恶病质是一种消耗性疾病，伴随着许多慢性疾病，如癌症和充血性心力衰竭。恶病质的特征是体重减轻，脂肪和骨骼肌萎缩7重要的是，恶病质不仅仅是厌食症7-9恶病质患者可能减少了食物摄入，但他们处于能量负平衡状态，无法通过营养补充来纠正8,9恶病质是癌症生存的一个负面风险因素，它会导致患者虚弱，并经常阻止他们接受进一步治疗。虽然恶病质可以随着肿瘤的缩小而改善，但目前很少有有效的治疗癌症恶病质的方法10,11.
恶病质的分子基础尚不清楚。恶病质患者细胞因子升高，但抗细胞因子治疗无效10,11在恶病质啮齿类动物模型和某些恶病质患者中描述了棕色脂肪的激活1-6棕色脂肪以热量的形式消散化学能，因此可能参与负能量平衡。肿瘤如何在棕色脂肪细胞中诱导生热，以及这与脂肪和骨骼肌的消耗如何相关，目前尚不清楚。此外，白色脂肪库中含有大量表达UCP1的多房细胞，称为米色（或brite）细胞，这些细胞可以在冷暴露和其他刺激条件下通过一个称为褐变的过程受到刺激。最近的研究在分子水平上对米色细胞进行了表征12并证明了在褐变过程中对转录协同调节因子PRDM16的需求13为了了解肿瘤如何刺激棕色或米色细胞的分子基础，我们使用了伴有恶病质的肺癌小鼠模型。
我们利用易形成肿瘤并导致同基因C57BL/6小鼠恶病质的Lewis肺癌（LLC）细胞。LLC荷瘤小鼠表现出高代谢；他们的耗氧率显著提高(). 然而，这并不是因为身体活动增加或食物摄入减少(). 他们的CO2生产和呼吸交换率降低表明脂肪是首选的燃料来源(). 此外，恶病质小鼠的产热增加。(). 所有荷瘤小鼠在3周内体重减轻()包括脂肪组织和骨骼肌的消耗(). 腹股沟白色脂肪组织（iWAT）是皮下脂肪的一种形式，其消耗速度快于附睾脂肪（eWAT），附睾是内脏脂肪库。随着肿瘤的生长，白色脂肪库和肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）都显示出产热基因的高表达Ucp1、Dio2和第1a页能量代谢的某些其他基因表达增加，包括葡萄糖转运蛋白、β-氧化酶和脂解酶14观察到(). LLC肿瘤还诱导骨骼肌萎缩相关基因的表达()包括肌抑制素(百万分之一)，阿特拉津-1(Fbxo32型)和MuRF-1(微调63).
LLC肿瘤导致脂肪组织褐变和恶病质对接种LLC细胞的小鼠进行长达21天的监测（每组6只）。NTB代表非肿瘤性。接种后4天，将一组小鼠（NTB组和LLC组分别为6和9只）放入代谢笼中，以测量O2消费(一). 尸体重量（总重量减去肿瘤重量）(b条)脂肪和肌肉组织的重量(c（c）)进行了测量。iWAT中的mRNA水平(d日)，电子瓦特(e（电子）)、iBAT(（f）)和腓肠肌(克)通过RT-qPCR检测。数值为平均值±SEM。双尾统计t吨-测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005, ***P（P）与NTB组相比<0.0005。
为了检测脂肪组织褐变对恶病质的影响，我们使用了脂肪特异性项目16-显著降低产热潜能并抵抗褐变的缺陷小鼠13LLC肿瘤诱导的脂肪组织消耗在项目16-未改变肿瘤大小或肌肉重量的敲除小鼠(). 恶病质相关诱导表达Ucp1单位和迪奥2基因敲除小鼠的基因受损，而其他能量代谢基因的表达增加不受影响(). 这些结果暗示了米色脂肪产热途径在脂肪组织消耗中的关键作用。
我们检测了LLC肿瘤衍生因子是否可以诱导脂肪组织中的产热基因表达。LLC细胞条件培养基刺激原代白色脂肪细胞表达Ucp1单位和迪奥2(). 然后，我们通过3kDa截留膜过滤LLC细胞条件培养基，并在原代脂肪细胞上测试级分。所有的产热活性都保留在过滤器浓缩部分中，流动部分中没有留下任何活性。这表明产热诱导活性很可能来源于大分子().
