代谢图谱法测定小鼠组织中谷氨酸脱氢酶活性及其动力学（定量酶组织化学）

摘要

介绍

谷氨酸脱氢酶（GDH，EC 1.4.1.3）是一种代谢酶，催化L-谷氨酸与α-酮戊二酸（α-KG）的可逆反应，伴随NAD（P）+还原为NAD（P）H或反之亦然(Plaitakis等人，2011年;Mastorodemos等人，2009年,2005). GDH主要位于线粒体，尽管最近发现GDH也存在于细胞质、内质网和细胞核中(Tiwari等人，2014年;Mastorodemos等人，2009年;Prisco等人，1968年). 然而，它在线粒体外的功能尚不清楚。

GDH是线粒体糖代谢的关键酶，在谷氨酰胺被磷酸活化谷氨酰胺酶（PAG）转化为谷氨酸后催化谷氨酸分解的最后一步；图1). 通过这条途径，α-KG可以进入三羧酸（TCA）循环(DeBerardinis等人，2008年,2007;Reitzer等人，1979年). 这一过程称为回补，它可以通过氧化α-KG生成ATP，并提高ATP:ADP比率以诱导胰岛素分泌(Treberg等人，2010年;Carobbio等人，2009年;Stanley等人，2000年,1998). 或者，α-KG可以通过IDH1和IDH2转化为柠檬酸盐，以及通过乙酰辅酶A（AcCoA）的形成用于脂质合成的乌头糖(Brose等人，2013年;Filipp等人，2012年;Metallo等人，2012年;Collins等人，2011年;Mullen等人，2011年;DeBerardinis等人，2007年). 另一方面，谷氨酸也可以通过TCA循环转化为苹果酸，或通过苹果酸酶转化为丙酮酸，产生细胞应激保护和脂质和胆固醇代谢所需的NADPH(Koehler和Van Noorden 2003年;Koh等人，2004年;DeBerardinis等人，2007年;怀斯等人，2008年;Romero-Garcia等人，2011年;Lorin等人，2013年). 此外，亮氨酸激活GDH可促进GDP转化为GTP，从而激活小GTPase Rag，激活哺乳动物雷帕霉素复合物靶点（mTORC），并导致细胞生长和自噬减少(Lorin等人，2013年;Durán等人，2012年). 除细胞碳水化合物代谢外，GDH还参与尿素生成，因为谷氨酸转化为α-KG也会产生NH3+，NH3+可用于尿素循环中的氨甲酰磷酸(Spanaki和Plaitakis 2012;Treberg等人，2010年;Stanley等人，2000年,1998;Boon等人，1999年;Nissim等人，1992年). 最后，GDH活性在各种脑疾病中增加，如帕金森氏病、精神分裂症和脑癌(Plaitakis等人，2010年;Bao等人，2009年;Yang等人，2009年;Burbaeva等人，2003年). 据推测，GDH活性增加会改变神经细胞代谢，并通过谷氨酸氧化增加活性氧（ROS）的产生，从而损伤神经细胞(Plaitakis等人，2010年).

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图1。

细胞碳水化合物代谢。缩写：ACLY：ATP柠檬酸裂解酶；α-KG：α-酮戊二酸；α-KGDH:α-酮戊二酸脱氢酶；CS：柠檬酸合酶；FH：富马酸水合酶；GDH：谷氨酸脱氢酶；IDH：异柠檬酸脱氢酶；LDH：乳酸脱氢酶；MDH：苹果酸脱氢酶；ME：苹果酸酶；PAG：磷酸活化谷氨酰胺酶；PDC：丙酮酸脱氢酶复合物。SCS：琥珀酰辅酶A合成酶。SDH：琥珀酸脱氢酶。

