遗传稳定的黏液样/圆形细胞脂肪肉瘤中正常和功能性TP53

蛋白质提取、SDS-PAGE和western blot

用冰镇磷酸盐缓冲盐（PBS，Life Technologies）清洗细胞，并收集在RIPA缓冲液中（25 mM Tris-HCl，pH 7.6，150 mM NaCl，1%IGEPAL，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS）（Pierce）；补充1X停止蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Thermo Scientific）。样品在冰上培养10分钟，并在4°C下以14000 g离心10分钟进行清除。样品的蛋白质浓度用直流根据制造商的建议进行蛋白质分析（BioRad）。样品储存在−20°C温度下。

根据制造商的建议，使用Novex NuPAGE系统（生命科技）进行SDS-PAGE和免疫印迹。协议在别处有详细描述[20]使用以下初级抗体：抗TP53中心部分（Pab240，稀释1∶200，Santa Cruz Biotechnology）、抗TP53 N-末端（DO-1，稀释1∶200，Calbiochem Merck）、抗TP53 C-末端（Pab421，稀释1∶200，Calbiochem Merck）、抗DDIT3（15204-1-AP，稀释1∶266，Proteintech）和抗GAPDH（mAbcam 9484，稀释1∶200，Abcam）

免疫组织化学

根据瑞典法律（由哥德堡大学伦理委员会批准），从我们的病理科获取了7例MLS/RCLS病例和1例子宫内膜癌的石蜡包埋切片。如前所述进行免疫组织化学[5]使用TP53特异性抗体OP43A（Calbiochem Merck），稀释1∶100。

组织学标本由两名检查人员以盲法进行检查和评估。在200倍放大镜下对染色的肿瘤细胞进行计数。计数细胞核和细胞质表达的细胞，避免炎症细胞、内皮细胞和坏死区域。计算每张幻灯片中的三个不同区域，并计算平均值。为了评估弱或强染色细胞，分析了五个或更多不同区域的500个细胞。

免疫沉淀和质谱

细胞用PBS清洗一次，并收集在补充有HALT蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（Pierce）的冰溶缓冲液（25 mM Tris pH 7.5，1%CHAPS，100 mM NaCl）中。细胞悬液通过在4°C下在1000 rcf下离心10分钟来清除。从大约10个⁷用5µg抗TP53抗体（Pab1620，Abcam）在1100µl裂解缓冲液中在4°C下轻轻摇晃培养细胞1小时。添加40µl预平衡的DynaBeads蛋白质-A（Invitrogen），将混合物培养1 h，然后用750µl裂解缓冲液（两次）和750µl稀释缓冲液（一次）在DynaMag-Spin（Invit罗gen）中洗涤。通过添加20µl 0.2%乙酸并在室温下孵育5 min，从固定化珠中洗脱捕获的蛋白质。如前所述，样品制备和质谱分析在哥德堡大学Sahlgrenska学院的蛋白质组学核心设施进行[20].

免疫荧光

将细胞固定在PBS中3.7%的甲醛（Sigma-Aldrich）中，37°C时pH值为7.2，用PBS洗涤，并用TP53（FL-393，Santa Cruz Biotechnology）或P21（EA10，Merck）染色，二者均在提供2%BSA（Sigma Aldrich。使用Cy3二级抗体检测结合的一级抗体（PA43002分别为PA43004、Amersham）。使用Prolong Gold防褪色和DAPI（Invitrogen）安装幻灯片。使用蔡司Axioplan 2荧光显微镜（Zeiss）对细胞荧光进行成像。

PCR和DNA序列分析

PCR片段TP53型从细胞系的cDNA中扩增出剪接变异体，并按所述进行测序确认[21]使用了以下PCR引物：TP53exon1_4（正向：5′-GGAGGAGCCGCAGTCAGAT-3′，反向：5′-TTCAATATCCGTCCGGGGA-3′)，TP53exon4_6（转发：5′-TCCTTCCCAGAAAAACCTACC-3′，反向：5′-ACCACTATTGTCGAAAAGTTTC-3′)，TP53exon5_8（转发：5′-AAGCAGTCAGCACATGAC-3′，反向：5-GCGGAGATTCTCTCTCTGT-3′)，TP53外显子8_10（正向：5′-TTTTGCCTGTCCTGGGA-3′，反向：5′-TGGGCATCCTTGAGTTCC-3′)和TP53外显子10_11（正向：5′-GAGAGGGCTCCACTCAG-3′，反向：5′-tatgtcctactactccccccccc-3′)