LLC细胞调节培养基刺激脂肪细胞中的产热基因表达a-c公司将ParentalLLC细胞或亚克隆在无血清培养基中培养24小时一和b条)用LLC细胞调节培养基处理24小时(一和c（c）)orthe过滤分数(b条).d日，微阵列分析中确定的分泌因子的基因表达热图。e（电子），用指示的蛋白质（1μg/ml）处理原代脂肪细胞24小时（n=3）。用RT-qPCR测定mRNA水平。应用程序2和Pparg公司是脂肪细胞分化的控制因素。数值为平均值±SEM。双尾统计t吨-测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005, ***P（P）与对照组相比<0.0005。
为了确定产热因子，我们结合了细胞克隆和基因表达谱分析。我们首先从异质LLC细胞中建立了单细胞克隆。生成30个亚克隆并用于生产条件培养基，然后在初级脂肪细胞上进行测试。我们获得了Ucp1单位-这些亚克隆的诱导活性()并选择了8个克隆，这些克隆表现出比亲本细胞更多或更少的产热性(). 我们使用微阵列分析了亚克隆的全球基因表达谱，并生成了一份分泌蛋白列表，这些分泌蛋白在产热较多的亚克隆中具有较高的mRNA水平(). 在初级脂肪细胞上测试时，表皮生长因子（EGF）家族的几个成员()包括betacellulin（BTC）、肝素结合EGF（HBEGF）和表调节蛋白（EREG），以及甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）（由普思基因）诱导Ucp1单位表达式().
确定BTC、EREG和HBEGF对Ucp1单位–在LLC细胞条件培养基中发现诱导活性，我们使用EGF受体（EGFR）信号抑制剂。由于三种EGF家族蛋白通过EGFR和Erbb4发出信号，我们在初级脂肪细胞上测试了AST-1306，这是一种针对这两种受体的特异性蛋白激酶抑制剂。AST-1306完全堵塞Ucp1单位脂肪细胞与BTC、EREG或HBEGF联合处理时的mRNA诱导(). 相反，LLC细胞条件培养基中存在的褐变活性在很大程度上不受AST-1306处理的影响，这表明这些EGF家族蛋白在这里没有发挥主要的定量作用().
PTHrP负责LLC细胞衍生的大部分褐变活动a-c公司，用AST-1306（1μM）和LLC细胞调节培养基处理原代脂肪细胞（每组3个）24小时(一)或使用指定的肽（100 ng/ml）2小时(b条)或以100 ng/ml的PTHrP维持2-24小时，NE（100 nM）维持4小时(c（c）).d-e公司，用IgG或抗PTHrP（10μg/ml）和PTHrP（10 ng/ml）处理原代脂肪细胞（每组3个）4小时(d日)或使用LLC细胞调节介质24小时(e（电子）). 用RT-qPCR检测mRNA水平。数值为平均值±SEM。双尾统计t吨-测试。（*）指与对照组或IgG组相比的差异。（#）指PTHrP集团或LLC集团之间的差异*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005, ***P（P）< 0.0005, #P（P）< 0.05, ##P（P）< 0.005, ###P（P）< 0.0005.
