哺乳动物细胞核端粒的三维结构

摘要

背景

癌症的特点是多种改变，影响基因表达的调节和基因组的稳定性。这些相互关联的变化发生在细胞核内，在肿瘤发生和发展过程中改变其三维（3D）组织[1,2]. 似乎有理由假定高度组织化的哺乳动物间期核是确定基因组稳定性的结构。根据这些概念，致癌激活重塑了这种核秩序，并为基因组不稳定奠定了基础，正如我们最近测量的条件c-Myc失调一样。c-Myc的放松调控表达改变了染色体和端粒的三维核空间，并使基因组重排在拓扑上可行（Chuang等.，正在准备中）。

因此，定义间期核的结构组织对我们理解间期核中的3D基因组组织至关重要。这种研究可以通过荧光进行就地杂交（FISH）。三维细胞核组织的FISH测量最吸引人的两个特点是能够同时可视化多个目标以及细胞核和细胞的结构组织，这是基于阵列的方法无法实现的。

相间核的组织自19世纪末以来就被研究过[三]. 现在人们普遍认为，染色体在细胞核中的位置在基因调控中起着重要作用[4]. 然而，仍存在一些争议。大多数实验室观察到染色体区域的非随机组织[2,5,6]在进化过程中被保存下来[7]. 核内染色体位置的结构稳定性的研究进一步证实了这一点[8,9]. 然而，对染色体位置有不同的观察结果[10-15]以及细胞周期中染色体位置的变化[16,17].

最近，人们的兴趣也集中在端粒上，早在20世纪30年代，人们就认识到端粒对基因组稳定性的重要性[18]. 端粒覆盖着染色体，负责染色体的完整性[19]防止基因组不稳定[20]. 一些关于细胞核中端粒的三维组织的报告已经发表，主要是关于端粒与核壳的距离。以前曾在核边缘发现端粒[21]，在核外围[22]贯穿整个原子核[13,23]，在非Rabl协会[11]与核仁相关[24]或者在核基质中[25].

还研究了活体人类U2OS骨肉瘤细胞的端粒动力学[26]. 单个端粒显示出显著的方向性运动，并且端粒动态地与早幼粒细胞白血病小体相关。这意味着端粒结构是动态的，可能对转录过程和稳定细胞核中的染色体位置都很重要。

我们开发了一种研究基因组组织的方法，通过分析细胞核中端粒的三维组织及其在细胞周期中的位置变化，使用流动的活细胞。这种方法使我们能够首次确定端粒组织是细胞周期依赖性的，在G2期将端粒组装成端粒盘。此外，我们还发现肿瘤细胞的3D端粒组织被扭曲，形成了端粒聚集体。这些结果强调了非随机和动态的3D细胞核端粒组织及其对基因组稳定性的重要性。

结果和讨论

为了研究细胞核中基因组的组织和结构，我们采用仅标记端粒并测量其三维组织的方法作为染色体分布的指标。在3D荧光测量之后，使用为本研究开发的程序对数据进行分析。该程序发现细胞核中的所有端粒；它们的大小、强度和形状；并决定了细胞核体积内的端粒组织。我们分析的一个关键特性是端粒在核体积内的分布。我们首先对细胞核进行了分割，找到了每个端粒的中心。然后我们发现了包含所有端粒的最小凸多边形集（图。​（图1）。1). 这是通过使用Quickhull算法实现的[27]. 在大多数情况下，我们发现端粒包含的体积类似于球体或扁平球体（圆盘）。它可以描述为具有两个相似半径的椭球体(一≈b条)和另一个第三个(c（c）; 图。​图2）。2). 这样的形状叫做球体。因此，端粒所占体积的平坦程度可以用两个不同半径的比值来描述，一（或b条)和c（c）–账户比值越大，端粒所占体积的形状越扁（或盘状），而一/c（c）≈1表示体积为球形。

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图1

通过拟合包含所有端粒的凸多边形集，可以发现端粒在细胞核体积中的分布。这个体积通常看起来像球体或圆盘，可以描述为椭球体。

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图2

通常，椭球体的主轴沿x'y'z'与显微镜滑动面和光轴不一致xyz公司我们的程序会找到一个包含所有端粒及其主轴大小的椭球体一,b条,c（c）在大多数情况下x“y”椭球体的轴线相似，即。一≈b条因此，比率账户是衡量椭球体和细胞核内端粒组织平整度的良好指标。

光学分辨率和信噪比如图所示。​图3。三。两个相邻端粒的图像（间距分别为1200 nm和400 nm）以及连接这对端粒的直线上的相应强度表明，仍然可以明确区分的最小端粒距离（约200 nm）。

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图3

演示我们测量的信噪比和空间分辨率。荧光强度明亮（典型的信噪比为10:1）。图中显示了两对端粒，间距为1200 nm（顶部），很容易分离，间距为400 nm（底部）。插页显示实际图像。

预计正常小鼠细胞的间期细胞核中会观察到80个端粒（正常人体细胞为92个），然而，在我们的测量中，我们通常能够在每个小鼠细胞中识别出大约40个分离的端粒区域（人类细胞为50个）。以前也曾描述过类似的结果[23,28]. 这可能是由于邻近的端粒比光学分辨率更近（见图。​图3），三)但只要杂交效率高，就不影响对细胞核内端粒分布的分析。中期扩散中所有端粒的二维测量（使用同一探针）证实了这一点，其中至少90%的端粒被明确观察到（图。​（图44).

