在pH5.0介导的融合之前，病毒核心蛋白的轻度酸化会导致更有效的脱膜。（A） IAV在预酸化和酸诱导的PM融合后脱膜。病毒在37°C的DMEM缓冲液中预处理1小时，缓冲液pH调节为7.4和5.8。中和后的病毒与冰上的A549细胞结合，并按照酸-旁路感染试验所述诱导融合。融合后，在含有CHX的终止培养基中培养细胞5分钟（M1）和30分钟（NP），固定细胞，并通过间接免疫荧光分别对M1和NP进行染色。（右）代表性图像。DRAQ5染色显示细胞核。（左）M1和NP暴露，作为病毒脱膜的测量，通过测量每个细胞的总荧光来确定，并用ImageJ进行量化。棒材，20μm。（B） 预酸化病毒酸旁路时M1和NP的检测。如面板A图例所述，病毒在A549细胞的PM处进行预处理和融合。在含有CHX的终止培养基中培养5分钟后，固定细胞并对其进行M1和NP染色。白色箭头，无M1 NP-染色。棒材，10μm。（C） 在100μM M2抑制剂金刚烷胺存在下，WSN（wt）和金刚烷烷胺敏感WSN（AS）的酸旁路感染。有关构建重组WSN（AS）的详细信息，请参见材料和方法。（D） 在金刚烷胺存在下对WSN（wt）和WSN（AS）进行预酸化。病毒在RT下用金刚烷胺预处理5分钟，然后在37°C下在pH 6.2下预酸化10分钟。在与X31相同的条件下进行酸旁路感染。（E） 存在CCCP时X31的酸旁路。如右图所示，IAV要么未经处理（条件1），要么在37°C（条件2）下在pH 5.8下预酸化1小时，要么在RT（条件3）下用CCCP处理5分钟，或者预酸化与CCCP处理相结合（条件4）。样本接受了A549细胞的酸-旁路感染试验或正常感染，如面板A的图例所述。CCCP在2分钟融合步骤中进一步出现，但不包括在随后的停止和感染培养基中培养。（F） 在存在CCCP的情况下，在PM处酸诱导熔融后，IAV脱涂层。按照图例所述，使用CCCP和酸旁路进行预培养酸旁路后固定细胞5分钟（M1）和30分钟（NP），并进行间接免疫荧光。图中显示了具有代表性的DRAQ5核染色图像（左）和量化图像（右）。按照面板A的图例中所述对样品进行分析。棒材，20μm。（G） 在存在CCCP和金刚烷胺的情况下对WSN（AS）进行酸旁路。如左图所示，IAV要么未经治疗（条件1），要么在RT时用金刚烷胺（条件2）或CCCP（条件3）预处理5分钟。当两种药物联合使用时（条件4），首先用金刚烷胺处理病毒5分钟以阻断M2通道，然后将CCCP添加到溶液中，并将混合物进一步孵育5分钟。在融合步骤中存在药物，但不包括随后在停止培养基中孵育的药物。在与X31相同的条件下进行酸-旁路感染试验。
