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Ann Neurol公司。作者手稿；PMC 2015年12月1日提供。
以最终编辑形式发布为：
Ann Neurol公司。2014年12月；76(6): 845–861.
2014年9月26日在线发布。 数字对象标识：10.1002/ana.24271
预防性维修识别码：项目经理4245362
NIHMSID公司：NIHMS628368号
PMID：25204284

衰老大脑中血管旁清除通路受损

本杰明·克雷斯,1,* 杰弗里·伊里夫,1,2,三，* 茂盛夏,1,4 王明欢,1 海伦·魏,1 道格拉斯·齐彭菲尔德,2 谢露露,1 弘毅康,1 徐启武,1 杰森·刘,1 本杰明·普洛格,1 冯菲丁,1,2 拉希德·迪恩,1和梅肯·内德加德1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

目的

在大脑中，蛋白质废物的清除部分是通过血管旁通路进行的，这些通路促进了脑脊液和间质液之间的水和可溶性物质的对流交换。几条证据表明，通过淋巴系统的大量引流是由脑血管搏动驱动的，并且依赖于血管旁脑脊液（CSF）通路中的星形胶质水通道。本研究的目的是评估老化大脑中CSF-ISF交换和间质溶质清除的效率是否受损。

方法

通过体内和体外荧光显微镜评估CSF-ISF交换，同时通过放射示踪清除试验评估年轻（2-3个月）、中年（10-12个月）和老年（18-20个月）野生型小鼠的间质溶质清除。通过免疫荧光法评估星形细胞水通道水通道蛋白-4（AQP4）表达的年龄相关性变化与glymphatic通路功能变化之间的关系。

结果

年龄增长与蛛网膜下腔CSF和脑实质之间的交换效率显著下降有关。相对于年轻小鼠，老年小鼠腹腔注射淀粉样β的清除率受损40%。皮质内小动脉血管壁搏动性降低27%，穿透动脉血管周围AQP4极化广泛丧失，伴随着脑脊液-脑脊液交换减少。

解释

我们认为，受损的glymphatic清除导致老年人认知能力下降，可能是治疗与错误折叠蛋白聚集体积累相关的神经退行性疾病的一个新的治疗靶点。

介绍

年龄增长是许多神经退行性疾病发展的最大风险因素，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病、额颞叶痴呆和慢性创伤性脑病（CTE）。在AD的情况下，发病率从70年代的约12%增加到80年代的50%以上(1).

每种疾病的主要组织病理学特征是存在错误聚集蛋白，包括AD中由淀粉样β（Aβ）组成的老年斑，AD和CTE中由高磷酸化tau组成的神经纤维缠结，额颞叶痴呆中由高磷化tau构成的Pick小体，PD中含有α-突触核蛋白的路易小体和亨廷顿病中亨廷顿蛋白的细胞内内含物(2).

关于在这些不同条件下引发蛋白质聚集的致病事件，人们知之甚少。与年龄相关的蛋白质聚集体沉积可能是由于蛋白质的生产加快或清除速度减慢，或者是由于引入了折叠错误的模板构象物，从而导致种子聚集。在AD患者中，当测量并比较AD患者和认知正常人之间的Aβ生成和清除率时，AD患者的Aβ清除率降低，而Aβ生成率没有改变(三). 然而，损害Aβ清除率并使衰老大脑易受Aβ斑块沉积影响的细胞和分子变化尚不清楚。

我们最近定义了一个脑范围的血管旁通路网络，该网络有助于有效清除脑实质中的间质溶质，包括aβ。睡眠期间，来自脑池隔的蛛网膜下腔脑脊液（CSF）沿贯穿脑动脉周围的血管旁间隙迅速再循环至大脑，并与周围的间质液（ISF）交换(4–6). ISF和间质溶质依次沿大口径脑静脉周围的血管旁间隙清除。CSF和ISF的血管旁体积流量由星形胶质细胞水通道水通道蛋白-4（AQP4）支持，该蛋白定位于包裹大脑血管的血管周围星形细胞终末。基因缺失问题4间质溶质清除率明显受损，包括外源性Aβ清除率降低65%(4).由于其依赖于星形胶质细胞水转运，并假设中枢神经系统内间质溶质清除的外周淋巴功能，我们将此途径称为“glymphatic”系统。

在本研究中，我们评估了衰老大脑中的glymphatic通路功能，包括间质溶质（如Aβ）的清除是否受损。通过活体内双光子和活体外荧光成像评估血管旁脑脊液通过脑实质的再循环，通过放射示踪清除试验评估间质溶质的清除，我们报告说，老化大脑中的glymphatic通路功能显著受损。

方法

动物

本研究中描述的所有实验均由罗切斯特大学医学中心动物资源委员会批准。除非另有说明，否则在所有实验中均使用从Charles River和美国国家老龄化研究所获得的2-3个月、8-10个月和18个月大的雄性和雌性C57BL/6小鼠。在所有实验中，用氯胺酮（0.12 mg/g腹腔注射）和甲苯噻嗪（0.01 mg/g腹腔内注射）联合麻醉动物。

荧光脑脊液示踪剂

所有脑脊液示踪剂均在0.5%浓度的人工脑脊液中重建。对于联合输注实验，将小分子量德克萨斯红共轭葡聚糖（TR-d3；3 kDa）和大分子量Alexa 647共轭卵清蛋白（OA-647；45 kDa。所有荧光脑脊液示踪剂均来自Invitrogen。

池内示踪剂输注

将小鼠麻醉并固定在立体定向框架内，同时手术暴露枕大池上的寰枕后膜。在所有脑脊液示踪剂实验中，通过大池穿刺将示踪剂注入蛛网膜下腔脑脊液，以2µL/min的速度通过30 GA注射泵（哈佛仪器）持续5分钟（总体积10µL）。在以前的研究中，我们发现这种示踪剂输注的速度和持续时间不会导致蛛网膜下腔脑脊液回流到脑脊液室，这表明脑脊液大流量的生理方向保持不变(4,6,7). 我们观察到脑干内脑脊液示踪剂输注轻度增加颅内压（ICP），但这些影响仅在示踪剂灌注期间持续存在，停止输注后颅内压迅速恢复正常(7). 此外，我们观察到，在不改变ICP的输注速度下，血管旁脑脊液示踪剂流量遵循本研究中观察到的相同模式(5,8). 由于停止输注示踪剂后，颅内压正常化后很长时间内就会发生血管旁脑脊液再循环，因此本研究中观察到的脑脊液示踪剂流量似乎代表了在输注5分钟示踪剂之后，脑脊液沿血管旁间隙的生理运动。为了观察荧光脑脊液示踪剂在体外穿透脑实质的情况，麻醉动物在开始输液后30分钟用4%多聚甲醛（PFA）经心灌注固定，先前确定的一个时间点对应于年轻雄性C57BL/6小鼠中类似分子量化合物的强劲示踪剂渗透(4). 然后解剖大脑并在4%PFA中固定24小时，然后使用振动切片机将其切成100µm冠状切片，并使用PROLONG防褪色金和DAPI（Invitrogen）进行安装。在离体研究中，通过常规荧光显微镜和共焦激光扫描显微镜观察到示踪剂沿血管周围间隙的运动和脑实质的渗透。

