单粒子追踪（SPT）方法为活细胞内生物分子运动提供了引人注目的见解1然而，只有在空间上分离良好、缓慢移动的分子显示出强大、稳定的信号时，才能获得高度详细的轨迹。光漂白后的荧光恢复（FRAP）与高颗粒浓度兼容，如果采用单点检测，则恢复速度足够快2然而，恢复的半衰期取决于照明几何形状和漂白速度与恢复速率的比率，这使得难以获得绝对扩散系数。为了揭示快速分子运动、量化粒子浓度和研究闪烁速率，荧光波动光谱（FFS）方法已成为一种流行的选择三FFS的基础是一个较小的观测体积，与荧光强度时间轨迹中噪声诱导的波动相比，它使粒子数波动显著。原则上，如果样品很薄（<1μm），可以使用简单的外荧光配置。但对于厚样品，由于离焦平面的背景很高，因此不可能将FFS方法应用于外荧光数据，除非样品中含有非常明亮和稀疏的粒子。通常情况下，荧光素或细胞内部的溶液并非如此。因此，大多数FFS实现都使用单点检测方案，需要昂贵的共焦或双光子显微镜，成像速度较慢（~1帧/s）。此外，相关曲线的解释可能很繁琐，尤其是在嘈杂的环境中，如活细胞。因此，一种快速、基于摄像头且易于解释的方法是非常可取的。为了获得较小的观察体积，我们使用了单平面照明显微镜（SPIM）4,5在SPIM中，激励和检测通过使用两个相互垂直排列的物镜进行解耦(补充图S1). 激发物镜发出的薄片光将荧光激发限制在三维样品内检测物镜焦平面的任何位置。为了便于样品处理，我们在垂直配置（uSPIM）中实现了SPIM，两个物镜从顶部与样品平面成45°角浸入培养皿6这种设计与传统的、基于盖滑石的样品制备兼容(补充图S2,3). 对于FFS，需要随时间捕获荧光信号。不同滞后时间的时间轨迹的相关性会产生一条衰减曲线，该曲线可以用模型函数拟合，以提取分子动力学信息。在基于相机的显微镜中，每个像素都会产生荧光时间轨迹，可以单独分析7,8,9然而，单像素分析面临着一个严重的问题。由于典型的曝光时间在毫秒范围内，时间分辨率不足以捕捉快速过程，例如小蛋白质或染料分子的扩散(补充图S4). 相反，利用相机数据，应用时空图像相关光谱（STIS）更有效10.
结果
测量溶液中小分子的快速扩散
静止粒子图像序列的时空相关性类似于用显微镜点扩散函数（PSF）卷积的粒子的平均形状。对于流动分子，峰腰将随着延迟时间的增加而变宽，峰高将减小(). 在自由扩散的情况下，峰宽的增加，即二阶中心矩，与粒子均方位移（MSD）成正比(等式S2). 通过绘制图像MSD(我MSD），平均扩散系数由该线性关系的斜率决定11值得注意的是，斜率与显微镜PSF无关，这意味着扩散系数的计算不需要对仪器腰部进行任何校准(补充图S5). 相反我零滞后时间的MSD，即线性回归产生的偏移，指向与平均粒径卷积的仪器PSF。演示SPIM-我MSD能够精确测定快速移动分子的扩散系数，我们制备了罗丹明110、EGFP和20-nm红色荧光珠的纳米摩尔溶液。对于每个样本，采集SPIM图像序列并进行时空相关性；平均值我MSD绘制在.将所得扩散系数与其文献值进行比较，证明SPIM-我MSD提供准确的数字(补充表S1)12,13,14除动力学外，还可以使用FFS方法测量颗粒浓度。STICS函数的振幅与观测体积内的平均粒子数成反比，因此与浓度成反比。对于自由的三维扩散，振幅线性地依赖于峰腰的三次幂的倒数，斜率与倒数粒子数成正比(公式S3). 用不同浓度的EGFP溶液验证了这种关系(). 然而，请注意，这些值是相对粒子数。使用EMCCD摄像机作为探测器，测量绝对粒子数需要校准15.
