酸性诱导IAV在A549细胞PM处融合。（A） 酸-旁路感染检测的示意图概述。病毒在冰上与A549细胞结合，然后在37°C下进行2分钟pH 5.0脉冲。在37°C的感染培养基中，将酸-旁路对照样品培养2分钟。酸旁路后，将细胞在37°C的停止培养基中培养14小时，以阻止内体酸化，从而阻止病毒通过内吞作用进一步进入。（B） A549细胞PM处X31融合的薄片电镜观察。病毒与冰上的细胞结合，直接固定（左侧）或在37°C（中部和右侧）的融合培养基（pH 5.0）中培养60至90 s，然后固定。融合过程中可以捕获具有紧凑核心元素（红色星号）的病毒。病毒糖蛋白在PM（黑色箭头）的外侧清晰可见。条形，100 nm。（C） 荧光光谱监测酸暴露后R18-标记X31与A549细胞表面的融合动力学。将标记的病毒与冰上的细胞结合后，将样品转移到37°C，然后通过将pH值降低到指示值来启动融合。随着时间的推移，测量R18的荧光去猝灭，并通过添加0.1%（最终浓度）的Triton X-100终止反应，从而释放出最大的去猝灭能力。显示的R18去猝灭百分比归一化为0.1%Triton X-100存在下测得的荧光。最大值，最大值。（D） 通过内吞作用比较RNA病毒的酸通道感染和正常感染。按照A组图例所述进行酸-旁路方案。在正常感染的情况下，病毒与A549细胞结合，清洗，并在感染培养基中持续培养，直至固定。IAV和UUKV通过免疫染色进行评分，检测新合成的病毒核蛋白。在GFP表达的基础上检测SFV和VSV感染。感染细胞的百分比被归一化为正常感染的数值。（E） 酸-旁路感染前预处理示意图（上图）。将X31在37°C的DMEM缓冲液中预处理1小时，并将其调节至指定的pH值。在冰上结合1小时后，执行面板A图例中所述的正常酸旁路协议（红线，初级年轴）。体外在单独的实验中测试HA酸化和融合能力的pH值（蓝线；二级年轴）。使用仅针对酸性HA（蓝线，开圈）的构象特异性抗体（A1）评估HA酸化。通过应用基于FACS的融合分析（蓝线，闭合圈）确定融合能力。（F） 酸-旁路感染前的预处理动力学。病毒在DMEM缓冲液中预处理指定的潜伏期，并在37°C下调整到指定的pH值，然后进行酸-旁路感染，如面板E的图例所述。（G）酸-旁路传染前WSN（wt）的预酸化。WSN（wt）在37°C下用指定的基于DMEM的pH缓冲液预处理10分钟，然后按照X31所述执行酸旁路和感染评分方案。