荧光脑脊液示踪剂的体外成像

如前所述，通过100µm振动冠状脑切片的常规荧光显微镜观察到沿着血管周围通路的示踪剂再循环并穿透脑实质(4). 简而言之，一名盲法研究人员使用奥林巴斯荧光显微镜在4倍客观功率下对每只动物的8个脑切片进行成像和分析，以生成全切片蒙太奇（使用Microblucida软件的虚拟切片模块MicroBrightfeild）。

如前所述，使用NIH Image J软件对示踪剂渗透进行量化(4). 简单地说，将每个切片的荧光通道分开，分别测量共注入的大分子量和小分子量德克萨斯红共轭葡聚糖（Dex-3；3kDa）和Alexa 647-共轭卵清蛋白（OA-45；45KDa）的荧光。使用NIH Image J ROI管理器定义大脑感兴趣的区域，包括整个切片、大脑背皮层、大脑外侧皮层、大脑腹皮层、尾状壳核（纹状体）、外侧隔核、海马、胼胝体、丘脑和下丘脑。如前所述，通过均匀地对每个荧光通道进行阈值化，并将阈值化面积作为整个区域面积的%来测量每个区域内的荧光示踪剂覆盖率(4). 取每只动物8个脑切片的荧光面积平均值，以确定单个生物复制中的脑脊液渗透。使用单因素方差分析和Tukey的事后检验，独立评估年龄对每个示踪剂的大小分子量脑脊液示踪剂穿透的影响，以确定年龄组之间的差异。通过将年轻、中年和老年组的小分子量和大分子量示踪剂荧光强度归一化为每种示踪剂的幼畜荧光强度，绘制出脑脊液示踪剂穿透的相对变化。采用双向方差分析和Sidak事后检验评估脑脊液示踪剂穿透率下降速度的大小依赖性差异，以确定幼年动物下降速度的个体差异

组织内放射示踪剂注射

由于使用放射性碘标记Aβ和非放射性标记Aβ（ELISA）从大脑中清除Aβ没有显著差异(9)，在这些研究中使用了碘化Aβ。简单地说，将不锈钢引导套管立体定位植入麻醉小鼠的右尾状核，套管尖端坐标为前角0.7毫米和侧角3毫米，大脑表面下方1.3毫米。允许动物从麻醉中苏醒，并在引导套管植入后10–18小时进行实验，根据组织的组织学分析（反应性星形胶质细胞、GFAP和反应性小胶质细胞、抗磷酸酪氨酸的阴性染色）评估，引导套管植入是实质性炎症过程开始之前的一个时间点，但据报道，这为大分子的BBB修复留出了时间(10,11).

用于注入示踪剂混合物，含有125I标记的试验示踪剂Aβ（10 nM单体）以及14将C-菊糖（0.05µCi；参考分子）微量注入大脑ISF超过5分钟。实验结束时，取下大脑，准备进行放射性分析和TCA分析。我们早期与125I标记的Aβ证明放射性标记的A1–40在30–300分钟内保持大脑ISF的主要完整性（>95%）体内间隙研究。

对于放射性分析，125I放射性在γ计数器（Wallac Vizardγ计数器，Perkin Elmer）中测定。对于14C-计数，将样品溶解在0.5 ml组织增溶剂（Perkin Elmer）中过夜，然后添加5 ml闪烁鸡尾酒（Packard Ultima Gold），并在液体闪烁计数器（Beckman Coulter计数器）中进行分析。区分源于14C和125一、 测量放射性的计数窗口被设置为取消125I溢出，而样本包含125I-Aβ1–40在每次实验的同时测量与注射液中的当量，以监测125I放射性进入14C计数窗口。

所有间隙参数的计算均按照之前的报告进行(4,6,10). 简单地说，微量注射后大脑中剩余放射性的百分比被确定为大脑中的回收率=100×（Nb条/N个我)（等式1），其中，Nb条是实验结束时大脑中残留的放射性物质，N我是注入大脑的放射性ISF，即14可沉淀TCA的C-菊糖和C.p.m125I-放射性。菊糖被用作一种代谢惰性极性分子，既不通过BBB运输，也不被大脑保留。间隙百分比125I-Aβ或14C-菊糖从总量中计算得出，即100-大脑恢复）。中的年龄差异125I-Aβ或14C-菊糖清除率通过单因素方差分析和Tukey的事后检验进行多重比较。

体内双光子荧光成像

如前所述，使用定制的2光子激光扫描（Olympus）显微镜，通过关闭的颅骨窗口观察示踪剂穿透完整的活体大脑的情况(4). 用小型动物呼吸机（CWE）对动物进行麻醉、插管和通气，同时监测血气和pH值，体温保持在生理参数（~100次呼吸/min，潮气量0.3–0.4 ml，pO2=80–150mmHg，pH值7.25–7.5，体温37°C）。在大脑皮层上进行单侧开颅术（直径3mm），外侧1mm，后角0.5mm。注意确保硬脑膜没有破裂。开颅术后立即用脑脊液覆盖硬脑膜，开颅术用玻璃盖玻片密封。然后对股动脉进行插管，以监测平均动脉血压和测量动脉血气值。本研究仅包括血气在生理范围内的小鼠。为了观察血管系统，在成像前立即动脉内注射0.1ml血脑屏障不可渗透的德克萨斯红葡聚糖70（MW 70kD；1%生理盐水，Invitrogen）。