在人类中发现了两种形式的GDH，GDH1和GDH2，它们由基因编码总账1和GLUD2公司分别为(Shashidharan等人，1994年;Michaelidis和Tzimagiorgis 1993年;Mavrothalasitis等人，1988年).总账1在许多组织中表达，在大脑和肝脏中表达最高，而GLUD2公司主要表达于视网膜、睾丸和大脑(Spanaki等人，2010年;Shashidharan等人，1994年;Mavrothalasitis等人，1988年). GDH2活性低，因此谷氨酸主要通过GDH1转化为α-KG(Plaitakis等人，2011年;Mastorodemos等人，2005年). GDH中NAD+的Km低于NADP+，而使用NADP+代替NAD+时谷氨酸的Km更高，这表明在生理谷氨酸浓度下，谷氨酸转化为α-KG主要依赖NAD+(Lee等人，1999年;Cho等人，1995年). GDH活性的变构调控很复杂，许多化合物都会影响GDH活性。GDH被GTP、GDP、棕榈酰辅酶A和Zn2+抑制(史密斯和斯坦利2008;Bell等人，1987年;Fahien和Kmiotek 1981年;Dieter等人，1981年;弗里登1965).我-亮氨酸，我-异亮氨酸，我-缬氨酸和ADP激活GDH(Mastorodemos等人，2005年;McGivan等人，1973年;Markau等人，1972年). 此外，GDH在高谷氨酸浓度下通过形成败育复合物表现出底物抑制作用(Li等人，2009年;史密斯和斯坦利2008;Bailey等人，1982年;Engel和Dalziel 1969年). 最后，磷酸盐影响GDH活性，因为在存在磷酸盐的情况下，GTP与GDH的结合不太紧密(Dieter等人，1981年). 由于GDH活性的复杂调节机制，应使用代谢图谱分析完整组织或细胞中的GDH动力学(Chieco等人，2013年;Van Noorden 2010年;Jonker等人，1996年;Van Noorden和Frederiks 1992年). 代谢图谱已用于测定肝脏中的GDH动力学，然而，这些数据还远远不够完整，因为在磷酸盐存在下，以NAD+或NADP+作为辅酶的GDH活性动力学尚未测定(Jonker等人，1996年;Maly和Sasse 1991年).

进行本研究是因为近年来谷氨酰胺水解被认为是原发性脑肿瘤的潜在治疗靶点，例如胶质母细胞瘤（GBM），尤其是继发性胶质母细胞癌印尼盾1或IDH2型突变(图1)其中α-KG的产生可能对这些细胞至关重要(van Lith等人，2014年;Mohrenz等人，2013年;Seltzer等人，2010年). 为了促进谷氨酰胺水解的功能代谢研究，我们确定了最佳代谢图谱方法，以证明小鼠组织中GDH的活性。

材料和方法

代谢图谱

我们使用四氮唑盐来绘制脱氢酶活性的代谢图谱(图2). 在这种方法中，脱氢酶，在这种情况下是GDH，减少NAD（P）⁺NAD（P）H还原介质中的电子载体，随后将水溶性微黄色硝基蓝四唑（NitroBT）还原为不溶于水的蓝色甲醛沉淀。因此，GDH活性部位沉淀的甲素的吸光度是GDH活性的直接测量值(Chieco等人，2013年;Van Noorden 2010年;Jonker等人，1996年;Van Noorden和Frederiks 1992年). 当使用未固定的冷冻切片时，该方法能够评估其完整细胞微环境中的GDH活性。化学固定影响（通常抑制）酶的活性。为了正确定位所生成的甲胎素的酶活性，在酶孵育期间必须将大分子保存在组织切片中(Van Noorden 2010年;Van Noorden和Vogels 1989年). 实现这一点的最佳方法之一是向培养基中添加水溶性聚合物聚乙烯醇（PVA）。在含有聚乙烯醇的介质中，小分子（如底物和辅酶）可以自由扩散，而大分子（如蛋白质）则不能。此外，PVA保持组织形态完整。这种方法确保酶的翻译后修饰及其微环境尽可能保持完整。

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图2。

四唑盐法的原理，用于绘制脱氢酶活性的一般代谢图，特别是GDH活性。缩写：（m）PMS：1-（甲氧基）吩嗪甲磺酸酯；PMS：甲磺酸吩嗪；硝基BT：硝基蓝四氮唑。

为了绘制GDH活性的代谢图，将三只小鼠的肝组织切片在37℃的温度下，在含有18%PVA（西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）的水溶液中，在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 8；默克，德国达姆施塔特）中孵育30分钟，该缓冲液含有5 mM硝基BT（西格马-阿尔德里希），3 mM NAD⁺或NADP⁺（瑞士巴塞尔罗氏公司）、2 mM ADP（罗氏）、0.32 mM甲磺酸吩嗪（PMS；德国海德堡Serva）和0-50 mM我-谷氨酸（Sigma-Aldrich）。每个小鼠肝脏的三个切片用于测试每个谷氨酸浓度。对于所有进一步的实验，使用10 mM谷氨酸，每个小鼠使用一个组织切片。在没有谷氨酸、ADP或NAD（P）的情况下进行对照反应⁺。

PMS原液在黑暗中保持在4C。NAD的所有其他储备溶液⁺、NADP⁺培养前新鲜制备ADP、硝基BT和谷氨酸。通过加热NitroBT，将其溶解在等量的100%乙醇和二甲基甲酰胺中，最终浓度为2%v/v（0.34 M乙醇和0.26 M二甲基甲胺）。

培养后，使用0.1 mM磷酸盐缓冲液（pH 5.3）在60℃下冲洗组织切片30分钟，以立即停止酶反应，并直接从切片中去除粘性培养基。然后，用自来水和蒸馏水冲洗切片，并在热板上干燥。干燥后，将组织切片包埋在甘油果冻中作为固定介质（丹麦格罗斯特拉普达科）。

