读取基因并拉长新生转录物的能力取决于下游DNA的可接近性，下游DNA由额外的组蛋白标记控制。例如，标志性H3K27me3的存在能够招募多梳群复合物（PcG），在长非编码RNA（lncRNAs）的指导下，多梳群复合体可以在特定位点上实现染色质致密化。基因下游区域的这种染色质致密化将抑制RNA聚合酶II的转录延伸，导致转录停滞或终止。

表观遗传学与肝细胞癌

病毒是HCC表观遗传变化的驱动因素

病毒来源的癌症可以提供对表观遗传学和肿瘤生物学之间关系的见解。HBV的致癌HBx蛋白诱导DNMT1的表达，并招募DNMT1、3a和3b以刺激IGFBP-3型和第16页^墨水。¹⁷HBx诱导DNMT1的一种机制是下调microRNA miR-152，microRNA直接靶向DNMT1转录物。¹⁸miR-152的过度表达导致整体DNA低甲基化，而miR-152的抑制导致整体超甲基化，并增加DNA甲基化GSTP1标准和CDH1型抑癌基因。丙型肝炎病毒也被证明可以刺激DNA甲基化的改变；例如，Gadd45β启动子在HCV转基因小鼠肝脏和感染HCV JFH1株的细胞中被高甲基化。¹⁹Gadd45β在HCV感染患者和肿瘤组织中表达降低；鉴于Gadd45β在控制细胞周期、生长停滞和DNA修复中的作用，这在功能上具有重要意义。HBV和HCV诱导HCC的研究已确定SWI/SNF样ATP依赖性染色质重塑酶的常见功能突变ARID1A公司和ARID2公司。^20–22HCC肿瘤和HBV/HCV起源的相邻非肿瘤组织的外显子序列测定发现编码H3K4甲基转移酶基因的错义突变MLL、MLL2、MLL3、和MLL4级。²³这些酶对于将染色质重塑为转录活性状态很重要。MLL4级特别令人感兴趣的是，它是HBV整合的一个经常性热点，并考虑到它作为p53靶基因的调节器的作用。²³

PRC2甲基转移酶EZH2及其结构伙伴EED、SUZ12和RBP7在人类肝癌中高水平表达，并通过沉默多个miRNAs促进肿瘤发生。²⁴PRC2调节的miR-125b是H3K9甲基转移酶SUV39H的转录共抑制因子(图2)调节异染色质形成。²⁵SUV39H在人肝癌中过度表达，当HCC细胞株中被敲除时，抑制增殖和迁移。SUV39H是miR-122的阻遏物，miR-122以其刺激HCV RNA翻译的能力而闻名(图2)。然而，miR-122在HBV感染中降低，当小鼠中基因缺失导致自发性肝脂肪变性、炎症、纤维化和HCC时。^26,27HBx通过向miR-122启动子募集过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）及其相关的SUV39H-含辅阻遏物复合物来抑制miR-122。²⁸因此，HCC组蛋白甲基转移酶基因的改变表达或突变破坏了多种调控网络，包括大量参与转录后控制的miRNA。调节一种或多种表观遗传酶活性的药物可能具有相当大的治疗潜力。

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图2

复杂的表观遗传串扰及其对肝脏生理和疾病的影响的一个例子。组蛋白甲基转移酶SUV39H在肝脏生理学中起着中心调节作用；一方面，负向调节microRNA miR-122的表达，它协调参与脂质代谢和肝癌的基因网络的表观遗传控制。此外，miR-122在丙型肝炎病毒的生命周期中至关重要，被认为是一个治疗靶点。另一方面，SUV39H在编码细胞增殖和迁移调节因子的基因上调节组蛋白修饰，其过度表达与肝癌相关。SUV39H的表达受miR-125的转录后调控，而miR-125又受多梳群复合物PRC2及其H3K27甲基转移酶EZH2的影响而转录。

许多miRNAs在HCC中具有机械相关性，并在其他地方进行了详细描述。¹⁴迄今为止，LncRNAs受到的关注较少；然而，其中一些正在成为肝癌的潜在重要因素。肝癌高上调（HULC）是一种500核苷酸lncRNA，是从肝癌中表达的非编码RNA筛选中发现的。HULC在正常人肝细胞中表达，但在HCC组织中强烈诱导。²⁹HULC表达升高也是HBV感染的一个特征³⁰并发现于结直肠癌起源的肝转移组织中。HULC调节HCC增殖和一些HCC相关基因的表达，并在HCC患者的血清中检测到，后者提高了生物标记物开发的潜力。HOTAIR在HCC中表达，与治疗性移植后肿瘤复发的高风险相关。³¹HOTAIR的耗竭抑制肿瘤细胞增殖，刺激细胞凋亡，并产生显著的抗肿瘤作用体内。³²MALAT1是一种在HCC中表达的超大（8000 nt）核lncRNA，与移植后复发的高风险相关。³³肝癌细胞系中MALAT1基因敲除与HOTAIR基因敲除具有相似的行为效应。人们对lncRNAs的未来研究充满期待，并有望对肝脏基因调控产生令人兴奋的新见解。