溶液测量。（A） 从一系列荧光图像（左）计算时空相关性（右）。（B） 数据（这里是溶液中的EGFP）可以用高斯函数近似。峰值宽度对应于粒子我材料安全数据。自由扩散表示为我MSD和滞后时间τ。（C） 平均我根据罗丹明110（正方形，n=6）、EGFP（圆点，n=10）和20 nm珠子（三角形，n=6）的溶液测量得出的MSD。数据的线性拟合导致平均扩散系数为400±20μm2秒−1对于罗丹明110（实线），87±7.5μm2秒−1对于EGFP（虚线）和29±2.7μm2秒−1珠子（虚线）。（D） 在nM范围内不同浓度的EGFP溶液中测得的平均振幅（n=5）。数据的线性拟合导致观测体积内的平均相对粒子数为0.27±0.01（实线）、0.43±0.02（虚线）、0.85±0.05（虚线。所有错误均为标准偏差。
活细胞中的3D蛋白质动力学
要评估体内SPIM的性能-我MSD，我们对表达EGFP和EGFP蛋白的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行了铺板。已知这两种蛋白质在细胞浆中自由扩散，示例性荧光图像如。对于这两个样本，我们记录了多个SPIM图像序列，并对其进行了测试我MSD分析(). 同样，所得值与文献中发现的扩散系数非常吻合(补充表S1). 我们还用编码与RFP融合的糖皮质激素受体（GR）的质粒转染CHO-K1细胞。在糖皮质激素（GC）治疗后，GR分子二聚并从细胞质转移到细胞核()16用SPIM测量细胞核质中的慢扩散-我材料安全数据(). 此外，如Di Rienzo等人。11，应用我MSD方法不限于自由扩散情况。例如，可以根据我MSD图。通过向我MSD方程，可计算平均粒子速度(等式S4). 为了验证，我们通过在EGFP溶液中以已知速度移动样品台来模拟主动转运(补充图S6). 在细胞内，已知溶酶体沿肌动蛋白网络积极运输。显示活CHO-K1细胞内荧光标记的溶酶体（白色箭头）；从相应的曲率可以立即看出定向运动我MSD图(). 将二阶多项式拟合到每个数据集显示出平均溶酶体速度，与跟踪实验的结果类似(补充表S1). 另一种涉及主动转运的机制是内吞作用。理想的分子，如营养素，被修饰质膜的抗体识别。漂浮在细胞质中的三氯氰菊酯通过衔接蛋白结合，将膜拉入芽中，形成一个囊泡，可以运输到各种目的地，包括早期内体。我们观察到负鼠肾脏（OK）细胞表达一种网格蛋白-mCherry融合蛋白()并对两种不同类型区域的数据进行了分析。未结合的氯氰菊酯分子显示出均匀的荧光信号（白盒），在这种区域，自由扩散通过线性增加我材料安全数据(，顶部）。另一方面，氯氰菊酯包被的囊泡可以被识别为明亮、缓慢移动的点（白色箭头）和选择性的我MSD分析表明存在定向运动(，底部；两次测量的示例数据如所示补充图S7). 结果值包含在补充表S1作为对照，我们用H2B-EGFP转染CHO-K1细胞，该细胞有望是不动的(). 所有测量的采集参数汇总于补充表S2.
活细胞中的分子运动。（A） 表达EGFP的CHO-K1细胞的荧光图像。在32×32～56×56像素（白盒）区域记录图像时间序列，然后进行STICS分析。（B） 平均我MSD的扩散系数为21.9±7.2μm2秒−1（n=13）。（C） 表达EGFP-paxilin的CHO-K1细胞的荧光图像。32×32至72×72像素区域的STICS分析（白盒）。（D） 平均我MSD的扩散系数为5.5±1.4μm2秒−1（n=11）。（E） 表达GR-RFP的CHO-K1细胞的荧光图像。在16×16至48×48像素的区域（白盒）对图像时间序列进行STICS分析。（F） 平均我MSD导致扩散系数为1.6±1.0μm2秒−1（n=6）。（G） 用Lysotracker绿培养CHO-K1细胞的荧光图像。STICS数据在含有运动溶酶体的区域进行分析（白色箭头，24×24至32×32像素）。（H） 平均值的多项式拟合我MSD返回0.3±0.1μms的平均溶酶体速度−1（n=6）。（一） 表达甲氰菊酯的樱桃OK细胞的荧光图像。STICS数据在两种类型的区域（24×24至64×64像素）进行分析，一种区域显示均匀荧光信号（白盒，实线），另一种区域（白盒，虚线）包含缓慢移动的小泡（箭头）。（J）我面板（I）中显示的两个区域的MSD。代表游离氯氰菊酯（顶部）的数据的线性拟合导致扩散系数为0.44±0.20μm2秒−1（n=7），而多项式拟合代表甲氰菊酯包被囊泡（底部）的数据，平均速度为0.18±0.06μms−1（n=6）。（K） 表达H2B-EGFP的CHO-K1细胞的荧光图像。（五十） A常量我获得MSD（D=0.01±0.02μm2秒−1，n=8）。比例尺，10μm。所有错误均为标准偏差。
利用互相关分析研究蛋白质相互作用
双色互相关FFS（ccFFS）实验彻底改变了分子相互作用的研究17由于仪器的空间分辨率有限，同位化研究容易将近距离视为相互作用，而只有结合才能产生非零互相关振幅。我们在SPIM装置上安装了双视图，将荧光分为绿色和红色通道，并排成像到同一个摄像头芯片上(补充图S1,8). 使用交替激励（ALEX）方案来排除两个通道之间的任何串扰(). 为了验证这种方法，我们制作了一个含有非相互作用EGFP和5-塔马拉荧光团的溶液；未检测到相互关联(). 作为蛋白质结合的一个例子，我们将EGFP分子与抗GFP-Alexa594抗体（ABs）以4:1的比例混合；互相关振幅的存在证实了分子间的相互作用(). 相应的我MSD和振幅绘制于，量化显示所有AB都与EGFP分子结合。有趣的是，由于所有相机像素都是同时捕获的，因此不需要对两个检测通道进行精确的横向对齐(补充图S9).
