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J签证费用。2014; (90): 51518.
2014年8月18日在线发布。 数字对象标识：10.3791/51518
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NIHMSID公司：NIHMS642829
PMID：25177832

皮层中间神经元的亚型选择性电穿孔

娜塔莉亚·德马科·加西亚1,2和戈尔德鱼壳1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

中枢神经系统（CNS）成熟的研究依赖于神经元群体的基因靶向性。然而，由于特定启动子元件的相对稀缺性，限制特定神经元亚型的相关基因表达的任务已被证明具有极大的挑战性。GABA能中间神经元构成了一个具有广泛遗传和形态多样性的神经元群体。事实上，在小鼠皮层中已经发现了11种以上不同类型的GABA能中间神经元1在这里，我们提出了一种适用于GABA能人群选择性靶向的方案。我们通过使用同源盒转录因子的增强子元件实现了GABA能中间神经元的亚型选择性靶向Dlx5型和Dlx6，果蝇Dll基因的同源物2,3，通过子宫内电穿孔。

关键词：神经科学，第90期，发育，小鼠，皮层，中间神经元，电穿孔，形态学

下载视频文件。（17M，mp4）

介绍

大部分皮质GABA能中间神经元起源于两个短暂的胚胎结构，即内侧和尾侧神经节隆起（分别为MGE和CGE）4表达Parvalbumin和生长抑素的中间神经元起源于MGE，而表达Calretinin（Cr）、Vasontestin peptide（VIP）和Reelin（Re）的中间神经元则起源于CGE。这些中间神经元亚型可以通过它们的出生日期来区分。MGE衍生亚型出生于胚胎第9.5天（e9.5）和e16.5之间5,6相反，CGE衍生的中间神经元从e12.5到e18.5出生，其产量在e15.5达到峰值6然而，这一晚出生人群的基因靶向仍然难以确定。

小鼠无远端（Dlx）基因只在发育中的腹侧前脑中表达三GABA能中间神经元和纹状体投射神经元，但皮层锥体细胞不表达Dlx1、2、5，和6早期发育阶段的基因三的确Dlx公司所有GABA能祖细胞的MGE和CGE室下区（SVZ）中都表达基因。这些基因的表达仅限于有丝分裂后阶段的选择亚型7-9以前的实验证据表明深x 5/6增强子元件允许在转基因小鼠模型中选择性靶向GABA能谱系2我们在发育中的小鼠大脑中的上位表达的背景下测试了这些增强子之一的使用。我们将Dlx5/6增强子元件、最小启动子和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）亚克隆到bluescript（BS）骨干质粒中(图1). 我们通过以下方式引入质粒子宫内e15.5电穿孔选择性靶向Cr-、VIP和Re亚型3, 8, 10我们的技术允许稀疏电穿孔，这有助于重建单个细胞的形态特征。此外，皮层GABA能神经元中异常高水平的基因表达可用于功能研究。我们使用几个野生型和显性负基因进行了功能丧失和获得研究11.

协议

所有动物均按照纽约大学医学院动物护理和使用委员会的规定和指南进行治疗。

这些实验使用了TACONIC提供的瑞士韦氏雌性小鼠品系。为了专门针对浅层中间神经元，使用了e15.5胚胎。

注：本研究中使用的质粒(Dlx5/6.eGFP公司质粒3µg/µl）通过标准克隆技术生成。这个电子GFP将cDNA克隆到Dlx5/6-Pmin-聚酯质粒。此质粒可按要求提供(demarn02@nyumc.org).