如前所述，使用连接到共焦扫描系统（Fluoview 300，奥林巴斯）和直立显微镜（IX51W，奥林匹斯）的Mai Tai激光器（光谱物理）进行体内成像(4). 使用20X（0.9NA）水浸透镜对皮层进行成像，从表面到约250µm的深度。FITC和德克萨斯红的激发波长为870nm。FITC和得克萨斯红的发射波长为575-645nm。首先用512×512像素帧对大脑血管系统进行成像，从表面到240µm深度，采用5µm z步进。脑干内注射脑脊液示踪剂后，通过双通道（FITC和Texas Red）512×512像素图像采集进行示踪剂向皮层的移动。在实验期间，每隔1分钟用20µm z步长从表面到表面以下240µm重复扫描皮层。使用ImageJ软件（NIH）和UCSD插件集进行图像分析。成像后，根据形态将穿透性小动脉与穿透性小静脉区分开来：表面动脉从浅层穿过表面静脉，在皮质浅层深度分支较少。选择皮质表面下方100–120µm的成像平面，用于分析脑干内示踪剂的穿透。为了确定示踪剂进入血管旁脑组织的运动，定义了外径为150像素、内径为50像素的圆环状ROI（因此不包括血管）。这些都集中在穿透的小动脉上。在每个时间点测量这些ROI内的平均像素强度。对每只动物在每个时间点的动脉旁ROI分别进行平均，以产生单个生物复制的值。当比较示踪剂沿穿透小动脉的运动时，使用双向重复测量方差分析，然后使用Sidak检验进行多重比较。

脑血管搏动性的测量

如前所述，通过活体双光子显微镜评估脑血管搏动性(7). 测量血管直径，3000 msX–T对表面动脉、表面静脉、穿透动脉和穿透静脉进行与血管轴正交的线扫描(图3B). 在皮质表面以下50–150µm处进行穿透血管线扫描。血管直径提取自X–T绘图(图3C)并使用自定义Matlab和ImageJ软件绘制时间。稳态血管直径计算为3000 ms历元的平均值。血管壁脉动性（导出单位µm*s）计算为直径-时间曲线下面积的绝对值，与3000 ms历元的运行平均值相结合。使用Tukey的单因素方差分析评估不同血管类型之间的血管搏动性差异事后（post-hoc）评估血管段之间差异的测试。采用双向方差分析（ANOVA）和Tukey's事后（post-hoc）多重比较测试。

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衰老大脑贯穿动脉的血管搏动受到抑制

动脉内注射得克萨斯红结合右旋糖酐（MW 70kD，dex-70）后，通过薄型颅骨窗，通过活体双光子显微镜评估血管壁的搏动性。（A）通过颅窗可见的脑血管树的3D重建显示了穿透动脉（红色）、上行静脉（蓝色）和介入毛细血管床（灰色）。（B）在皮层表面下方z=0至150µm之间，在表面和穿透动脉、表面和上行静脉生成高频正交线扫描。（C）对具有代表性的原始x-t扫描进行阈值化，以提高边缘检测，并随时间测量管腔直径。（D-E）通过穿透动脉和上升静脉测量血管搏动。在年轻的大脑中，动脉搏动性明显大于静脉搏动性（*P<0.05，双向方差分析；每组4只动物的n=8-20条血管）。在老年大脑中，与年轻大脑相比，穿透动脉中的动脉搏动性显著降低（*P<0.05，年轻与老年）。未观察到静脉搏动的年龄相关差异。

四甲基铵（TMA）微离子导入法测定细胞外体积

所有实验程序均改编自之前的研究(6,12). 单管离子导入微电极（尖端直径2–3µm）含有150 mM四甲基氯化铵（TMA）和10µm Alexa 488。双通道微电极前置放大器施加20nA、40nA和80nA的一系列电流。为了测量TMA，使用基于四苯硼的离子交换器，用双筒θ玻璃制作外径为2–3µm的微电极。用150 mM TMA氯化物回填TMA桶，而参考桶中含有150 mM NaCl和10µM Alexa 568。所有记录都是通过将两个电极插入皮层表面以下150µm的深度获得的。记录电极分别插入前缘外侧2.5 mm和后方2 mm处。插入后使用双光子激发对电极尖端进行成像，以确定电极之间的准确距离（通常约150µm）。TMA信号是通过使用双通道微电极前置放大器从离子检测桶测得的电压中减去参考桶测得电压来计算的。根据在150 mM NaCl中含有0.5、1、2、4和8 mM TMA-氯化物的电极中获得的测量值，使用Nikolsky方程校准TMA电极。TMA测量是相对于从含有0.5 mM TMA和150 mM NaCl的溶液中制备的0.3%琼脂糖中获得的类似记录进行的。使用C.Nicholson开发的定制MatLab软件“Walter”计算α和λ值(6,12). 采用双向方差分析和Sidak的多重比较检验评估细胞外体积分数和扭曲度的差异。

评估区域脑脊液示踪剂穿透、AQP4和GFAP免疫荧光

对100µm固定冠状脑切片进行自由浮动免疫荧光染色，以评估水通道蛋白4（AQP4）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的蛋白表达模式。切片在室温下用3%的正常驴血清封闭1小时，与一抗（兔抗AQP41，1:500；小鼠抗GFAP，1:500，均来自Millipore），并再次与第二抗体（Cy3缀合的驴抗小鼠抗体；Cy2缀合的驴抗兔抗体；均为1:500；Jackson Immunoresearch）在室温下孵育2小时。

在脑池内注射卵清蛋白结合的ALEXA 647，然后在注射30分钟后灌注固定的动物切片中，局部评估GFAP和AQP4的表达。通过这种方法，可以在测量脑脊液示踪剂穿透的相同动物和大脑区域评估GFAP和AQP4免疫荧光。从每只动物的一个大脑前片和一个大脑后片，在4倍放大的情况下生成3通道全片蒙太奇。如上文所述，分离荧光通道，评估脑脊液示踪剂在每个脑区的穿透情况。如前所述，对区域GFAP表达、AQP4表达和AQP4-极化进行类似评估(13,14). 为了测量区域GFAP表达，对区域进行均匀阈值分割，并测量GFAP免疫活性的区域覆盖率（作为整个区域面积的%）。为了评估全球AQP4表达水平，测量每个区域内的平均AQP4-免疫荧光强度。为了测量血管周围AQP4极化，测量血管周围区域的免疫荧光强度中值。然后进行阈值分析，测量显示AQP4免疫荧光大于或等于血管周围AQP4-自身荧光的区域的百分比（AQP4%面积）极化”表示为显示的区域的百分比降低AQP4免疫反应性高于血管周端足（“极化”=100–AQP4%面积）。因此，AQP4“极化”是AQP4-定位的一个相对测量值：极化增加表明血管周围AQP4-i免疫活性相对较低的实质AQP4-I免疫活性较高，而极化减少表示血管周围AQD4-i免疫活性相对较高的实质AQD4-I免疫活性较低。通过双向重复测量ANOVA和Sidak检验评估区域GFAP表达、AQP4表达、AQD4极化和CSF示踪剂穿透的差异，以进行多重比较。

