JAK2抑制剂不影响骨髓纤维化患者脾脏中的干细胞

JAK2V617F系列,CALR（校准）突变分析、细胞遗传学和FISH分析

这个JAK2V617F系列通过使用先前描述的实时等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）分析PB粒细胞来确定每个MF患者的状态。^30,31钙网蛋白的突变分析(CALR（校准）)由已知突变的DNA重测序区域进行CALR（校准）如前所述。²²如前所述，进行细胞遗传学和荧光原位杂交（FISH）分析。^32,33这个JAK2V617F系列等位基因负荷，CALR（校准）状态，以及每个患者中存在的标记染色体异常如图所示表1.

MF和CB CD34的处理⁺带有AZD1480的电池

SP或CB CD34⁺电池（1×10⁵/mL）在含有30%胎牛血清（FBS；HyClone Laboratories）的Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM；Lonza）中培养，补充100 ng/mL干细胞因子（SCF）、100 ng/mL猫McDonough肉瘤样酪氨酸激酶3配体（FL）、100 ng/mL血小板生成素（TPO）和50 ng/mL白细胞介素-3（IL-3；Amgen）在保持37°C和5%CO的增湿培养箱中₂16小时后，将细胞暴露于AZ1480（50 nM、150 nM、300 nM和500 nM，阿斯利康的礼物）中3天。此外，仅含细胞因子的培养物同时进行。随后在后续研究中使用确定的AZD1480最佳剂量（150 nM）。

为了确定AZD1480是否影响正常HPC，CB CD34⁺单元格（1×10⁵/mL）也以相同的方式培养并用AZD1480处理。

CD34的流式细胞术分析⁺细胞

3天后，用抗人CD34-别藻蓝蛋白（APC）、抗人CD90-异硫氰酸荧光素（FITC）和抗人CXC趋化因子受体4（CXCR4）-藻红蛋白（PE；克隆12G5）单克隆抗体（mAbs；BD Biosciences）标记培养细胞。每个分析都与相应的匹配同型对照配对。在流式细胞仪分析之前，立即添加1μg/mL碘化丙啶（PI；Sigma-Aldrich）以排除非活性细胞。对细胞进行流式细胞术分析，从每个样本中获得至少10000个存活事件（FACSDiva软件版本6.1.2；BD）。

CD34的百分比⁺使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（BD Biosciences）检测凋亡细胞。CD34型⁺膜联蛋白V⁺圆周率⁻细胞被认为是发生凋亡的细胞。

用抗CD34-APC、抗Ki67-Alexa 700（BD Biosciences）和PI标记细胞，并进行流式细胞术分析。Ki67号机组⁻圆周率⁻细胞被认为位于G0，Ki67⁺圆周率⁻G1和Ki67中的细胞⁺圆周率⁺S/G2/M期细胞。

HPC分析

在半固体培养基中对培养细胞进行HPC检测。³⁴简言之，将2500个细胞接种在含有1mL含有1.1%甲基纤维素、30%FBS、5×10的IMDM的重复培养皿中⁻⁵mol/L 2-巯基乙醇（干细胞技术），其中添加了SCF、TPO、IL-3、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），每种浓度为100 ng/mL，以及4 U/mL促红细胞生成素（Amgen）。在孵育12至14天后计数菌落。采集单个菌落并分析是否存在JAK2V617F系列使用嵌套AS-PCR³⁴以及使用上述FISH发现标记染色体异常JAK2V617F系列,CALR（校准）突变分析、细胞遗传学和FISH分析。”³²百分比JAK2V617F系列-然后确定阳性菌落或有染色体异常的菌落。

NSG重新填充细胞分析

非肥胖糖尿病（NOD）/严重联合免疫缺陷（SCID）/IL2Rγ^无效的（NSG）小鼠购自杰克逊实验室。所有实验都得到了ISMMS动物护理委员会的批准。MF SP CD34的相同编号⁺单元格（2.5×10⁵患者1或8-20×10⁵对于6-10名患者），在单独存在细胞因子或细胞因子+AZD1480（150 nM）的情况下培养3天。SP CD34的起始编号⁺根据原MF CD34选择每个MF患者的细胞，以确定AZD1480治疗对SP MF-SC的影响⁺之前实验中每个患者的细胞植入率（数据未显示）。培养后产生的细胞总数随后通过尾静脉移植到8-9周龄亚致死剂量（240 cGy）NSG小鼠中。移植后4或6个月，处死小鼠，并从受体小鼠的股骨、胫骨、肱骨和脾脏的骨髓（BM）中回收细胞。hCD45的存在⁺用单克隆抗体染色法检测细胞，流式细胞仪分析。以类似的方式分析从未接受人类细胞的小鼠中获得的细胞，以排除假阳性免疫染色的可能性。使用的单克隆抗体与小鼠细胞没有交叉反应。我们认为，如果人类CD45⁺在小鼠骨髓或脾脏中，细胞存在于≥0.1%的有核细胞中。