1.微量注射移液管的制备

  1. 将拉拔器热量#2设置为860。
  2. 将玻璃毛细管放在灯丝附近并固定。检查吸管的外径（OD）是否约为30μm。
  3. 按下“拉动”按钮。
  4. 小心地拆下毛细管。底部是针。丢弃顶部零件。

2.麻醉程序

  1. 准备一个含有异氟醚的腔室。注：异氟醚因其起效快、副作用发生率低而成为首选麻醉剂。戊巴比妥是另一种选择；然而，这种药物的耐受性是可变的，可能导致比异氟醚更高的死亡率。
  2. 在0.5-1 L/min O中，将异氟醚流量设置为4-5%2.
  3. 确保腔室的阀门处于打开状态，而头部适配器的阀门处于关闭状态。
  4. 将怀孕的老鼠放在房间里。
  5. 让老鼠处于麻醉状态。这大约需要2-3分钟。检查呼吸频率。如果小鼠开始过度换气，降低异氟醚的剂量。
  6. 小鼠麻醉后，立即将其从腔室中取出。将其腹部朝上放在加热垫上，将头部插入口罩中，口罩将在整个手术过程中继续供应异氟醚。确保将异氟醚的流量从腔室切换到连接头部转接件的管道。在每只眼睛里滴一滴眼霜，然后闭上眼睛。
  7. 将加热垫设置为36°C，以将低温降至最低。
  8. 捏住后爪和尾巴，检查是否没有脚和尾巴反射。

3.手术

  1. 用70%乙醇清洁腹部皮肤。
  2. 用镊子将皮肤向上拉。每次手术后，用洗涤剂和水清洗所有仪器，并在72°C O/N下消毒。
  3. 从第三对和第四对乳腺的中间开始，沿着中线做一个小的垂直切口（约2厘米）。使用精细的手术剪刀。注意不要损坏腹壁。
  4. 轻轻地将皮肤与腹膜分开。
  5. 观察腹壁上的动脉和静脉。通过腹膜（避开血管）再做一个2厘米的垂直切口，露出腹腔。
  6. 夹住两侧的皮肤和腹壁，避免夹住动脉。注意：如果动脉意外被刺穿，立即进行颈部脱位或过量服用异氟醚，将动物处死。
  7. 将无菌PBS预热至37°C。用PBS湿润的Kim湿巾覆盖夹钳。
  8. 用PBS润湿暴露的腹腔。在进行手术时重复此步骤数次。
  9. 使用圆形镊子，轻轻地将胚胎链（e15.5）从腔中拉出。把链条放在湿巾上。首先暴露一半子宫。一旦其中的胚胎被电穿孔，将其带回体内，然后进行下半部分的工作。

4.电穿孔

  1. 继续使用圆形镊子操作胚胎。
  2. 观察侧脑室。侧脑室沿中线运行(图1b).
  3. 在DNA溶液中加入速绿（原料：10%w/v），混合比例为1:20，以便在注射过程中可视化。通过将从标准maxi-prep纯化方案中获得的颗粒溶解在蒸馏水中来制备DNA溶液。
  4. 使用带有柱塞的预拔微型移液管注入1 ml DNA溶液(Dlx5/6-eGFP，3µg/µl）。在加载移液管之前，用5号细镊子（Dumont）切断微量移液管的尖端，使肩部开始到针尖结束的距离保持6 mm。用圆形镊子夹住胚胎的头部。用移液管以45°角进入大脑，对准中线附近的侧脑室。如果针头穿过心室，当你使用柱塞注射DNA时，慢慢收回移液管。当溶液开始充满心室时，心室应该变绿。此时，停止移动移液管，注入1毫升DNA。轻轻取出移液管。
  5. 将CUY21电穿孔器设置为5个50毫秒的45伏脉冲，间隔950毫秒。
  6. 对e15.5胚胎使用5 mm桨电极。将电极浸入PBS中，以确保有效的电流传输。
  7. 将电极片放在胚胎头部周围，正极片放在含有DNA溶液的心室上。稍微降低正桨相对于负桨的位置，通过神经节隆起产生腹侧电流。这种操作将最小化锥体细胞中的异位表达。
  8. 放置电极后，踩下脚踏板一次，发出脉冲。
  9. 拆下电极并擦拭干净。对每个胚胎重复步骤4.6-4.9。
  10. 将所有胚胎电穿孔后，将3毫升PBS倒入腹腔，并将其放回腹腔。
  11. 首先用弯针和5-0丝线缝合腹壁，然后缝合皮肤。在伤口上涂抹利多卡因（4%）。腹膜内注射120 mg/kg阿司匹林用于镇痛。注意：整个过程应在20分钟或更短时间内完成。初学者最好只电穿孔几个胚胎，以缩短手术时间。延长手术时间会降低胚胎的存活率。
  12. 将动物从麻醉管中取出，用纸巾在加热垫上进行恢复。
  13. 将动物放回笼子，将其放在37°C的加热垫上，并监测其健康状况。动物通常能够很好地耐受手术，并在从麻醉管中取出后很快开始缓慢移动。如果观察到过度出血或嗜睡，请立即执行IACUC批准的安乐死程序，如颈椎脱位或麻醉过量，将动物处死。
  14. 将笼子放回动物饲养场。雌性会自然分娩。