结果

小鼠肝脏GDH动力学

为了确定GDH动力学，用八种不同的谷氨酸浓度（0、0.4、1.4、2、5、10、30和50 mM）和NAD对小鼠肝组织切片进行GDH活性的代谢绘图⁺(图3)或NADP⁺(图4)作为辅酶。K系列_米当NAD时，谷氨酸的GDH值相似⁺或NADP⁺用作辅酶(图5;表1)，而V_最大值GDH与NAD⁺比NADP高2.5倍⁺.V型_最大值和K_米在3 mM NAD时最理想⁺或NADP⁺（未显示数据）。GDH在NAD存在下均表现出底物抑制⁺和NADP⁺作为辅酶。离解常数（K_我)NAD对谷氨酸的抑制作用分别为12.2 mM和4.0 mM⁺或NADP⁺分别用作辅酶。这些K_我数值表明，当NAD作用于GDH时，其底物谷氨酸对GDH的抑制作用较小⁺与NADP相比用作辅酶⁺尽管这种效果并不显著（学生t吨-测试，第页=0.29）。此外，当NADP作用于谷氨酸浓度较高时，GDH活性被完全抑制⁺用作辅酶，但当NAD⁺用作辅酶(图5). 谷氨酸不会影响培养基的pH值。因此，高谷氨酸水平下GDH活性降低并不是由pH值降低引起的。图5显示GDH V_最大值在培养基中以10 mM的谷氨酸浓度测定。

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图3。

用NAD进行GDH活性染色⁺作为辅酶和各种谷氨酸浓度。（A） 小鼠肝脏冷冻切片中GDH活性概述，如10 mM谷氨酸的存在所示。GDH活性在（B）0 mM、（C）2 mM、。如矩形所示，图像（B–G）在（A）的串行部分中的区域相同。缩写：pt，门静脉束；pp，门脉周围区；pc，中央周围区；cv，中央静脉。刻度，100µm。

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图4。

用NADP进行GDH活性染色⁺作为辅酶和各种谷氨酸浓度。（A） 小鼠肝脏冷冻切片中GDH活性概述，如10 mM谷氨酸的存在所示。GDH活性在（B）0 mM、（C）2 mM、。如矩形所示，图像（B–G）在（A）的串行部分中的区域相同。缩写：pt，门静脉束；pp，门脉周围区；pc，中央周围区；cv，中央静脉。刻度，100µm。

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图5。

NAD存在下小鼠肝脏GDH活性对抗不同谷氨酸浓度的动力学⁺(●) 或NADP⁺(□) 作为辅酶。误差条表示SEM(n个=3）。

表1。

GDH动力学参数。

	GDH+纳德+	GDH+NADP语言+
V（V）最大值	1.26	0.51
K（K）米	1.92	1.66
K（K）我	12.2	3.95

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V（V）_最大值，最大酶活性，单位为µmol/mL/min；K（K）_米，Michaelis–以mM谷氨酸计的Menten常数；K（K）_我，谷氨酸抑制常数（mM）。

小鼠不同组织中GDH的活性

用NAD测定不同小鼠组织中的GDH活性⁺或NADP⁺作为辅酶(图6). 肝脏具有最高的GDH活性（NAD时，肝脏的活性至少是其他组织的4.5倍⁺用作辅酶，与NADP的比例至少为3.5倍⁺作为辅酶）。NADP公司⁺-依赖性GDH活性仅见于肝脏和胰腺。带有NAD⁺作为辅助因子，小脑、小肠和心脏也有活性。

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图6。

存在10 mM谷氨酸和（A）NAD时的GDH活性⁺或（B）NADP⁺作为辅酶校正后用于无底物的非特异性背景染色。活动表示为平均值V_最大值±扫描电镜(n个=3）。

讨论

在本研究中，我们检测了辅酶NAD存在时改变谷氨酸浓度的影响⁺和NADP⁺肝脏中GDH活性。无论是辅酶还是谷氨酸浓度高于10 mM时，都发现底物受到抑制，这与之前的研究结果一致(Li等人，2009年;史密斯和斯坦利2008;Bailey等人1982;Engel和Dalziel 1969年). 带有NADP⁺用作辅酶而不是NAD⁺，发现较强的底物抑制（K_我值分别为4.0 mM和12.2 mM）。K系列_我据我们所知，本文首次描述了通过代谢图谱获得的底物抑制值。GDH的底物抑制通过酶与NAD（P）H和谷氨酸形成败育复合物发生，该复合物被ADP破坏(Bailey等人，1982年). 有趣的是，文献中只描述了磷酸盐存在时的底物抑制(Li等人，2009年;Lee等人，1999年;Jonker等人，1996年;Geerts等人，1996年;Cho等人，1995年;Maly and Sasse 1991年;Bailey等人，1982年;Engel和Dalziel 1969年)表明这些流产复合物的形成是由磷酸盐离子以未知机制介导的。此外，这些磷酸盐离子抑制底物的生物功能尚不清楚。