cc原理我材料安全数据。（A） 根据在两个通道中交替采集的一系列荧光图像（左），计算每个通道中的自相关以及两个互相关（右）。（B） STICS系列从EGFP（通道1）和5-Tamara（通道2）的溶液中获得。没有任何相互关联表明两个分子之间没有相互作用。（C） STICS系列在EGFP（通道1）和抗GFP-Alexa594（通道2）以4:1比例混合的纳米摩尔溶液中测量。由于抗体与EGFP结合，因此存在相互关联。（D）我通道1、通道2和两个互相关的MSD图（n=7）。数据的线性拟合导致平均扩散系数为57±5μm2秒−1（通道1），37±3μm2秒−1（通道2）和35±3μm2秒−1（互相关）。（E） 相应的相关振幅图和线性拟合导致自由EGFP的平均粒子数在观察体积内为1.09±0.03，自由抗GFP-Alexa594为0.007±0.005，结合复合物为0.260±0.003，表明所有抗体都与EGFP分子结合。所有错误均为标准偏差。
活细胞中的蛋白质相互作用
演示SPIM-cc的功能我为了测量活细胞中的分子相互作用，我们用编码EGFP-paxilin-mCherry融合蛋白的质粒转染CHO-K1细胞(). 正如预期的那样，相互关系显示绿色和红色标记蛋白的同时运动(). 作为对照，表达EGFP和mCherry的CHO-K1细胞接受SPIM成像。而荧光图像显示出完美的共定位()，没有任何相互关系证明这两种蛋白质之间没有相互作用().
复写的副本我活细胞中的MSD。（A） 表达CHO-K1细胞的EGFP-paxilin-mCherry的荧光图像（顶部，绿色通道；中部，红色通道；底部，重叠）。在两个通道中交替采集一系列SPIM图像。（B） 对于面板（A）中方框标记的区域，显示了每个通道中产生的时空自相关（滞后时间为16 ms）以及互相关（滞后8 ms）。（C） 从滞后时间内绘制的每个STICS序列的高斯拟合返回的振幅（方形，绿色通道；点，红色通道；三角形，互相关）。（D） 表达CHO-K1细胞的EGFP-paxilin和mCherry-paxillin的荧光图像。（E，F）没有任何交叉相关性表明两种融合蛋白之间没有结合。比例尺，10μm。
讨论
由于其高速、低光毒性和成本效益，基于相机的SPIM革新了3D成像，并开始取代单点扫描显微镜。然而，在单个像素中，使用相机进行检测的速度永远不会像使用单点探测器那样快，从而阻碍了对快速单分子动力学的研究。在这项工作中，我们演示了如何利用SPIM获得的丰富空间信息来恢复三维分子运动；我们能够研究从细胞中缓慢移动的小泡（~0.2μm2秒−1)快速扩散溶液中的染料分子（~400μm2秒−1)跨越近五个数量级的时间尺度。原则上，光栅图像相关光谱学（RICS）18,19基于单点扫描，可以提供相同的信息，但数据采集需要更长的时间（>1分钟），并且需要对PSF进行过采样，导致视野有限（~10×10μm2). 另一方面，通过应用受激发射损耗，RICS可以洞察亚微米级的感兴趣区域20然而，STED-RICS的视野甚至更受限制，并且需要与STED相容的染料。此外，根据粒子运动的类型，用正确的模型函数拟合RICS数据可能很困难。相反，不同类型的运动，如自由扩散、瞬态俘获和/或主动输运，很容易通过我MSD图及其量化不需要任何参考测量。同样，分子间的相互作用很难用双色SPT或FRAP来处理，可以用cc来研究我无需对两个探测通道进行完美的横向校准，从而简化了MSD。此外，数字和亮度（N&B）分析可以作为一种补充技术，因为它可以应用于为我MSD分析。自我MSD分析已包含在商业软件中，不需要对设置或样本SPIM-（cc）进行任何特殊修改我MSD方法可立即适用于任何配备高数值孔径检测透镜的现有SPIM系统。
方法
解决方案测量
在单通道实验中，制备了罗丹明110、EGFP和20-nm红色荧光珠的纳米溶液。绿色荧光在700μW的488 nm处激发，而红色荧光在150μW的561 nm处激发。这两种荧光都是在进入物镜之前测量的。