具有代表性的结果

我们改编了子宫内电穿孔技术实现成熟神经元的细胞类型特异性靶向。为了驱动CGE衍生中间神经元中eGFP的表达，我们使用深x 5/6增强子元件，并将我们的注射限制在e15.5，即大多数CGE衍生中间神经元产生的阶段。我们在第8页和第15页进行了分析11(图1和2). 我们通过共电穿孔a证实了电穿孔神经元的腹侧起源CAG-樱桃和aDlx5/6-eGFPe15.5等摩尔浓度质粒。在这个实验中，我们观察到只有位于脑室下区（SVZ）的腹侧祖细胞共同表达这两种蛋白11荧光蛋白的时空表达与正常发育表达一致深x 5和6基因，不在心室表达，但在心室下区表达4此外，我们评估了Dlx5/6-m樱桃色a中的电穿孔中间神经元GAD67-eGFP公司敲老鼠线。我们发现绝大多数电穿孔神经元表达GAD67，这是一种由所有GABA能细胞表达的酶11此外，我们通过在P15进行免疫组织化学和电生理分析来确定电穿孔中间神经元的亚型身份。亚型特异性标记物的表达模式由冷冻切片中的免疫荧光显示11(图2). 我们发现在e15.5电穿孔的中间神经元几乎只表达NPY、Reelin、VIP和Cr，这是先前描述的CGE衍生中间神经元标记6此外，这些神经元的内在电生理特性与之前在命运图研究中描述的一致6,11总之，这些结果表明电穿孔与深x 5/6e15.5的增强子元件选择性靶向CGE衍生的中间神经元亚型。

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图1。电穿孔实验示意图。a）子克隆策略Dlx5/6-eGFP质粒。b）演示实验策略的图表。

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图2。通过CGE-衍生亚型标记的表达描绘出电泳中间神经元。A）CGE衍生的中间神经元与Dlx5/6-eGFP质粒。注意不同CGE亚型的稀疏电穿孔。B）在P8表达VIP的中间神经元。eGFP表达描绘了单个神经元的整个树突状树和轴突乔木。C）P8处表达NPY的中间神经元。NPY的表达描绘了神经胶质细胞。D）P15处表达NPY的中间神经元。比例尺A，100mm；B-D，50毫米

讨论

该技术的局限性

虽然这种技术允许对细胞过程进行细胞自主分析，但它不适用于群体分析。电穿孔非常稀少，每个大脑电穿孔的细胞不到1000个。因此，该技术不能用于评估CGE衍生中间神经元的遗传操作引起的行为后果。

虽然在e13.5-e14.5靶点MGE衍生亚型进行电穿孔，但效率较低10.我们推测深x 5/6增强子在有丝分裂后MGE亚型中活性较低，至少在外显子表达中是如此。

现有方法的重要性

这项技术代表了以前电穿孔方法的进步12,13用于中间神经元的研究。由于其相对稀缺性和腹侧胚胎起源，这群神经元已被证明难以定位。我们的技术提供了对CGE衍生中间神经元进行细胞自主分析的方法。eGFP的高水平表达允许对单个中间神经元进行可视化和分析。