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图4

由直接从第10天大的小鼠胚胎中分离的胎儿肝细胞制备的中期平板。如所述制备中期染色体和排列物[30]，并与一个标记为Cy3的PNA-端粒探针杂交。90%以上的端粒被清楚地观察到。

我们首先描述了原代BALB/c小鼠B淋巴细胞在细胞周期中的主要观察结果。这些研究之后，对永生化细胞进行了分析。根据淋巴细胞的DNA含量对淋巴细胞进行分类，以确定G0/G1、S或G2/M期（参见方法).

通过分析细胞周期分选的初级小鼠淋巴细胞，我们发现3D端粒组织在细胞周期中发生变化。端粒在G0/G1和S期广泛分布于细胞核内账户比率为0.9±0.4，表示球形分布体积。然而，在G2期间，在整个细胞核中没有观察到端粒。他们的3D组织发生了变化，所有的端粒都假设了一个我们称之为端粒盘的中心结构，这是以前从未报道过的。在这种有序结构中，随着细胞进入G2晚期，所有端粒都在细胞核的中心对齐。这个账户他们假设的比率为6.0±2.0，这意味着圆盘非常平坦（几乎是硬币形状）。

不同阶段的典型淋巴细胞如图所示。​图5。5. The账户这些细胞在G0/G1、S和G2/M期的比率分别为0.8、0.8和6，并且清楚地显示了细胞的相关性账户我们在G2期发现的端粒分布和端粒盘组织的比率。端粒沿着Z轴轴（光轴）相对于XY公司平面与我们系统的点扩散函数具有相同的比率，这是由于沿光轴的光学分辨率较差所致。然而，这对整个原子核的形状影响很小。

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图5

端粒在G0/G1期（上排）、S期（中排）和G2/M期（下排）三种典型细胞细胞核中的分布。每个端粒分布都是从顶视图（XY公司平面），沿光轴Z轴（左列），侧视图(XZ公司平面）沿年轴（中心柱）和开放细胞核中端粒的3D图像（右柱）。当从顶视图和侧视图显示时，端粒显示在细胞核投影图像的顶部。这个投影显示了染色质（以及染色体）的范围，并定义了细胞核的体积和边界。

在原代人淋巴细胞、原代人成纤维细胞和正常人上皮组织中也观察到了类似的结果（更多数据见附加文件）。这表明染色体具有非常精确的顺序，在有丝分裂开始之前预先排列。为了确定端粒盘不是扭曲细胞核的结果，我们的分析程序将端粒的分布体积和形状与4’-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核的端粒分布体积和形状进行了比较，并验证了细胞核本身仍然具有球形体积。我们很少发现扭曲的细胞核，并将这些细胞排除在分析之外。G2中显示的原子核并非完全球形。这样的形状是意料之中的，因为当端粒形成一个圆盘时，它聚集染色体并迫使它们靠近圆盘，这也导致了扁圆形状。

为了进一步研究细胞周期中的相变时间，我们使用了同步溴脱氧尿苷（BrdU）分选方法。细胞群在S期用BrdU脉冲标记并进行流分类。在标记和分类后的3.5、4、5、6、7、8、8.5、9和10小时，将细胞放回培养基中并采集亚群。然后固定细胞进行3D分析。对每个亚群中至少20个细胞进行测量、分析，并将其分为以下三类：1）带有端粒盘的细胞核；2） 有丝分裂细胞；3） 间期细胞无端粒盘和有丝分裂像（评估为G1细胞）。细胞分数随时间的变化如图所示。​图6。6大多数细胞（90%）在BrdU掺入3.5小时后形成端粒盘。因此，这些细胞被解释为G2期细胞。中期细胞的比例在7.5小时达到峰值（65%），没有端粒盘的间期细胞（被解释为处于G1期）的比例在8.5小时达到峰值。

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图6

BrdU阳性细胞被活分选并在S期同步。从培养基中每隔3.5至9小时采集一次。然后固定细胞进行3D分析。对于我们测量的每个时间点：1。具有端粒盘的细胞核比例；2.有丝分裂中细胞的比例；和3。具有间期细胞核但没有端粒盘的细胞比例。百分之九十的细胞在BrdU掺入3.5小时后形成端粒盘，因此被解释为G2晚期的细胞（黑线和圆圈）。进入有丝分裂状态的细胞（虚线和正方形）在7.5小时达到峰值（65%），G1细胞（点线和三角形）在8.5小时后达到峰值（57%）。9.5小时中期数的增加无法解释，可能在实验误差范围内。