K系列_米我们通过代谢绘图发现，NAD的GDH值降低了2到3倍⁺NADP降低5至13倍⁺与之前报道的体外匀浆纯化GDH相比(Lee等人，1999年;Cho等人，1995年). 然而，这与NAD的高浓度相一致⁺以及我们应用的ADP，导致K值降低_米值。另一方面，K_米NAD存在时GDH的值⁺（1.92 mM）与之前通过代谢绘图发现的值（2.5 mM；Jonker等人，1996年). 完整组织切片和匀浆中GDH动力学的差异表明，微环境和微环境条件对GDH活性有显著影响。

北美⁺-依赖GDH V_最大值比之前通过代谢图谱发现的低大约10倍(Geerts等人，1996年)，而V_最大值NADP值⁺-依赖性GDH以前还没有通过代谢图谱确定。这个V_最大值在不含磷酸盐的培养基中，在存在100mM谷氨酸的情况下测定，得到更高的V_最大值值，因为在无磷介质中不会发生底物抑制。较低的V_最大值NADP时发现⁺用作辅酶而不是NAD⁺与之前的调查结果一致(Maly and Sasse 1991年).

带有NAD⁺作为辅酶，GDH活性主要存在于小鼠肝脏中，参与氨稳态和尿素生成(Spanaki和Plaitakis 2012;Treberg等人，2010年;Stanley等人，2000年,1998;Boon等人，1999年;Curthoys 1995年). 在我们的研究中，GDH活性在门脉周围到中央周围地带没有差异。这在一定程度上与之前的研究结果一致，之前的研究报告显示GDH活性和mRNA水平的均匀和异质分布(Boon等人，1999年;Maly and Sasse 1991年;Sokal等人，1989年;Lamers等人，1988年). 这可以用GDH的动态表达来解释，这意味着GDH活性分区的变化可以根据饮食、性别和内分泌活动发生(Boon等人，1999年;Lamers等人，1988年). 低NAD⁺-其他组织如胰腺、小脑、小肠和心脏也有依赖性GDH活性。

使用NADP⁺作为辅酶，GDH活性几乎只存在于肝脏中。这表明GDH代谢在很大程度上依赖NAD⁺GDH产生的NADPH可用于减少细胞色素P450，其代谢外源性物质和类固醇(潘迪和弗里克2013;Frederiks等人，2003年). GDH除了戊糖磷酸途径和苹果酸酶外，还是一种产生还原力的额外途径，以维持肝脏中NADPH的水平(Frederiks等人，2007年,2003;Kruger和von Schaewen 2003年). 此外，GDH产生的NADPH可用于脂质和胆固醇合成的还原力(DeBerardinis等人，2007年;Koh等人，2004年).

令人惊讶的是，GDH在小鼠大脑中表现出非常低的活性，而在小脑中仅表现出适度的活性(图6). GDH活性已通过库格勒和拜尔（1992）在大鼠大脑中显示出1µmol/mL/min的活性。然而，Kugler和Baier（1992）如前所述，使用无磷培养基，无底物抑制，在高谷氨酸浓度下产生更高的酶活性。我们使用富含磷酸盐的培养基来确保GDH稳定，并且它与体内条件更相似(Dieter等人，1981年;弗里登1963). 我们的结果也与删除总账1在中枢神经系统中不会影响小鼠，这意味着GDH在大脑中不是必需的(Frigerio等人，2012年). 大鼠和小鼠大脑中GDH活性的差异与基因表达图谱和BioGPS中的小鼠和大鼠基因表达谱一致，表明小鼠仅在肝脏中有高GDH表达，而大鼠在所有组织中普遍表达（基因表达图谱(网址：http://www.ebi.ac.uk/gxa);Keane等人，2011年;Wu等人，2009年;Lattin等人，2008年;Su等人，2004年). 由于GDH基因在人脑中的表达相对较高（基因表达图谱：网址：http://www.ebi.ac.uk/gxa;Wu等人，2009年;Su等人，2004年). 我们对人脑组织中GDH活性的测量也证实了这一点（数据未显示）。

总之，我们表明当辅酶NAD存在时，GDH动力学是不同的⁺或NADP⁺使用。使用NADP⁺作为辅酶，GDH活性较低。然而，K_米当任一NAD⁺或NADP⁺被用作辅酶。此外，GDH还表现出底物抑制作用，这种抑制作用只发生在磷酸根离子存在的情况下。当NADP⁺用作辅酶而不是NAD⁺小鼠组织特异性GDH活性测定表明，GDH主要在肝脏中活性，在胰腺、小脑、小肠和心脏中活性较低。

致谢

脚注

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