对于双通道互相关实验，EGFP和抗GFP-Alexa594（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）的混合物以4:1的比例制备，并在水中稀释至纳米摩尔浓度。分别用800μW的488-nm光和900μW的561-nm光激发绿色和红色荧光。为了避免绿色和红色检测通道之间的串扰，采用了交替激励方案。对于每次测量，我们在4.5 ms曝光时间下获得了8192张64×64像素的图像，像素大小为736 nm。
细胞样品制备
用钻石笔从30×24 mm 1.5号盖玻片（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市费希尔科学公司）上切下2 mm×17 mm的条纹。在电镀和转染细胞之前，将其中几条放在35 mm的细胞培养皿中，并用纤维连接蛋白涂覆。对于荧光成像，将单个条带转移到成像皿中(补充图S2)充满磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
将稳定表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）或paxillin-EGFP的中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞培养在湿化的5%CO中2在37°C的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）/营养混合液F-12（马里兰州Rockville，Life Technologies）中加入10%胎牛血清（FBS）和0.5 mg/mL基因素（G418），以保持对转染细胞的选择。将未转染CHO-K1细胞培养在添加10%FBS、1%（v/v）和青霉素/链霉素的DMEM/营养混合物F-12中。
为了对溶酶体进行荧光成像，将这些细胞与50 nM LysoTracker Green DND-26（Life Technologies）培养1小时。为了对氯氰菊酯、GR、H2B和EGFP-paxilin-mCherry进行成像，根据制造商的说明（生命技术），使用Lipofectamine 2000转染细胞。通常，将1μg质粒（用PBS稀释）与5μl Lipofectamine孵育30分钟，并添加到含有完全补充培养基的细胞培养皿中。细胞保持在5%的加湿CO中2对于EGFP和mCherry的联合转染实验，稳定表达EGFP-paxilin的CHO-K1细胞被mCherri质粒瞬时转染。用含有1μM地塞米松的培养基培养细胞20分钟，可诱导GR-RFP向细胞核移位。
数据分析
在数据的时空相关性之前，一个潜在的不动分数被减去。对于自由扩散，如Di Rienzo等人所述，时空相关性G公司D类(ξ,ψ,τ)在滞后时间τ时，可以用高斯建模，
像素滞后，ξ和ψ，沿着x和年轴。宽度，σ第页(τ)，表示图像中粒子的均方位移(我MSD），
用扩散系数，D类，可以从斜坡上恢复。这个我时间零点的MSD，
，表示平均粒径与仪器腰围的卷积。对于3D扩散，克D类(τ)，由给出
哪里N个是观测体积内的平均粒子数γ=0.35表示体积对比度的校正系数。绘制振幅，克D类(τ)，针对我MSD，
，可以得到平均粒子数N。
在主动输运的情况下，相关峰有额外的展宽。这可以通过添加速度项来解释，v（v）2τ2，至方程式（2），
粒子的平均速度可以恢复。
对于互相关实验，存在自由绿色荧光粒子的混合物N个克，游离红色荧光颗粒N个第页和束缚复合体N个克它发出绿色和红色荧光，假设光漂白可以忽略不计，没有反应诱导的猝灭或荧光增强，并且没有粒子交换。因此，绿色通道中测量的平均粒子数，N个1，是自由绿色粒子和结合绿色粒子的总和
相同的叠加适用于红色粒子的平均数量，N个2，屈服
由互相关函数产生的粒子数，N个12，与双标记络合物的平均数量成正比，N个克.假设绿色和红色通道的观测体积相似，我们得到