评估AQP4和GFAP在血管周围终末和神经胶质界限的定位

除CSF示踪剂穿透外，GFAP和AQP4的表达还通过20倍客观功率的激光扫描共聚焦显微镜进一步评估，以生成大脑外侧皮质软脑膜表面和脑血管的三通道荧光图像。这些是通过40–60µm Z堆叠（2µm Z-步进）获得的。为了评估脑血管周围的免疫标记，产生25×500像素的矩形ROS，其从血管壁延伸到与血管轴正交的周围脑组织。在该ROI的窄轴上对像素强度进行平均，以生成每个血管从血管壁延伸到周围脑组织的荧光的单一线性图(图5A-B). 此外，对每条血管的血管周围末梢（紧邻血管的区域）内的免疫荧光进行评估。通过这种方法，评估穿透脑小动脉和脑实质内毛细血管周围组织中GFAP和AQP4的免疫活性。通过双向重复测量ANOVA评估从脑血管向外延伸的ROI中AQP4和GFAP免疫荧光的差异。通过非配对t检验比较血管周围AQP4-和GFAP-免疫荧光的差异。

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衰老的大脑中穿透动脉周围的血管周围AQP4极化消失

免疫荧光双标记法检测AQP4定位、GFAP表达和血管旁脑脊液再循环的变化。（A-B）脑干内注射荧光脑脊液示踪剂卵清蛋白结合的ALEXA-647（分子量45kD，OA-45）30分钟后固定的大脑切片通过共焦显微镜成像，显示与年轻皮层相比（A），AQP4在老年大脑中的定位变得更加分散，而GFAP表达增加，CSF示踪剂渗透减慢（B）在穿过脑小动脉（箭头、，C、 F类)或从脑毛细血管向外（箭头，D、 G公司).（C-D、F-G）与年轻大脑相比，衰老大脑血管周围的GFAP表达增加（***P<0.001，年轻与老年；重复测量双向方差分析；每组4只动物的11–18条血管）。穿透小动脉周围AQP4表达的变化较大（C）比皮质毛细血管（B）穿透血管周围组织中AQP4显著上调。血管周围AQP4的测量（E）和GFAP（H）表达表明，AQP4在穿透小动脉周围的血管周围区域下调，但在毛细血管周围不下调（*P<0.05；未配对t检验，每组4只动物的11–18条血管），而血管周围GFAP在两种血管类型周围的表达同样上调（***P<0.001；未配对t-检验）。

为了研究大脑软脑膜表面的免疫标记，以同样的方式产生了从大脑表面向内延伸的线性ROI(图9C)绘制与皮质表面相关的GFAP和AQP4免疫活性，并在切片和动物之间取平均值。同样，通过分析与注射的卵清蛋白结合的ALEXA-647对应的荧光的ROI值，评估脑脊液示踪剂在软脑膜表面的渗透性。通过双向重复测量方差分析评估从皮质表面向内延伸的ROI中AQP4和GFAP免疫荧光和CSF示踪荧光强度的差异。

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软脑膜表面AQP4表达增加与经软脑膜脑脊液渗透受损相关

在年轻人的外侧大脑皮层中评估了顶下AQP4和GFAP表达的变化与跨顶脑脊液示踪剂穿透之间的关系（A）和旧的（B）老鼠。（C）在从软脑膜表面向内延伸的线性感兴趣区域（白色虚线）中评估AQP4和GFAP的表达以及CSF示踪剂强度。（D）与年轻大脑相比，老化大脑中软脑膜表面附近的AQP4表达显著增加（**P<0.01，年轻与老年；双向重复测量方差分析，每组6–8个），而GFAP免疫反应性没有显著改变。老化大脑中软脑膜下AQP4表达增加与经皮脑脊液示踪剂穿透显著降低相关（**P<0.01，年轻与老年；双向重复测量方差分析，每组6–8）。

结果

衰老大脑中的消化道功能受损

我们首先评估了衰老大脑中的glymphatic通路功能是否受损。在这些实验中，使用年轻（2-3个月）、中年（10-12个月）和老年（18个月）雄性C57Bl/6小鼠。为了评估血管旁脑脊液对脑实质的渗透，将2种荧光脑脊液示踪剂（小分子量Texas Red-conjugated dextran，MW 3 kD，Dex-3；大分子量卵清蛋白结合ALEXA 647，MW 45 kD，OA-45）缓慢共同注入大池蛛网膜下腔脑脊液(图1A). CSF示踪剂输注开始30分钟后，对动物进行灌注固定，对大脑进行切片，并通过全切片2通道荧光成像评估示踪剂渗透。与年轻小鼠相比，脑脊液示踪剂对中老年小鼠大脑的渗透性均显著降低，对老年小鼠的影响最大(图1B，*P<0.05，***P<0.001；采用Tukey事后检验进行多重比较的单因素方差分析；n=每组5-8只动物）。中显示的代表性图像图1C证明在中年人和老年人的大脑中，脑脊液示踪剂沿血管旁通路和穿过软脑膜表面的渗透性都显著降低。

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血管旁淋巴液脑脊液再循环和间质溶质流出的年龄依赖性下降

（A）将小分子量（Texas Red缀合的右旋糖酐，3 kD；Dex-3）和大分子量示踪剂（卵清蛋白缀合的ALEXA-647，45 kD；OA-45）在幼年（2-3个月）、中年（10-12个月）和老年（18个月）小鼠的脑内注射。（B）注射后30min，对动物进行灌注固定，并评估全片荧光。与年轻大脑相比，老年大脑的脑脊液示踪剂穿透率显著降低，而中年大脑的值处于中等水平（*P<0.05，***P<0.001；单向方差分析；每组n=5-8）。（C）典型图像显示，与年轻大脑相比，脑脊液示踪剂进入中老年大脑的速度明显减慢。（D）无线电标记125I-淀粉样β1–40和14将C-菊粉联合注射到年轻、中年和老年小鼠的尾状核内。注射后60min，通过γ计数和液体闪烁计数评估溶质清除率。（E）与年轻大脑的清除率相比，125I-淀粉样β1–40和14月龄大脑中的C-菊粉清除率显著受损（***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，单因素方差分析；每组n=6-11）。125I-淀粉样β1–40和14中年大脑中的C-菊粉清除率介于年轻大脑和老年大脑之间。