人CD45⁺通过单克隆抗体染色和Aria BSL2（BD）细胞分选分离受体小鼠骨髓和脾脏中的细胞（纯度≥95%）。这个JAK2V617F系列hCD45的等位基因负荷⁺接受SP CD34小鼠的细胞⁺2例粒细胞患者的细胞JAK2V617F系列如前所述，通过实时AS-PCR测定的等位基因负荷分别为90%和78%。^30,31选择的hCD45⁺接受SP CD34小鼠的细胞⁺用FISH对3例标记染色体异常患者的细胞进行分析。^32,33

蛋白质印迹

SP MF和CB CD34⁺电池（1×10⁵/mL）在细胞因子单独或细胞因子+AZD1480存在下培养4小时。然后用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物（Pierce Biotechnologies）对细胞进行裂解。使用4%至12%的Nu-PAGE双三凝胶（Invitrogen）分解蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）。膜被封闭，与指示的一级抗体（Abs）和辣根过氧化物酶（HRP）-结合的二级抗体（细胞信号技术）孵育，并使用增强化学发光系统（Pierce Biotechnology）检测。

AZD1480处理对MF-SP或PB-CD34的影响⁺细胞和HPC

SP或PB MF CD34⁺用细胞因子单独或细胞因子加AZD1480（150 nM）处理细胞3天，并进行表型表征。SP或PB MF CD34的治疗⁺单元格（1×10⁵)AZD1480导致总细胞的绝对数量减少，CD34⁺细胞，CD34⁺CD90型⁺细胞和CD34⁺CXCR4系列⁺与相同数量的SP或PB MF CD34相比⁺与细胞因子单独孵育的细胞（补充图1，参见血液网站）。接下来，我们评估了SP或PB MF CD34的反应⁺使用SP或PB-MF-CD34培养物中产生的各种细胞的绝对数量的比率⁺用细胞因子加AZD1480处理的细胞与仅用细胞因子处理的培养物中产生的细胞相比。如所示图2SP或PB MF CD34的治疗⁺含150 nM AZD1480的细胞减少了细胞总数CD34⁺，CD34⁺CD90型⁺和CD34⁺CXCR4系列⁺与单用细胞因子培养的细胞相比，细胞在很大程度上(P（P）至少<0.05）。此外，SP或PB MF CD34的治疗⁺含AZD1480的细胞数量减少相同(P（P）全部>.05）。这些发现表明SP和PB MF CD34⁺细胞对AZD1480处理的反应程度相似。

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图2

AZD1480处理同时抑制SP和PB MF CD34⁺细胞。SP或PB MF CD34⁺用细胞因子单独或细胞因子加AZD1480（150 nM）处理细胞3天，并进行表型表征。总细胞的绝对数量（A），CD34⁺细胞（B），CD34⁺CD90型⁺（C） 和CD34⁺CXCR4系列⁺SP或PB CD34培养后产生的细胞（D）⁺细胞暴露于细胞因子和AZD1480，与单独暴露于细胞素的培养物中产生的细胞相比*P（P）< .05; **P（P）< .01; ***P（P）<.001（n=10）。

接下来，我们评估了AZD1480对SP和PB MF-HPC数量的抑制作用。如所示图3A-BSP或PB MF CD34培养物中产生的可分析HPC、克隆形成单位-粒细胞巨噬细胞（CFU-GM）和爆发形成单位红细胞（BFU-E）的数量⁺与SP或PB MF CD34培养的细胞相比，暴露于细胞因子和AZD1480的细胞显著减少⁺仅含细胞因子的细胞（SP:CFU-GM和BFU-E，P（P）两者均<.001；PB:CFU-GM，P（P）< .001; BFU-E，P（P）< .01). 此外，在同等数量的SP或PB-MF-CD34处理后，观察到CFU-GM和BFU-E的数量减少的程度相似⁺带有AZD1480的电池(P（P）两者均>.05）。这些发现表明AZD1480同样能够抑制SP和PB MF-HPC。