使用带有Ion 318芯片的Ion Torrent PGM测序器和Life Technologies Ion AmpliSeq癌症热点面板v2（Life Technols）进行突变筛查。CHPv2.0面板由207个放大器组成。使用Ion AmpliSeq协议进行文库准备。放大器坐标记录在供应商网站上。

MLS衍生细胞系中TP53表达升高

与肿瘤组织相比，体外培养的MLS 402-91、2645-94、1765-92和DL 221肿瘤细胞中的MLS/RCLS均表达TP53蛋白，如我们的western blot所示(图1B和1D)和免疫荧光分析(图2). 培养的MLS/RCLS细胞中TP53表达升高的原因尚不清楚。细胞压力由在体外培养条件是一个似是而非的解释，支持这一事实的是，新移植的MLS/RCLS组织细胞迅速开始表达TP53蛋白，在几代内进入衰老阶段（数据未显示）。用SV40大T抗原编码载体转染可以建立MLS细胞株，但DL221除外[3]用携带猴病毒40（SV40）大T抗原的表达载体稳定转染两个MLS细胞系402-91和1765-92[3],[23]MLS 2645-94是通过感染完整的SV40病毒而建立的(表1)[24]据报道，SV40编码的蛋白质结合TP53并干扰其功能[25],[26]尽管TP53水平较高，但这可能有助于MLS细胞系的存活和持续生长。

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图2

辐射和对照培养细胞中TP53和P21的免疫荧光分析。

显示（A）TP53和（B）P21阳性细胞的百分比。显示了三个实验的平均值±SEM。*并且**使用学生的t检验表示95%和99%的显著性。在一次实验中评估了强TP53染色细胞的数量，并在相应的条形图中用点（•）标记。显示了MLS 402-91的代表性免疫荧光图像。比例尺显示50µm。（C） 显示了MLS细胞系中FUS-DDIT3的Western blot分析。不同的大小对应于I型（MLS 402-91和DL 221）、II型（MLS2645-94）和VI型（MLS1765-92）融合蛋白。在计算相对FUS-DDIT3表达水平时，GAPDH用作样本之间的内部控制。最低的FUS-DDIT3表达式值（DL 221）被任意设置为1。

MLS衍生细胞系中产生正常的TP53蛋白

Western blot分析显示，使用针对MLS 402-91和2645-94中TP53 N末端、核心（DNA结合）和C末端结构域的三种不同抗体，有53kD带(图1B). 56kD带与TP53核心特异性抗体发生反应，但与针对N端和C端部分的抗体没有反应或反应非常微弱。据报道，HT1080细胞含有正常和功能性TP53等位基因，表达用TP53核心抗体检测到的较大的56 kD蛋白[27]N端和C端特异性TP53抗体在HT1080中表现出弱反应性(图1B). MLS 1765-92主要表达53 kB带，而DL 221表达较大的56 kB带(图1D).

对几种大小的TP53蛋白的观察促使了进一步的研究，因为TP53亚型可能由选择性剪接或翻译产生，并且它们的大小通过翻译后修饰来修饰[28]此外，据报道，FUS-DDIT3蛋白影响一些转录物的选择性剪接，而正常的FUS参与翻译控制[29]–[31].反转录PCR和部分外显子边界序列分析TP53型然而，MLS细胞系的转录物显示出正常大小的cDNA片段，表明正常TP53型生成了转录本（类似于ENST00000269305）(图1C). 此外，来自MLS 402-91的免疫沉淀的TP53蛋白的质谱分析显示正常蛋白的预期肽(图1C和S1). 由于这些蛋白质区域中的胰蛋白酶位点很少，因此在分析的片段中没有显示N端和C端部分。然而，针对N端、中心和C端表位的抗体发生反应，MLS衍生的蛋白质显示所有主要部分都存在。总之，MLS细胞系表达正常的TP53蛋白，在53和56 kD处检测到条带。MLS和HT1080细胞之间观察到的TP53大小和抗体反应性的差异可以通过翻译后修饰得到56kD蛋白来解释，该蛋白在HT1080的细胞系中最为显著(图1B和1D). 翻译后修饰（如磷酸化和甲基化）可能导致N端和C端表位的掩蔽，这可以解释56kD带与N端和C端抗体的低反应性(图1B)[28],[32],[33].