为了评估衰老大脑中间质溶质清除是否受损，我们测量了实质内注射放射性示踪剂的清除率。无线电标签125I-淀粉样β1–40和14将C-菊粉（MW~5kD）共同注入尾状核，60分钟后，分别通过γ计数和液体闪烁计数测量两种放射性示踪剂的清除率(图1D). 清理14C-Inulin，不能通过血脑屏障（BBB）清除，因此只能通过大流量清除(15)中老年小鼠的大脑都明显受损(图1E，*P<0.05，**P<0.01；采用Tukey事后检验进行多重比较的单因素方差分析；n=每组6–11人）。清理125I-淀粉样β1–40，这取决于受体介导的跨BBB清除(15)以及AQP4相关的体积流量(4,14)中老年人的大脑也同样受损(图1E，***P<0.001，采用Tukey事后检验进行多重比较的单因素方差分析；n=每组6–11人）。

脑干内注射荧光脑脊液示踪剂（FITC-共轭葡聚糖，分子量40kD；Dex-40；图2A). 动脉注射得克萨斯红结合右旋糖酐（分子量70kD，Dex-70）后，通过闭合的颅骨窗口观察脑血管，并从形态学上识别穿透的动脉和静脉。当荧光脑脊液示踪剂穿透幼年大脑皮层表面100µm以下时，脑脊液跟踪剂在注射后5分钟内开始快速积累，注射后约50分钟达到峰值(图2B). 与年轻大脑相比，中年大脑的脑脊液示踪剂穿透明显延迟(图2B; *P<0.05，采用Sidak多重比较检验的双向重复测量方差分析；n=每组4只动物）。从年轻人的典型延时图像中可以清楚地看到，血管旁脑脊液再循环的速度减慢，首先是沿着大脑表面血管系统，然后是沿着大脑穿透小动脉，最后进入周围的间质(图2C)和中年人(图2D)皮质表面水平和皮质表面以下100µm的动物。

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体内2光子成像显示衰老小鼠血管旁淋巴结CSF再循环受到抑制

（A）脑池内注射FITC-共轭葡聚糖（40 kD，Dex-40）后，通过活体双光子显微镜评估血管旁脑脊液示踪剂对小鼠皮层的渗透。（B）大脑皮层表面以下100µm处脑脊液示踪剂穿透的定量显示，与年轻大脑皮层相比，中年人的血管旁穿透受损（*P<0.05，双向重复测量方差分析；每组4只动物）。（C-D）脑池内注射Dex-40后，在皮层表面和皮层表面以下100µm处进行连续体内双光子成像。通过动脉注射德克萨斯红结合右旋糖酐（70kD，Dex-70，蓝色），可以观察到脑血管；表面动脉（箭头）和静脉（箭头）是从形态学上定义的。与年轻的大脑相比（C），脑脊液示踪剂沿表面和穿透动脉以及进入周围间质的运动在中年大脑中明显减慢（D）.

衰老的大脑中大脑动脉搏动受损

脑脊液沿血管旁通路再循环至脑实质的部分原因是动脉搏动(5–7,13,16,17). 接下来，我们通过活体双光子显微镜评估脑血管壁的脉动。通过动脉内注射德克萨斯红结合右旋糖酐（70kD），通过薄的颅骨窗制剂观察大脑血管系统(图3A). 通过对穿透动脉和皮质表面以下0–150µm的上行静脉进行高频线扫描，测量血管直径的微小变化。正如我们最近描述的那样(7)，从X-t（直径时间）图中提取“血管搏动性”值(图3B-C)从每一个心动周期的血管直径扩张中导出，并在3000毫秒时积分。与我们之前的调查结果一致(7)，我们观察到，在年轻的大脑中，穿透动脉的血管壁搏动明显大于上升静脉的搏动(图3D; *穿透动脉与上行静脉的比较P<0.05；采用Tukey事后检验进行多重比较的双向方差分析；n=8–20只血管，每组4只动物）。当评估老年（18个月）大脑皮层的血管搏动性时，我们观察到，与年轻大脑皮层相比，深穿透动脉的搏动性显著降低(图3D; *年轻人与老年人相比P<0.05；采用Tukey事后检验进行多重比较的双向方差分析；n=8–20只血管，每组4只动物）。与穿透动脉相比，上升静脉中的血管搏动没有年龄相关性变化(图3E). 这些数据表明，与年龄相关的穿透性动脉搏动性降低可能是衰老大脑血管旁脑脊液再循环受损的基础。

衰老大脑中间质空间的细胞外体积调节没有改变

血管旁脑脊液-脑脊液交换是睡眠大脑的一个特征。清醒状态下，与自然睡眠或麻醉的大脑相比，血管旁脑脊液再循环率降低约95%，而从清醒大脑中清除淀粉样β等间质溶质的速度比睡眠或麻醉状态下慢2倍以上(6). 这似乎是由于睡眠期间细胞外体积增加了60%，这可能会降低组织对对流脑脊液流量的总阻力，促进液体和溶质通过大脑间质的运动(6). 因此，在本研究中，我们试图评估细胞外间隙的变化是否可以解释衰老大脑中CSF-ISF交换受损的原因。为了验证这个假设，我们使用了体内皮层TMA离子导入(6,18)测量老化大脑中细胞外空间的尺寸（细胞外体积分数，α）或特征（曲折度，λ）是否发生了改变(图4A). 在每只动物中，首先在清醒状态下测量α和λ值。然后对动物进行麻醉，并再次测量α和λ值，以生成成对清醒/麻醉记录。当测量细胞外体积分数时，我们发现在清醒和麻醉状态下，年轻和老年大脑之间没有明显差异(图4B; P=0.4957，年轻vs.老年；采用Sidak多重比较检验的双向方差分析；n=9–20每组）。然而，在年轻人和老年人的大脑中都观察到清醒状态和麻醉状态之间细胞外空间的显著扩张(图4B; ***P<0.001）。当测量细胞外扭曲度时，无论是清醒状态还是麻醉状态，年龄对lambda值都没有显著影响(图4C; P=0.3375，年轻人与老年人；采用Sidak多重比较检验的双向方差分析；n=9–20每组）。因此，衰老的大脑在麻醉状态下保持细胞外空间的扩张，这表明细胞外容量调节可能无法解释老年小鼠与年轻小鼠CSF-ISF交换的显著减少。

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间质体积不会随着年龄的增长而变化

（A）用体内TMA微电泳法测定细胞外体积分数（α）和扭曲度（λ）。TMA由离子电渗电极引入，并由第二记录电极检测。细胞外体积分数或细胞外空间扭曲度的变化反映在所测TMA浓度的动力学中（详见(18)).（B）在清醒或麻醉小鼠的皮层中，幼年和老年动物的细胞外体积分数没有显著差异。年轻人和老年人的大脑在麻醉状态下均表现出明显且可比较的细胞外间隙增大（***P<0.001，清醒与麻醉；双向方差分析；每组9–20）。（C）幼年和老年动物的细胞外扭曲度没有显著差异。