PTHrP被加工成至少三种不同的肽产物。我们用这些肽和甲状旁腺激素（PTH-1-34）处理原始的白色和棕色脂肪细胞，其序列和结构与PTHrP（1-34）相似。通过同一受体（PTH/PTHrP受体；PTHR）发出信号的PTH（1-34）和PTHrP（1-34(和). 为简单起见，下文中1-34肽仅指PTHrP和PTH。PTHrP治疗的时间-过程和剂量-反应分析表明，该肽能有效诱导Ucp1单位和迪奥2mRNAs（分别高达200倍和20倍），与去甲肾上腺素相当，去甲肾上腺素是交感神经系统产生的典型热原儿茶酚胺(和). 接下来我们研究了PTHrP如何影响UCP1蛋白水平和非耦合呼吸。用去甲肾上腺素（NE）、PTHrP或PTH处理原代白色和棕色脂肪细胞。值得注意的是，这三个因素都使UCP1蛋白相对增加，并且显著提高了O2消耗，包括基础呼吸、非耦合呼吸和最大呼吸(). 这些结果表明，PTH/PTHrP途径可以是细胞呼吸的一个非常强大的调节器。
PTHR是一种激活PKA通路的G蛋白偶联受体（GPCR）15NE还通过作为GPCR的β-肾上腺素能受体发出信号，并诱导PKA信号以促进产热基因表达。用NE、PTHrP或PTH处理原代白色和棕色脂肪细胞可刺激PKA底物CREB和HSL的磷酸化。一种选择性PKA抑制剂H89阻断PKA信号，PKA信号也完全抑制所有三种因子的转录调控(). 这些结果有力地表明，PTHrP和PTH都需要PKA途径来介导它们对Ucp1单位和二极管2转录，因此与β肾上腺素能途径共享一个共同的信号机制。
接下来，使用抗PTHrP的中和抗体来研究PTHrP是否参与LLC细胞诱导的产热基因表达。当添加到脂肪细胞上时，该抗体能够完全抑制PTHrP活性(). 重要的是，当脂肪细胞用LLC细胞条件培养基结合抗PTHrP治疗时，Ucp1单位和迪奥2诱导几乎完全受阻(). 这些数据表明，PTHrP是导致培养脂肪细胞褐变的LLC细胞分泌物质的主要成分。
PTHR（编码人第1部分)已知在肾脏和骨骼中高度表达15值得注意的是，在脂肪和肌肉组织中也观察到相当高的mRNA表达(). 接下来我们研究了PTHrP依赖的转录调控体内PTHrP能有效促进产热基因和某些其他能量代谢基因的表达()这一模式与LLC肿瘤引起的脂肪组织褐变非常相似。
然后研究PTHrP在LLC肿瘤引起的脂肪褐变和浪费中的作用。在荷瘤小鼠中检测到高达500 pg/ml的血浆PTHrP(). 接下来，我们给小鼠注射抗PTHrP的中和抗体或对照IgG。令人惊讶的是，抗PTHrP治疗的小鼠体重没有显著下降，而IgG治疗组表现出明显的恶病质(). 抗-PTHrP治疗阻断了脂肪组织和骨骼肌的消耗，而不改变平均肿瘤质量(). 脂肪组织的组织学检查表明，抗PTHrP治疗可防止脂肪滴收缩(). PTHrP的中和也阻断了eWAT、iBAT中产热基因的表达()和iWAT()这意味着热量在脂肪消耗中的因果作用。抗PTHrP治疗也能降低O2消耗恶病质小鼠，改善体力活动并减少热量产生(和). 我们用克拉克电极测试体外O（运行）2脂肪和骨骼肌组织的消耗。注意到该技术测量和表示实际组织呼吸的能力有限，我们证明恶病质小鼠的脂肪组织呼吸适度增加。抗PTHrP治疗抑制了这些增加().虽然不能排除PTHrP抗体的其他非靶向效应，但这些数据揭示了PTHrP在LLC肿瘤诱导的脂肪组织生热和高代谢中的主要作用。
PTHrP的中和作用防止肿瘤诱导的脂肪组织褐变一，在携带LLC肿瘤的小鼠中长达21天的血浆PTHrP水平（n＝6）。b至g，接种LLC细胞的小鼠从第6天到第15天每3天接受IgG或抗PTHrP（10 mg/kg体重），并在第16天处死（NTB、IgG和抗PTHr P组分别为4、5和6）.尸体重量(b条)，肿瘤重量(c（c）)脂肪和肌肉组织(d日)脂肪组织的H&E染色(e（电子）). eWAT中的mRNA水平(（f）)和iBAT(克)用RT-qPCR检测。小时，小鼠的治疗方法与b至g除了在第4天将它们放入代谢笼中以测量O2消耗量（NTB组为6，其他组为5）。数值为平均值±SEM。双尾统计t吨-测试。（*）比较NTB组和IgG组。（#）指IgG组和抗PTHrP组之间的差异*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005, ***P（P）< 0.0005, #P（P）< 0.05, ##P（P）< 0.005, ###P（P）< 0.0005.
PTHrP的中和作用也会损害LLC肿瘤引起的肌肉萎缩()肌肉纤维萎缩()和萎缩相关基因表达(). 我们通过用抗PTHrP治疗小鼠，直到在对照组中观察到严重恶病质，进一步研究了这种作用。抗PTHrP治疗在很大程度上保留了肌肉质量().