这些结果表明端粒盘形成于G2晚期。随着细胞从G2进展到M，染色体组织进入中期，因此，具有端粒盘的间期细胞数量减少。因为在端粒盘和有丝分裂之间没有其他过渡状态，所以我们得出结论，端粒盘是G2晚期假定的3D端粒组织。因此，它也是间期核的最后阶段，允许遗传物质在进入M期和染色体分离之前进行组织。具有端粒盘的G2晚期细胞具有其他特征：i）它们的总核体积比G1期或S期细胞大（荧光激活细胞分选仪[FACS]分析也证实了这种尺寸的增加）；和ii）它们开始显示染色质早期重新组织成部分浓缩区域的迹象（如使用DAPI染色的图像所示）。

在M期结束时，我们观察到进入端粒G1构象的细胞，端粒在较小的细胞核中有广泛的空间分布。

总之，这些数据表明，端粒盘是G2晚期间期核内的一种新结构，这是以前没有描述过的。它的存在表明了G2末期有序核组织的根本重要性。端粒盘可能保证了有丝分裂前染色体的正确组织和有丝分裂期间染色体的有序分离。连同先前发表的关于端粒动力学的信息[26,28]人们很容易推测，端粒在G2期间积极参与染色体组织形成独特结构的过程，即端粒盘。端粒和染色体的这种排列将有助于在细胞分裂期间将染色体正确组织成赤道平面。这一过程可能由端粒本身（不含核基质）或通过核基质驱动。端粒盘也可能允许G2晚期检查点。

还可以进行有关该主题的进一步工作体内如Molenaar所示等。[26]. 以这种方式可以观察到整个动态过程，这是对我们工作中显示的单个时间点的补充。

我们继续观察端粒在癌细胞中的分布。从正常细胞核、Burkitt淋巴瘤细胞系（Raji）、原发性小鼠浆细胞瘤（PCT）和原发性人类头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）IV期构建的典型3D图像（图。​（图7），7)显示端粒形成聚集体，从而部分改变端粒盘。与正常的非重叠和非聚集的端粒聚集体相比，这种端粒聚合体具有更大的体积和更大的整合强度。在正常细胞中未观察到。在人类神经母细胞瘤和结肠癌细胞系中也发现了端粒组织改变的类似结果。

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图7

正常：正常血细胞；RAJI：伯基特淋巴瘤细胞系；PCT：小鼠原代浆细胞瘤细胞；HNSCC：一种原发性人类头颈部鳞状细胞癌（IV期）。与正常细胞相比，癌细胞中端粒的分布。图像如图5所示。端粒聚集形成，G2期出现的端粒盘扭曲。

根据这些概念，致癌激活重塑了这个核秩序，并为基因组不稳定奠定了基础，正如我们最近测量的条件c-Myc放松调控。我们发现，c-Myc的放松调控表达改变了染色体和端粒的三维核组织，并使基因组重排在拓扑上可行（Chuang等。，准备中）。

结论

总之，我们已经表明，3D光学成像以及对间期端粒的分析是基础研究和癌症生物学的重要工具。我们发现细胞核中端粒组织的细胞周期依赖性，在G2晚期，端粒排列成端粒盘。这种组织以前从未有过报道。

在肿瘤细胞中发现端粒聚集体，因此可以看到端粒盘的改变。短暂的端粒聚集可能导致不可逆的染色体重排。

上述发现表明，现在可以在不需要检查中期的情况下，检查单个间期细胞核和组织中是否存在暗示基因组不稳定的端粒聚集物。这种监测基因组不稳定性的新方向可能会对癌症生物学、遗传学、诊断创新和医学治疗反应监测产生潜在影响。

方法

作者的贡献

TCYC进行了数据分析，撰写了讨论，进行了杂交，采集了手术期间收集的所有头颈部癌症样本，准备了冰冻切片、杂交、分析和患者记录。SMo在访问SM实验室时进行了一些杂交和分析。YG开发了3D分析方法、3D算法和分析细胞核的程序，以其当前版本撰写了论文，并担任通讯作者。AYCC整理了数据、表格和G2阶段数据。ITY、BV和RD参与了3D分析方法和算法以及分析核的程序的开发。VM在法国和SM实验室进行了BrdU标记实验和G2研究。MP在SM实验室进行G2分析。MB进行中期端粒FISH。PDK负责指导头颈部手术计划，并提供了一些用于研究的样本。TF在法国监管VM和MP。PB在海德堡监督SMo。SM计划并执行在SM实验室执行的项目，并担任TCYC、SMo（访问SM实验室时）、AYCC、MB、MP和VM的主管，并执行了部分实验。

致谢

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