老年脑血管周围AQP4极化受损

AQP4是一种星形胶质细胞水通道，以高度极化的方式定位于大脑血管周围的末梢突起，此外还包括外胶质界限紧靠软脑膜并束缚蛛网膜下腔脑脊液室(19,20). 血管周围星形细胞末端完全包裹大脑血管系统，重叠过程之间留有20纳米的间隙(21–23). 在这些过程中，多达50%的血管膜由AQP4水通道的结晶斑块（称为“颗粒正交排列”）填充(24). 我们之前已经证明血管周围AQP4促进血管旁CSF-ISF交换(14)，并提出脑损伤后血管周围AQP4极化的丧失可能导致glymphatic通路功能受损(13,14,16). 在目前的实验中，我们评估了老化大脑中血管周围AQP4极化是否消失，以及AQP4定位的变化是否在大的穿透性小动脉周围和微血管周围的血管周围区域之间有所不同。。

图5显示年轻人血管周围GFAP和AQP4表达和定位的差异(图5A)和旧的(图5B)皮质。AQP4和GFAP免疫荧光强度沿着从穿透脑小动脉或脑毛细血管管腔向外延伸的线性ROI进行测量，年轻和老年皮层血管之间的平均值，然后绘制成与血管壁距离的函数。在年轻的皮层中，贯穿小动脉和毛细血管周围的AQP4免疫荧光高度极化，低水平表达直至血管周围终末边缘，那里的表达较高(图5C-D). 在老年皮质中，AQP4免疫荧光在穿透小动脉周围的组织中显著增加(图5C; ***P<0.001年轻人与老年人，双向重复测量方差分析；n=11-12条血管，每组4只动物），而毛细血管周围的AQP4表达普遍升高，但不如穿透小动脉周围的组织明显(图5D). 与年轻大脑相比，老年大脑穿透小动脉周围血管末梢的AQP4表达显著降低(图5E; *P<0.05；未配对t检验，每组4只动物的11–18条血管），而脑毛细血管周围血管末梢的AQP4表达无显著差异。

在相同的ROI中，穿透小动脉周围的GFAP表达也显著增高(图5F)和皮质毛细血管(图5G; *P<0.05，双向重复测量方差分析，每组4只动物的11–18条血管）。量化GFAP在血管周围终末的表达显示，贯穿小动脉和毛细血管周围的血管周围终末梢的表达显著升高(图5H; ***P<0.001，非配对t检验；n=11-18只血管，每组4只动物）。这些结果表明，弥漫反应性星形胶质细胞增生症的发展是大脑老化的一个普遍特征。相反，AQP4在衰老大脑中的表达变化更具特异性，AQP4显著上调，穿透皮质小动脉周围的脑组织中血管周围AQP-4极化消失。

接下来，我们评估了不同的大脑区域是否随着年龄的增长表现出不同的AQP4表达或定位模式，或反应性星形胶质细胞增生症。前部切片(图6A-C)和后部(图6D-F)在脑干内注射脑脊液示踪剂（OA-45）30分钟后，对年轻（2-3个月）和老年（18个月）小鼠的大脑进行AQP4和GFAP染色。用三通道全片荧光显微镜对切片进行成像，并将切片分为区域特异性ROI，以分析AQP4表达（平均AQP4-免疫荧光强度，图6A、D)、AQP4极化（血管周围和实质区域的AQP4的比例定位(13,14),图6B、E)和GFAP表达（GFAP免疫反应的覆盖率%，图6C，F). 为了显示这些值的差异，我们制作了热图，显示年轻人和老年人大脑各区域内平均AQP4表达、AQP4-极化或GFAP表达的变化。在年轻人和老年人的前后脑切片之间，每个脑区的整体AQP4表达没有显著变化(图6A、D）。相反，与年轻大脑相比，老年大脑血管周围AQP4极化持续且显著降低(图6A)和后部(图6E)大脑区域（*P<0.05，***P<0.001，Young vs.Old；双向重复使用Sidak的多重比较测试测量ANOVA；每组4只动物）。这些效应在侧皮层和腹皮层中最为一致，而在老年海马体和年轻海马体中也观察到AQP4极化的显著丧失。通过增加GFAP表达确定的反应性星形胶质细胞增生症的发展在整个衰老的大脑中同样明显(图6C、F; *年轻人与老年人相比，P<0.05，**P<0.01；采用Sidak多重比较检验的双向重复测量方差分析；n=每组4只动物）。与AQP4失配一样，与年轻大脑相比，GFAP表达最显著的升高是在老年人的侧皮层和腹皮层以及海马体中。

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血管周围AQP4极化受损在衰老大脑的外侧和腹侧皮层、海马和纹状体中最大

用免疫荧光法检测年轻（2–3个月）和老年（18个月）大脑固定脑片中AQP4的表达、极化和GFAP的表达。评估前部不同区域的表达和极化（A-C）和后部（D-F）大脑切片。区域热图显示了年轻和老年大脑之间AQP4表达（AQP4-免疫荧光）、AQP4-极化（%面积）和GFAP表达（%区域）的平均变化。(A、 D类)在前部和后部区域，年轻和老年大脑的整体AQP4免疫荧光没有差异。（B、E）老年人脑血管周围AQP4极化显著降低，最显著的影响是侧皮层、腹皮层、纹状体和海马（*P<0.05，**P<0.01，***<0.001，青年vs.老年；双向方差分析；每组4例）。（C、F）与年轻大脑相比，老年大脑中GFAP的表达显著增加，在侧皮层、腹皮层、海马和纹状体中效果最明显（*P<0.05，**P<0.01，***<0.001，young vs.old；双向方差分析；每组n=4）。

血管周围AQP4极化缺失与glymphatic通路受损相关

脑干内脑脊液示踪剂注射30分钟后评估血管旁脑脊液再循环。在测量GFAP表达、AQP4表达和血管周围AQP4-极化的同一切片中，如图7A-B在注射小分子量（Dex-3）和大分子量（OA-45）CSF示踪剂30分钟后固定的代表性矢状面和冠状面切片显示，与年轻大脑相比，老年大脑的血管旁CSF穿透显著减少。OA-45在前脑和后脑区之间穿透的定量研究(图7C、D)结果表明，与年龄相关的脑脊液循环障碍主要局限于大脑皮层，外侧和腹侧皮层下降最明显，尤其是后脑区(图7C、D，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001，青年vs.老年；采用Sidak多重比较检验的双向重复测量方差分析；n=每组4只动物）。