PTHrP与恶病质小鼠和人类瘦体重的消瘦有关一，中描述的实验中腓肠肌的mRNA水平.b至e从第6天到第21-22天，接种LLC细胞的小鼠每3天接受一次IgG或抗PTHrP（10 mg/kg体重）（抗PTHr P组为5，其他组为6）。显示了后肢和腓肠肌的典型图像(b条). 称重脂肪和肌肉组织(c（c）). 通过握力分析肌肉功能(d日)和就地收缩(e（电子）).f-h（飞行高度），接种LLC细胞的小鼠在第10-16天之间接受PTHrP（1mg/kg体重）的每日注射后处死（LLC载体组n=5，其他组n=6）。腓肠肌重量(（f）)和握力(克)进行了测量。用RT-qPCR测定腓肠肌mRNA水平(小时).i-j公司比较PTHrP（+）和PTHrP（−）患者的LBM和REE/LBM。k、。PTHrP在癌症恶病质中的作用模型。数值为平均值±SEM。双尾统计t吨-测试。（*）指与NTB组相比的差异。（#）指IgG和抗PTHrP组或LLC-Vehicle和LLC-PTHrP组之间的差异*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005, ***P（P）< 0.0005, #P（P）< 0.05, ##P（P）< 0.005, ###P（P）< 0.0005.
这也反映在肌肉功能上，如握力和就地肌肉收缩(). 虽然PTHrP相关的高钙血症可能具有混杂效应，但我们在LLC模型中没有观察到高钙血症，PTHrP的中和作用并不影响循环钙水平().
健康小鼠注射甲状旁腺素未影响肌肉萎缩相关基因的表达(). 此外，PTHrP治疗原发性肌管不会改变这些基因的表达或肌管直径()表明PTHrP不会直接导致骨骼肌萎缩。我们通过向荷瘤小鼠注射PTHrP进一步研究了这一点。值得注意的是，服用PTHrP加剧了与恶病质相关的体重减轻，但没有改变肿瘤质量(). PTHrP治疗导致恶病质小鼠骨骼肌萎缩更严重，肌肉功能较差，并显著促进肌肉萎缩相关基因的表达(). 这些发现表明，在LLC模型中，PTHrP是肌肉质量和功能损失所必需的。然而，它可能不会单独起作用，并可能与其他肿瘤衍生因子协同作用。
最后，我们研究了PTHrP在一组诊断为转移性非小细胞肺癌或结直肠癌的患者中的表达，这些患者的身体成分和代谢率是在癌症恶病质病因的临床研究背景下研究的16-18在47名患者中，17名患者的血PTHrP水平可检测到（205±155 pg/ml），且无高钙血症病史。与缺乏PTHrP检测水平的30名患者相比，这些患者的瘦体重（LBM）显著降低，每公斤LBM的静息能量消耗（REE）显著升高(). PTHrP（+）患者的瘦组织减少与饮食摄入差异无关（PTHrP+：2364±750 vs PTHrP-（−）：2285±487 kcal/天；p＜0.66）或由血浆C反应蛋白水平确定的炎症（PTHrP（+）：5.7±4.7 vs PTHrP（−）：12.6±27 mg/L；p<0.32）(补充信息). 这些结果表明，PTHrP与该患者队列中更大程度的瘦组织浪费和能量消耗增加之间存在关联。
PTHrP由多种肿瘤分泌，常与某些癌症伴随的高钙血症有关19PTHrP以前与恶性肿瘤高钙血症相关的恶病质有关20-22然而，其在肌肉消耗过程和脂肪组织褐变中的直接作用尚未见报道。综合我们的数据显示，PTHrP是刺激脂肪组织产热基因表达和高代谢的主要LLC肿瘤衍生因子。在这种恶病质模型中，PTHrP的中和作用阻止了脂肪库的褐变和消耗以及肌肉的大量消耗和虚弱。
这些数据表明，PTHrP在脂肪组织中单独起作用，驱动发热/褐变程序，但可能与其他肿瘤衍生分子合作，导致LLC模型中观察到的严重肌肉萎缩和虚弱(). 这种合作因素的身份尚不清楚。PTHrP引起的褐变似乎与肌肉消耗过程没有必然联系。
我们对47名癌症患者进行了初步评估，发现PTHrP（+）亚群表现为瘦体重减轻和能量消耗增加。对恶病质倾向患者的进一步前瞻性研究应通过连续组织活检来测试这些参数，以证明临床癌症恶病质中PTHrP、脂肪组织褐变和代谢率之间的特定关联。如果PTHrP与某些患者的恶病质有关，则有可能确定那些PTHrP升高的患者。针对PTHrP的人源化抗体可能具有如本文所示的抗恶病质作用。确定PTHrP或PTH升高是否在与某些其他疾病（如充血性心力衰竭或慢性肾脏疾病）相关的恶病质中发挥任何作用将是一件有趣的事情。