表观遗传学与肝纤维化

肝星状细胞（HSC）向成纤维前肌纤维母细胞表型的转分化是纤维化发生中的关键事件。转分化需要全球表观遗传重塑来抑制脂肪分化因子，从头开始肌成纤维细胞表型的调节因子的表达和细胞周期进入。根据沃丁顿著名的后生景观模型，³⁴分化状态的逆转或转化对细胞来说是耗费大量能量的，这确保了细胞表型和组织结构的稳定性。因此，HSC可能需要克服能量依赖的表观遗传障碍以采用肌成纤维细胞表型。在这方面，值得注意的是，自噬是细胞循环其胞内成分以产生能量的机制，对HSC激活至关重要。³⁵小分子表观遗传抑制剂，如DNMT1抑制剂5-氮杂脱氧胞苷（5-AzadC）和EZH2抑制剂3-二氮杂胞苷A（dZNep）能有效抑制HSC活化在体外和体内。^36,37我们实验室的研究描述了一种表观遗传中继途径，必须激活该途径才能驱动HSC转分化。³⁷缺乏MeCP2的小鼠可以防止肝纤维化地中海2-HSC缺陷在其成纤维表型中表现出多种缺陷，包括I型胶原、TIMP-1和α-SMA的表达减少。MeCP2可能是组织纤维化的通用共调节因子，因为甲基化CpG结合蛋白2-被删除的小鼠也能防止肺纤维化。³⁸MeCP2同时运行两种机制，以确保PPARγ和HSC转分化的表观遗传沉默。MeCP2直接与PPARγ启动子中富含甲基CpG的调节区结合，并招募抑制转录起始的H3K9me3修饰酶。MeCP2也是EZH2和H3K27me3在阻碍转录延伸的基因下游编码区的表达所必需的。这两种机制有助于解释5AzadC和dZNep抑制HSC转分化的能力。最近，我们的实验室描述了MeCP2如何通过控制H3K4/H3K36甲基转移酶ASH1的表达来促进多个促纤维化基因的转录。³⁹

在HSC激活过程中，DNA甲基化的变化已在特定位点被报道，如PTEN抑癌基因和Patched 1（PTCH1）基因；在这两种情况下，基因都会甲基化，这与肌成纤维细胞中的表达减少相对应。⁴⁰迄今为止，我们缺乏对HSC激活期间DNA甲基化变化的全基因组研究。然而，Diehl实验室最近发表的一项里程碑式研究对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者肝活检材料中69247个差异甲基化CpG位点进行了检测，这些患者分为晚期（F3-4）和轻度（F0-1）疾病。⁴¹76%的差异修饰的CpG位点在晚期疾病中发生了低甲基化，而24%的位点发生了高甲基化。DNA甲基化中NAFLD相关变化的机制基础尚未研究。DNA甲基组数据与来自相同活检的转录组数据重叠；这导致发现了几个在晚期NAFLD中同时发生低甲基化和过度表达的关键纤维生成基因。然而，当使用整个组织进行DNA甲基体分析时，观察到的差异可能只是反映了组织中的细胞和/或结构变化，而不是识别驱动纤维形成的分子变化。也没有证据表明DNA甲基化的改变与观察到的基因表达差异直接相关；这两者可能只是巧合。

所有大小和活性的非编码RNA很可能在确定HSC表型和肝纤维化方面发挥基本功能。许多调节增殖、凋亡、TGFβ1信号传导和胶原表达的miRNA被描述为HSC表型和纤维化进展的调节因子。⁴²我们正在等待对lncRNA物种功能的研究。

表观遗传学与非酒精性脂肪性肝炎（NASH）

营养、表观遗传学和代谢性疾病之间的联系已经牢固确立。Agouti小鼠的表型包括肥胖和易患癌症，可以通过补充母体饮食中的甲基供体来预防。⁴³缺乏甲基供体的饮食会促进DNA低甲基化和啮齿动物脂肪变性的发展。相比之下，用甲基供体补充高热量饮食可预防NAFLD，这表明改变肝脏脂肪代谢的表观遗传变化可能与DNA甲基化的动态变化有关。^44,45脂质代谢和昼夜节律之间有着密切的联系，后者由时钟机制控制。CLOCK-BMAL1昼夜节律转录因子调节数百个基因，包括PPARs；因此，PPAR调控的代谢基因是有节律表达的。⁴⁶小鼠缺乏时钟过度吞咽，肥胖，并发展为NASH。⁴⁷脱乙酰酶SIRT1与CLOCK-BMAL1形成染色质复合物，其活性以昼夜方式调节。这种CLOCK-SIRT复合物决定组蛋白乙酰化的程度以及昼夜节律和代谢基因的转录幅度。中度过度表达Sirt1（信号1）在小鼠中，可保护其免受高脂肪诱导的代谢性疾病。⁴⁸这些数据在考虑昼夜节律紊乱的人群的流行病学数据时具有相关性，例如具有代谢紊乱高风险的轮班工人。⁴⁹然而，研究NASH表观遗传重编程的临床研究才刚刚开始。⁵⁰对瘦肉对照组、健康肥胖组和NASH患者的肝活检进行DNA甲基化和转录组分析。对45000个CpG位点的分析显示467个二核苷酸甲基化偏离了瘦对照。通过与转录组数据叠加，确定了8个基因(GALNTL4、ACLY、IGFBP2、PLCG1、PRKCE、IGF1、IP6K3和个人计算机)显示与肥胖相关的表达改变与CpG甲基化改变呈反向相关。值得注意的是，所有这些基因都是代谢调节器，也是NAFLD疾病驱动因素的候选基因。作为同一研究的一部分，还对减肥手术后5-9个月进行的配对肝脏活检进行了类似分析。编码蛋白质酪氨酸磷酸酶ε的基因(PTPRE公司)胰岛素信号的负调控因子，随着体重减轻而变得甲基化和转录下调。这一发现为体重减轻和控制肝脏胰岛素敏感性之间提供了一个有趣的机制联系。