未来的应用

通过结合使用特定质粒和转基因小鼠系，有可能实现感兴趣基因表达的时间和空间控制。例如，我们使用了Dlx5/6-Tta质粒启动tetO诱导的转基因表达。在这些实验中，我们能够通过给予多西环素来沉默转基因表达8我们目前正在开发一种协议，将该技术与CreER系统结合使用。

协议中的关键步骤

为了实现有效的电穿孔和存活，尽量避免过度操作胚胎和/或器官。此外，避免挤压动脉和静脉。如果发生出血，小鼠会很快出现血容量不足。电穿孔完成后，将胚胎和器官放在发现它们的相同位置，以避免产生可能导致缺氧的扭结。目标是20分钟或更短的手术时间。手术期间，用PBS多次润湿腹腔。在电穿孔过程中，尽量只用毛细管针穿刺心室一次。重复穿刺会降低存活率。训练期结束后，存活率应达到80%或更高。

披露

作者没有什么要透露的。

致谢

我们感谢尹丽红的技术援助。NVD是NARSAD青年研究员奖的获得者，也得到了NIH（5 K99 MH095825-02）的资助。菲舍尔实验室的研究得到了国家卫生研究所、国家心理健康研究所（5 R01 MH095147-02，5 R01 MH071679-09）、国家神经疾病和中风研究所（5 R01 NS081297-02，1 P01 NS074972-01A1）和西蒙斯基金会的支持。

工具书类

  • Fishell G，Rudy B.端脑内的抑制机制：“野生动物在哪里”神经科学年度回顾。2011;34:535–567. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Stenman J，Toresson H，Campbell K。侧神经节隆起中两个不同祖细胞群的鉴定：纹状体和嗅球神经发生的意义。神经科学杂志。2003;23:167–174. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Eisenstat DD等。DLX-1、DLX-2和DLX-5的表达定义了基础前脑分化的不同阶段。《计算机神经学杂志》。1999;414:217–237.[公共医学][谷歌学者]
  • Batista-Brito R，Fishell G.皮层中间神经元发育整合成功能网络。当前最高开发生物。2009;87:81–118. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Miyoshi G，Butt SJ，Takebayashi H，Fishell G。大脑皮层中间神经元的生理上不同的时间序列来自端脑Olig2表达前体。神经科学杂志。2007;27:7786–7798. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Miyoshi G等人。基因命运图显示，尾神经节隆起产生大量多样的浅表皮层中间神经元。神经科学杂志。2010;30:1582–1594. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Bulfone A等。小鼠Dlx-2（Tes-1）基因在妊娠中期小鼠胚胎的前脑、面部和四肢的空间限制域中表达。发展机制。1993;40:129–140.[公共医学][谷歌学者]
  • Bulfone A等。胚胎第12.5天小鼠前脑中Dlx-1、Dlx-2（Tes-1）、Gbx-2和Wnt-3的空间限制表达定义了潜在的横向和纵向节段边界。神经科学杂志。1993;13:3155–3172. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Robinson GW、Wray S、Mahon KA。发育中前脑中鼠无远端同源盒基因新家族成员的空间限制表达。新生物学家。1991;三:1183–1194.[公共医学][谷歌学者]
  • Close J等。Satb1是一种活动调制转录因子，对内侧神经节隆起衍生的皮层中间神经元的终末分化和连接是必需的。神经科学杂志。2012;32:17690–17705. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • De Marco Garcia NV、Karayannis T、Fishell G。特定皮层中间神经元亚型的发育需要神经活动。自然。2011;472:351–355. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Petros TJ，Rebsam A，Mason CA。小鼠视网膜神经节细胞基因表达的宫内和体外电穿孔。可视化实验杂志：JoVE。2009[PMC免费文章][公共医学]
  • Walantus W、Castaneda D、Elias L、Kriegstein A。E15小鼠胚胎宫内脑室注射和电穿孔。可视化实验杂志：JoVE。2007年，第239页。[PMC免费文章][公共医学]
文章来自可视化实验杂志：JoVE由以下人员提供MyJoVE公司