方法
材料
除STC1（BioVendor）和TNFα（Sigma）外，本研究中使用的所有重组蛋白均购自R&D Systems。合成PTHrP和PTH肽、PTHrP-（1-34）ELISA检测（S-1227）和抗PTHrP1-34（T-4512）抗体购自Bachem。正常兔IgG（Santa Cruz；sc-2027和研发系统；AB-105-C）用作抗PTHrP的对照。所有其他抗体均购自Cell Signaling，包括total-HSL（#4107）、p-HSL（#4126）、total-CREB（#9197）、p-CREB（#9198）、phospho-PKA底物（#9624）、p-Akt（#4060）和p-ERK1/2（#9101），抗Ucp1（Abcam；ab10983）和抗tubulin（Santa Cruz；sc-9935）除外。去甲肾上腺素和AST-1306分别来自Sigma和Tocris。
动物
所有动物实验均获得贝斯以色列女执事医疗中心动物护理和使用委员会的批准。老鼠(小家鼠)在24°C下维持12小时光/暗循环（上午6点至下午6点），并喂食标准辐照啮齿类食物。项目16-漂浮小鼠（±脂联素-Cre）维持在纯C57BL/6背景下。所有其他动物均为从Charles River Laboratories获得的瘦肉C57BL/6小鼠。所有动物实验均使用6-10周龄雄性小鼠。通过进行初步实验以经验确定的样本量被选择为至少4个，以确保获得足够的统计能力。小鼠被随机分为治疗组，同时满足每组平均体重大致相同的标准。治疗组被明确标记以避免错误（无盲法）。每只小鼠的腹部皮下注射500万个LLC细胞。非肿瘤对照小鼠仅接受载体（PBS）。小鼠腹腔注射IgG和抗PTHrP抗体，皮下注射PTHrP-肽。非肿瘤小鼠接受对照IgG或载体（PBS）。所有小鼠在光周期晚期（3-6pm）被处死。在所有肿瘤接种实验中，小鼠被单独饲养，而在其他实验中，则被分组饲养。血浆收集到EDTA管中，用于PTHrP（1-34）ELISA检测。使用无肽大鼠血清（Bachem）作为标准稀释剂来校正小鼠血浆样品中的背景读数。使用肝素管收集血浆进行钙测量，并使用体外分析仪进行测量。使用综合实验室动物监测系统（CLAMS，Columbia Instruments）评估全身能量代谢。一氧化碳2和O2每32分钟收集一次每只小鼠的数据，并将其归一化为总体重。以更频繁的间隔测量活动、热量产生和食物摄入的数据。苏木精和伊红染色时，将脂肪组织固定在4%甲醛中，包埋在石蜡中，并在载玻片上切割成6μm的切片。
原代白色脂肪细胞培养
通过以下程序从30-35天龄雄性小鼠获得腹股沟基质血管（SV）组分。解剖腹股沟脂肪组织，用PBS清洗，切碎，并在37°C下在含有10 mM CaCl、2.4 U/mL dispase II（Roche）和1.5 U/mL胶原酶D（罗氏）的PBS中消化45分钟。消化后的组织通过100μm细胞过滤器过滤，并以600g离心5分钟，以使SV细胞颗粒化。然后将其重新悬浮在脂肪细胞培养基（DMEM/F12（1:1；Invitrogen）加上谷氨酸最大值、pen/strep和10%FBS）中，通过40μm细胞过滤器过滤，如上所述离心，再悬浮于脂肪细胞培养液中并进行电镀。SV细胞在脂肪细胞培养基中由含1μM地塞米松、5μg/mL胰岛素、0.5μM异丁基甲基黄嘌呤（DMI）和1μM罗格列酮的成脂鸡尾酒诱导融合，进行脂肪细胞分化。诱导2天后，将细胞保存在含有5μg/mL胰岛素和1μM罗格列酮的脂肪细胞培养基中。从第6天开始，细胞仅保存在脂肪细胞培养基中，用各种分子处理2-24小时，并在第8天收获。
原代棕色脂肪细胞培养