脂肪性肝炎的进展是NAFLD向纤维化疾病和/或HCC发展的关键一步。良性脂肪变性进展为脂肪性肝炎的一个似是而非的假设是炎症细胞因子（例如白细胞介素[IL]-6、IL-1和肿瘤坏死因子α[TNFα]）的调节受到干扰。用游离脂肪酸培养的肝细胞过度表达ATP-依赖性染色质重塑蛋白Brg1和Brm，这些蛋白在向促炎基因募集时稳定核因子κB（NF-κB）结合并帮助重塑染色质。⁵¹令人印象深刻的是，喂食MCD小鼠的实验性Brg1耗竭抑制了脂肪变性、炎症和纤维化，表明Brg/Brm染色质重塑蛋白在NAFLD进展中起着关键作用。

到目前为止，对NASH中非编码RNA的研究仅限于miRNAs。据报道，大约有100个miRNA在NASH中差异表达，这些miRNA具有巨大的功能多样性，包括控制脂质和葡萄糖代谢。⁵²值得注意的是miR-122，它在脂质和胆固醇代谢中起着重要的调节作用，并与生物钟系统密切相关。mIR-122在健康肝脏中大量表达，但在NASH中表达下调，在小鼠的实验研究中，其功能与NAFLD病理学有关。⁵³

表观遗传学与肝病印记

环境线索可以诱导稳定的适应性性状在世代间传递和影响表型的概念，其理论根源在于所谓的“拉马克”遗传。直到最近，关于哺乳动物表观遗传转基因效应的令人信服的实验证据还很有限，而且大多数研究都是源于母体的，可以认为子宫内事件混淆了数据解释。相比之下，父亲效应更多地归因于真正的表观遗传，因为父亲通常只为后代贡献精子。相关的是，最近有有趣的报告表明，父亲遗传的可遗传表观遗传适应性会影响肝脏功能。喂食低蛋白饮食的雄性近交系小鼠后代的肝脏中调节脂质和胆固醇代谢的基因表达增加。⁵⁴雄性远交大鼠的肝纤维化触发了调节肝星状细胞活化的基因表达变化的多代传递，其表型后果是抑制肝纤维化。⁵⁵有趣的是，在这两项研究中，PPARα和PPARγ的DNA甲基化和基因表达都发生了改变；这可能表明这些核激素受体为整合祖先环境信息提供了表观遗传中枢。尽管1944-1945年荷兰饥荒后代谢紊乱的代际遗传确实提供了一个引人注目的例子，但人类中很少有类似拉马克遗传的证据。根据Veenendaal等人的报告。，⁵⁶暴露于子宫内饥荒，表明对饮食因素的表观遗传适应可能是稳定的，并且可以跨多代传播。这种祖先的表观遗传印记是否有助于肝脏疾病的群体变异尚待确定。

总结和未来展望

遗传和表观遗传变异共同影响疾病易感性和可变疾病进展的观察差异。根据GWAS的经验，在肝脏疾病中进行表观基因组关联研究（EWAS）是不可避免的。然而，进行有意义的EWAS将是一项挑战，因为表观遗传特征具有高度可塑性，显示组织内细胞之间的差异，并且会受到老化和多种环境因素的影响。但是，如果仔细地进行，EWAS与GWAS相结合，将为疾病病理学提供无与伦比的机制洞察力，改善患者分层，以及新的预后工具。与疾病的遗传驱动因素不同，不健康的表观遗传修饰可能被修饰，从而为表观遗传治疗提供了前景。目前已经在进行HDAC抑制剂治疗癌症的临床试验，miR-122抑制剂miraversen治疗慢性丙型肝炎的临床试验以及miR-34（一种强大的肿瘤抑制剂）的首次模拟人试验。^57,58但同样，热情必须与需要克服的重大障碍相调和，尤其是在寻找对给定的表观遗传修饰物具有足够特异性的药物以确保疗效和防止临床毒性方面。值得注意的是，由于疲劳、便秘、腹泻和脱水等副作用，很少有HDAC抑制剂完成了II期测试。⁵⁹理想情况下，结合GWAS和EWAS信息将为临床医生和营养师提供工具，设计基于证据的生活方式改变策略，以防止高危人群中发生肝病，并防止将不健康的表观遗传特征传给后代。

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