辐射诱导MLS细胞株TP53翻译后修饰

辐射诱导的DNA损伤激活TP53涉及蛋白质修饰，如磷酸化、甲基化、泛素化和sumoylation[28],[32],[33]这些修饰导致TP53作为转录因子激活并表达下游基因，包括CDKN1A公司/第21页 [34],[35]用核心反应抗体对TP53进行的Western blot分析显示，69kD带在辐照的MLS 402-91和1765-92中高度上调，而在DL 221中略微上调(图1D). 该条带占TP53总量的很大一部分，其尺寸变化与报道的辐射诱导的TP53翻译后修饰相一致[33]MLS 2645-94细胞表达相同的69kD条带，但没有或检测到少量调控。MLS细胞系402-91、1765-92和2645-94的免疫荧光分析显示，TP53在几乎所有细胞中表达，MLS 2645-94TP53染色较弱(图2A). 因此，照射后仅检测到TP53表达细胞数量的微小变化。详细分析表明，与对照细胞相比，大多数受照MLS 402-91和1765-92细胞的TP53均呈强染色，而MLS 2645-94、HT1080和HT1080 FUS-DDIT3细胞在对照细胞和受照细胞中均未见强TP53染色细胞(图2A). 我们的结论是，MLS细胞系402-91和1765-92对正常细胞的反应与预期一致，辐射后TP53蛋白发生了改变，而DL-221和MLS 2645-94细胞的反应较弱(图1D和​和2A）。2安培). DL 221细胞表达突变的TP53，但我们的序列分析未能检测到MLS 2645-94中功能失调的TP53突变。然而，后一种细胞系与MLS 402-91和1765-92的不同之处在于，它表达了较短的FUS-DDIT3融合蛋白（II型），并且是通过用SV40病毒感染原代肿瘤细胞而建立的[5]因此，MLS 2645-94能够表达全部SV40 T抗原，而402-91和1765-92细胞仅表达大T抗原[3].

FUS-DDIT3表达最高的两个细胞系（MLS 402-91和MLS 1765-92）表现出最强的TP53激活(图1D和​和2C）。2摄氏度). 为了测试FUS-DDIT3融合蛋白是否会干扰TP53的表达和功能，我们分析了含有和不含稳定转染FUS-DDIT3 II型蛋白（HT1080 FUS-DDIT3）的HT1080细胞。免疫荧光分析显示HT1080 FUS-DDIT3细胞TP53表达较弱，但阳性细胞显著增加（p<0.01，图2A). 这种增加可能是因为转染细胞中癌蛋白的应激效应，也反映了MLS细胞系中TP53的高背景表达。照射亲代HT1080细胞后，TP53阳性细胞数量增加（p<0.05）。大多数HT1080 FUS-DDIT3细胞在照射前表达TP53，因此照射后观察到较小的影响。然而，辐射增加了野生型和HT1080 FUS-DDIT3细胞中翻译后修饰的TP53蛋白的积累(图1D). 这些数据表明，辐照诱导的TP53修饰并未受到FUS-DDIT3融合蛋白的影响。因此，MLS 2645-94中观察到的弱TP53反应很可能是由该细胞系的SV40感染引起的[25],[26].

DL 221肿瘤细胞由Alexander Lazar博士慷慨提供。Ion AmpliSeq癌症热点面板仅供研究使用。不用于诊断程序。