从新生小鼠（出生后第2-4天）上切下肩胛间棕色脂肪垫，切碎，并在37°C下在含有123 mM NaCl、5 mM KCl、1.3 mM CaCl2、5.0 mM葡萄糖、100 mM HEPES、4%BSA、1.5 mg/mL胶原酶B（Roche）的隔离缓冲液中消化45分钟。通过100μm细胞过滤器过滤消化后的组织，在600 g下离心10 min。将球粒SV细胞重新悬浮在完整的脂肪细胞培养基（如上所述）中并进行电镀。SV细胞在脂肪细胞培养基中，由含有5μM地塞米松、0.02μM胰岛素、0.5μM异丁基甲基黄嘌呤、1 nM T3、125μM吲哚美辛和1μM罗格列酮的成脂鸡尾酒诱导分化为脂肪细胞。诱导后2天，将细胞保存在含有0.02μM胰岛素、1 nM T3和1μM罗格列酮的脂肪细胞培养基中。从第4天开始，细胞仅保存在脂肪细胞培养基中，用各种分子处理2-24小时，并在第8天收获。
LLC细胞培养和条件培养基制备
LLC细胞保存在含有10%FBS和pen/strep的DMEM（Invitrogen）中。条件培养基收集时，细胞在1/3汇合处进行平板。第二天，培养基改为FreeStyle表达培养基（Invitrogen），24小时后收集。对于表达培养基的分馏，使用3千道尔顿（Kd）截止过滤器（Millipore）过滤LLC细胞调节培养基。从分化后7天开始，用条件培养基处理脂肪细胞24小时。用条件培养基处理脂肪细胞时，处理培养基由50%新鲜脂肪细胞培养基和50%LLC细胞条件培养基组成。当条件培养基被过滤和浓缩时，脂肪细胞暴露于90%脂肪细胞培养基和10%浓缩LLC细胞条件培养基中。为了分析全局基因表达，LLC亚克隆在FreeStyle表达培养基中培养24小时。RNA用TRIzol（Invitrogen）提取，用Qiagen RNeasy小柱纯化。Affymetrix小鼠基因组430A v2.0阵列用于生成表达谱数据，并使用dChip软件进行分析。微阵列数据集的GEO登录号为GSE57797。
基因表达分析（RT-qPCR）
使用TRIzol（Invitrogen）从培养细胞或冷冻组织样品中提取RNA，使用Qiagen RNeasy微柱纯化，并使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）逆转录。用RT-qPCR分析结果cDNA。简单地说，将25 ng cDNA和150 nmol每个引物与SYBR®GreenER™PCR主混合液（Invitrogen）混合。使用ABI PRISM®7900HT仪器（Applied Biosystems）以384孔格式进行反应。使用标准化为亲环素mRNA的比较CT方法计算相对mRNA水平。
蛋白质印迹
细胞在含有50 mM Tris（pH 7.4）、500 mM NaCl、1%NP40、20%甘油、5 mM EDTA和1 mM PMSF的裂解缓冲液中均质，并添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）。将匀浆以13000rpm离心10分钟，并将上清液用作全细胞裂解物。蛋白质浓度通过Bio-Rad蛋白质分析测定，每次SDS-PAGE操作中使用50μg蛋白裂解物。在含有0.05%吐温和5%BSA的TBS中用抗体印迹PVDF膜。对于二次抗体孵育，使用含有5%牛奶的TBS-T。使用Pierce的ECL western印迹底物对结果进行可视化。
呼吸分析
使用XF24细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience）测定初级脂肪细胞的细胞耗氧率（OCR）。原代脂肪细胞在XF24微孔板中培养并分化，分化7天后用NE、PTHrP或PTH处理。24小时后，脂肪细胞培养基换成不含NaHCO的DMEM培养基三但含有10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸和处理化学品。分别使用寡霉素和FCCP（各1μM）测定解偶联OCR和最大OCR。鱼藤酮（3μM）抑制了复杂的I依赖性呼吸。离体如前所述，使用克拉克电极（Strathkelvin仪器）测量组织呼吸13将新鲜分离的组织切碎并转移到电极室中，电极室中含有呼吸缓冲液，该缓冲液由1×DPBS、2%BSA、25 mM葡萄糖和1 mM丙酮酸组成。O（运行）2消耗值被归一化为组织重量。