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在老年大脑中，腹侧皮层对glymphatic通路活性的抑制最为严重

在脑干内注射小分子量脑脊液示踪剂德克萨斯红结合右旋糖酐（MW 3kD，Dex-3）和大分子量卵清蛋白结合ALEXA 647（MW 45kD，OA-45）30min后，评估血管旁脑脊液再循环的年龄相关损害。年轻人的典型矢状和冠状切片（A）和旧的（B）与年轻大脑相比，整个老年大脑的脑脊液示踪剂穿透率显著降低。评估脑脊液示踪剂在特定脑区内的穿透情况，并从前部绘制热图（C）和后部（D）切片显示了老年人和年轻人大脑各区域观察到的OA-45脑脊液示踪剂平均穿透率的变化。OA-45在不同区域的穿透定量显示，血管旁脑脊液再循环在前后脑片的外侧和腹侧皮层均显著受损（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，Young vs.Old；双向方差分析；每组4例）。

我们提出血管周围AQP4极化的丧失是年龄相关的glymphatic通路功能损害的基础。原则上，AQP4表达的整体变化或反应性星形胶质细胞增生的发展也可能导致血管旁脑脊液再循环受损。为了确定AQP4表达、AQP4极化或GFAP表达的变化是否与CSF示踪剂渗透受损最密切相关，我们对皮层ROI的配对数据进行了线性回归分析，这些数据包括图6和图7C、D.线性回归(图8)结果显示，无论是年轻人，大脑皮层GFAP表达与脑脊液示踪剂穿透之间均无显著相关性（P=0.3992；r2=0.0377）或旧的（P=0.6061；r2=0.0143）大脑。同样，年轻人大脑皮层AQP4的表达与脑脊液示踪剂的穿透没有显著相关性（P=0.0501；r2=0.1634）或旧的（P=0.2301；r2=0.0749）大脑。然而，在年轻人和年轻人中，皮层AQP4极化的丧失与脑脊液示踪剂穿透的损害显著相关（P=0.0225；r2=0.2149）或旧的（P=0.0215；r2=0.2485）大脑。值得注意的是，这些数据提供了相关证据，支持血管周围AQP4极化的丧失导致与年龄相关的glymphatic通路功能损害的假设。然而，他们并没有直接测试这个假设。此外，在年轻和老年动物之间汇总数据时，AQP4极化和CSF示踪剂穿透之间的负相关消失。这表明，虽然AQP4极化的变化可能是glymphatic通路功能的重要驱动因素，但随着年龄的增长，其他年龄相关因素似乎也会导致glymphatic通路功能受损。这些可能包括本研究中描述的与年龄相关的脑动脉搏动性下降，或与年龄相关CSF转换减慢(25).

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皮质血管周围AQP4极化缺失与血管旁脑脊液再循环受损相关

（A）在大脑皮层评估AQP4表达、AQP4-极化或GFAP表达与血管旁脑脊液示踪剂之间的关系。线性回归分析表明，GFAP和AQP4的表达水平与年轻或老年皮层血管旁脑脊液示踪剂渗透性的差异无关。在年轻和老年大脑皮层中，血管周围AQP4极化降低与血管旁脑脊液再循环受损显著相关（年轻大脑：*P<0.05，r2= 0.2149; 老脑：*P<0.05，r2= 0.2485).

AQP4除了在血管周围星形细胞终末极性表达外，在外胶质界限在皮质表面。蛛网膜下腔脑脊液空间和间质之间的界面是脑脊液再循环进入和通过大脑间质的主要途径(4,6). 在上述分析的同一切片中，我们评估了AQP4表达、GFAP表达和CSFS示踪剂穿透率与年龄相关的变化之间的关系形成胶质界膜.图9A-B描绘了年轻和年老的背部皮层的代表性图像。如所示图9C，AQP4在老年脑软脑膜表面附近的表达显著增加，这与脑脊液示踪剂穿透显著受损相一致(图9A-B，底部面板）。AQP4-和GFAP-免疫荧光和脑脊液示踪强度沿着从皮质表面向内延伸的线性感兴趣区域（ROI）进行量化，并在4只动物的6-8个ROI之间进行平均(图9C-D). 在衰老的大脑中，软脑膜表面附近的AQP4表达显著增加（**P<0.01，Young vs.Old；双向重复测量ANOVA），而脑脊液示踪剂穿过软脑膜的穿透显著减少（**P<0.01，Young vs.Old，双向重复测量ANOVA）。老年人软脑膜表面附近的GFAP表达往往高于年轻人，尽管与AQP4相比，在所有动物的所有样本之间测量时，这种差异并不显著。

总的来说，这些数据表明，与年龄相关的皮层表面血管周围AQP4极化和AQD4极化的丧失与血管旁脑脊液示踪剂穿透的损害有关，这种损害在大脑皮层最为明显。这些发现支持了AQP4的错误放大导致衰老大脑中的glymphatic通路功能障碍的观点。

讨论

我们最近证实，CSF和ISF沿血管旁通路的快速交换有助于清除脑实质中的间质溶质，包括Aβ(4–7). 这种血管旁通道网络主要活跃于睡眠大脑，因其依赖星形胶质细胞的水转运，并假设其在大脑中具有间质溶质清除的淋巴功能，因此被称为“glymphatic”通路。在本研究中，我们检验了衰老大脑中glymphatic通路功能受损减缓间质Aβ清除的假设，使衰老大脑易患神经退行性疾病。

采用体内双光子和体外全片荧光显微镜直接观察衰老野生型小鼠血管旁脑脊液和脑内ISF之间的对流交换效率。老年脑血管旁脑脊液示踪剂再循环和间质放射性示踪剂清除率均受损，与年轻脑相比，老年脑的Aβ清除率降低了40%。伴随着glymphatic通路功能受损，大脑动脉壁搏动性降低27%，这是glymphatic通路血管旁流量的重要贡献者(7,17,26). 此外，我们还发现血管旁CSF-ISF交换受损与星形胶质细胞水通道AQP4血管周定位的丢失类似，AQP41是glymphatic通路活性的关键决定因素(4).