握力
在牺牲的同一天评估前臂握力23。每只老鼠被允许抓住一根附在力传感器上的杆，因为它被尾巴水平地拉离杆（DFX II型；Chatillon型）。平均重复五次，每次之间停顿30秒，以确定每只老鼠的握力。
现场肌肉力量测量
现场如前所述测量力24简单地说，通过皮下注射氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪（1.4 ml/kg BW）鸡尾酒对小鼠进行麻醉。腓肠肌远端肌腱在踝关节插入前被切断。肌腱用4.0尼龙缝合线捆扎，并连接到等长换能器上。在腘绳肌区切开坐骨神经。然后尽可能靠近髋骨切开坐骨神经，并从周围筋膜上剥离。然后将暴露的坐骨神经放置在两个电极上，在悬吊的神经下放置一小块副膜，以防止与其他组织接触。定期使用矿物油使神经保持湿润。使用0.1ms持续时间的超最大方波脉冲刺激神经。在抽搐期间获得最大张力的长度（Lo（o）). 数据记录为最大值（Po（o）; 刺激频率75-150 Hz）等长力。
原代成肌细胞培养
从14天以下的雄性小鼠中分离出原代成肌细胞，并在含20%FBS（Gemini Bio-Products）的Ham’s F-10营养混合物（Irvine Scientific）中培养，FBS中添加2.5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（Promega）、青霉素G（200 U/ml）和链霉素（200 mg/ml）。然后将成肌细胞转移到含有5%马血清的分化DMEM培养基中，直到成熟肌管形成（约48-72小时），然后用PTHrP或TNFα处理。使用Image J软件测量单个肌管的直径。
人体研究
这是对一项研究的进一步分析，该研究旨在调查最近诊断为晚期非小细胞肺癌（NSC）（IIIB或IV期）或结直肠癌（IV期）（n=47）患者的代谢、营养和功能状况16-18纳入标准和措施已在其他地方描述16-18患者是从加拿大埃德蒙顿和阿尔伯塔省北部的癌症治疗中心Cross Cancer Institute招募的。这项研究得到了阿尔伯塔省癌症委员会研究伦理委员会的批准，所有参与者都提供了书面知情同意书。晚期肺癌或结直肠癌患者之所以被纳入研究，是因为他们更容易减重，并且与癌症相关的恶病质。所有参与者都在肿瘤医生的直接护理下，并接受了针对其疾病和分期的标准化疗。所有患者均未接受旨在治疗恶病质的药物，如皮质类固醇、孕激素或大麻素。
参与者被要求禁食12小时，并在评估前24小时避免剧烈运动和饮酒，评估内容包括身体成分、休息能量消耗（REE）和血样。采用PTHrP（1-34）ELISA法测定全血PTHrP。从正常受试者采集的血清样本用于设置测量血PTHrP的基线。血清PTHrP测定采用盲法。如前所述，REE测量采用间接量热法（VMax 29N；Sensor-Medics，Yorba Linda，CA）16。参与者休息30分钟，然后在他们的头和肩膀上放置一个遮篷30分钟，以分析耗氧量和二氧化碳生成量。测量呼吸样品，直到达到稳定状态15分钟。Weir方程用于计算REE。在REE评估的同一天上午，所有参与者还接受了双能X射线吸收仪（DXA）扫描（LUNAR Prodigy高速数字扇束X射线密度计，配备enCORE 9.20软件；威斯康星州麦迪逊市通用电气公司），以测量全身脂肪质量和无脂肪质量17.在医院临床实验室采集C反应蛋白评估用血样并进行分析。使用三天的饮食记录（详细说明连续三天的摄入量，包括一个周末）来评估总能量摄入和膳食模式。对记录的准确性和完整性进行了审查。三天的饮食记录提供了晚期癌症患者群体饮食摄入量的准确平均估计值18.
统计分析
对于每个实验，样本量都是根据经验确定的（进行了初步实验），以确保能够达到所需的统计能力。数值表示为平均值±SEM。所有结果中显示的误差条（SEM）均来自生物复制品，而非技术复制品。使用双尾、非配对评估两组之间的显著差异t吨-检验，这被发现适用于统计数据，因为样本组显示出正态分布和可比方差。