脑动脉的搏动是血管旁脑脊液-脑脊液交换的动力(7,17,26–28). 有趣的是，脑血管功能和结构的年龄相关性变化与阿尔茨海默病和血管性痴呆的发展有关(29). 在人类大脑动脉中，血管壁顺应性随着年龄的增长而降低(30)最近的一项临床研究表明，轻度认知障碍患者的外周血管顺应性下降与aβ沉积增加有关(31). 动脉壁顺应性丧失是观察到的与年龄相关的血管搏动性下降的最简单解释。然而，第二种可能性是，脑血管本身的外部因素导致了搏动性的减少。脑动脉壁的搏动发生在血管旁和血管周间隙的范围内，这些间隙紧密地包围在软脑膜鞘内(32)和血管周围星形胶质细胞末梢鞘(22)分别为。这些结构顺应性的年龄相关变化，例如反应性星形胶质细胞增生症的发病可能会影响脑血管搏动。同样，在每一个心动周期中，液体体积自由地快速进出血管周围空间可能会影响血管壁通过这些空间的偏转。因此，血管周围AQP4极化的年龄相关变化可能会影响穿过脑小动脉的动脉壁脉动。这些有趣的可能性显然值得进一步调查。目前的观察结果表明，脑动脉壁搏动性下降伴随着衰老大脑中血管旁CSF-ISF的损害，提示glymphatic通路功能的损害可能是脑血管结构和功能改变与神经变性和痴呆发病相关的机制之一。

在之前的一项研究中，我们观察到大脑细胞外体积分数的动态变化是睡眠-睡眠周期中glymphatic通路功能的关键调节器，睡眠期间细胞外体积百分比增加有助于血管旁CSF与ISF的交换(6). 然而，老年小鼠的glymphatic通路活性下降并不是由大脑细胞外空间的变化引起的。实时TMA离子电渗分析表明，在衰老的大脑中，细胞外体积的睡眠-觉醒差异保持不变。

血管旁脑脊液再循环和ISF溶质清除依赖于星形胶质细胞AQP4水通道(4)主要定位于血管周围星形细胞终末和星形细胞突起形成胶质界膜减少通过星形细胞末端的水流阻力(33). 反应性星形胶质细胞增生症是大脑老化的一个特征(34)在一些损伤模型中，与血管周围AQP4极化的丧失有关，因为AQP4沿非血管周围精细星形细胞突起分布(13,14). 根据这些观察结果，我们在这里测试了AQP4极性的丧失是否有助于老年小鼠脑脊液再循环的急剧下降。

我们发现，在整个老年大脑中，尤其是皮层中，普遍存在星形胶质细胞增生和血管周围AQP4极化的丧失。神经炎症和反应性星形胶质细胞增生症是大脑老化的显著特征，也是神经变性疾病的标志(34–36)然而，衰老大脑中神经炎症变化的功能后果尚不清楚。我们的分析表明，反应性星形胶质细胞增生通常与血管旁AQP4表达的丧失有关，但这种影响在穿透小动脉的血管旁间隙周围的星形胶质细胞中最为明显。年轻和老年脑GFAP表达、AQP4表达和血管周围AQP4-极化与血管旁脑脊液再循环的相关性分析表明，只有血管周围AQD4极化的丧失与大脑皮层CSF-ISF交换的损害显著相关。该分析支持这样一种假设，即血管周围AQP4极化沿穿透动脉的丢失会损害衰老大脑血管旁间隙的大量血流。血管周围AQP4极化的丧失可能导致包括Aβ在内的间质溶质受损，因为间质Aβ清除的很大一部分依赖于血管周围AQD4(4). 这一发现也可能有助于解释衰老大脑中脑脊液周转率下降和脑脊液蛋白浓度增加的观察结果(37). 大部分蛛网膜下腔脑脊液沿血管旁通路通过脑实质再循环，AQP4依赖的液体沿这些通路运动是ISF溶质清除的重要因素。因此，脑脊液和蛋白质沿这些血管旁通路的再循环速度减慢可能会减缓脑脊液清除速度，并增加老化大脑中的脑脊液蛋白质水平。这些发现表明，衰老大脑中glymphatic通路功能的下降可能是在散发性AD中观察到的与年龄相关的Aβ沉积的原因。值得注意的是，外周炎症同样减缓了间质体积流量和大脑中Aβ的清除(38). 基于这些发现，外周炎症可能损害glymphatic通路功能，并可能导致目前与年龄相关的血管旁CSF-ISF交换下降。

临床AD病例和AD转基因模型的先前组织病理学研究表明，淀粉样斑块沉积导致血管周围AQP4极化的丧失(35,36). 这些和目前的研究结果表明，血管周围AQP4极化的年龄相关变化、Aβ的glymphatic清除受损和淀粉样斑块沉积可能构成一个恶性的前馈循环，驱动淀粉样蛋白聚集和老化大脑中神经退行性变化的发展。

除了Aβ清除的血管旁途径外，血脑屏障转运蛋白（如低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1））清除Aβ也是Aβ从大脑流出的主要原因(15). 我们推测，这些可能是重叠的过程。在神经血管单元的微尺度尺寸内，扩散足够有效地将溶质（如Aβ）传递到局部血脑屏障。然而，在更大的距离上，例如将脑间质区域与远处脑脊液隔开的毫米-厘米尺度，大流量必须促进尤其是肽和蛋白质大小的间质溶质的清除(39,40). 一种可能性是，大部分间质aβ通过BBB局部清除，而超过BBB外排转运能力的aβ通过血管旁通路的大量流动清除。一种相关的可能性是，脑实质内的血管旁大量血流将间质Aβ分布到更广泛的解剖区域的血脑屏障，促进经血脑屏障的流出。通过这种方式，Aβ通过BBB的流出和Aβ的glymphatic清除可能实际上代表了从大脑清除间质溶质（如Aβ）的互补和部分重叠机制。

错误折叠蛋白的聚集是几种神经退行性疾病的共同因素，包括AD、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、帕金森氏病、亨廷顿氏病和慢性创伤性脑病（CTE）(41). 本研究表明，天然老化会严重损害glymphatic途径，这是一种新的促进CNS间质蛋白质宏观清除的途径。事实上，脑脊液在整个脑组织中重新循环的这种宏观途径也可能有助于生长因子、神经调节剂、载体蛋白和其他溶质的分布，而这种分布在衰老大脑中的失败可能会产生重要的病理生理学后果。这些结果表明，在衰老和神经退行性疾病中，衰老可能导致认知功能下降，其中有几个尚未探索的机制，根据目前的观察结果，我们认为血管周围AQP4极化的丧失和脑动脉搏动性的降低可能是恢复老龄脑血管旁CSF-ISF交换的重要治疗靶点。

致谢

作者感谢Charles Nicholson博士（纽约大学）对TMA微电泳记录分析的帮助。这项工作得到了NIH/国家神经疾病和中风研究所（NS078167和NS078304 to MN和NS073373 to JI）和美国心脏协会（12SDG11820014 to JI。

脚注

利益冲突：作者声明他们没有相互竞争的利益冲突

工具书类

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