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图3

AZD1480治疗导致SP和PB MF HPC减少。通过测定SP或PB MF CD34培养物中产生的菌落比例，评估AZD1480对SP和PB MF-HPC的抑制作用⁺在半固体培养基中用细胞因子或细胞因子加AZD1480处理的细胞。（A-B）SP（A）或配对PB（B）MF CD34培养物中产生的CFU-GM和BFU-E的百分比⁺用细胞因子加AZD1480处理的细胞与单用细胞因子培养产生的细胞相比**P（P）< .01; ***P（P）<.001（n=10）。（C-D）SP或PB MF CD34培养物中产生的JAK2V617F阳性（C）和JAK2V17F纯合（D）菌落的百分比⁺含有细胞因子加AZD1480或仅含细胞因子的细胞。随机抽取21至35个个体菌落，并对每对SP或PB MF CD34中是否存在JAK2V617F进行基因分型⁺在每种实验条件下培养4名患者的细胞标本。（E-F）SP或PB MF CD34培养物中产生的JAK2V617F阳性（E）和JAK2V17F纯合菌落（F）绝对数的百分比⁺用细胞因子加AZD1480处理的细胞与单独用细胞因子处理的培养物产生的细胞相比**P（P）< .01; ***P（P）<.001（n=4）。（G） SP或PB MF CD34培养物中产生染色体异常的菌落百分比⁺用细胞因子加AZD1480或单用细胞因子处理的细胞。随机抽取21至35个单个菌落，并对每对SP或PB MF CD34中是否存在染色体异常进行基因分型⁺在每种实验条件下培养的4名患者的细胞样本。（H） SP或PB MF CD34培养物中产生染色体异常的菌落百分比⁺用细胞因子加AZD1480处理的细胞与单独用细胞因子处理的培养物产生的细胞相比**P（P）< .01; ***P（P）<.001（n=4）。

来自4个的单个菌落JAK2V617F系列-MF阳性患者(JAK2V617F系列等位基因负荷：62%-90%）单独使用细胞因子或细胞因子加AZD1480治疗，并对其进行分析JAK2V617F系列.³⁴如所示图3C-D，治疗JAK2V617F系列-正SP或PB MF CD34⁺含AZD1480的细胞同样导致杰克2v617f-阳性菌落和JAK2V617F系列纯合菌落。然而，由于SP和PB MF CD34的治疗⁺含AZD1480的细胞导致CFU-GM和BFU-E的数量显著减少(图3A-B)，如所示图3E-F，绝对数量显著减少杰克2v617f-阳性和纯合菌落（SP:P（P）两者均<.001；PB公司：P（P）两者均<0.01）。

同样，尽管SP或PB MF CD34培养物中具有标记染色体异常的菌落百分比⁺暴露于细胞因子加AZD1480的细胞几乎与仅暴露于细胞素的培养物中的细胞相等(图3G)，AZD1480暴露后，具有标记染色体异常的菌落绝对数量显著减少(图3H). 这些数据表明，AZD1480治疗能够削弱MF-HPC的体外生成，从而导致恶性HPC数量的减少，但不能消除。

AZD1480对MF CD34的影响⁺单元格独立于JAK2V617F状态

MF患者对ruxolitinib的临床反应与他们的JAK2号机组突变状态。^23,24因此，我们研究了AZD1480对SP和PB CD34的作用⁺当JAK2V617F系列-负值和JAK2V617F系列-CD34阳性⁺对细胞进行了研究。如所示图4A-E，总细胞数，CD34⁺，CD34⁺CD90型⁺，CD34⁺CXCR4系列⁺当JAK2V617F系列-阳性或JAK2V617F系列-负极SP MF CD34⁺细胞暴露于AZD1480(P（P）全部>.05）。在以下两种情况下观察到类似的反应模式JAK2V617F系列-阳性或JAK2V617F系列-负极PB MF CD34⁺用AZD1480处理细胞(图4A-D、F;P（P）全部>.05）。此外，如补充图2所示，AZD1480治疗显著抑制SP和PB CD34⁺，CD34⁺CD90型⁺，CD34⁺CXCR4系列⁺细胞和患者7产生的HPCCALR（校准）突变（46-bp缺失）。这些发现表明AZD1480对JAK2V617F系列-积极的和JAK2V617F系列-消极的，以及CALR（校准）突变阳性SP和PB MF-HPC。

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图4

AZD1480对SP和PB MF CD34的抑制作用⁺单元格独立于JAK2V617F状态。（A-D）总细胞绝对数的百分比（A），CD34⁺细胞（B），CD34⁺CD90型⁺（C） 和CD34⁺CXCR4系列⁺细胞（D）在任何一种培养物中产生JAK2V617F系列-正极或负极SP或PB MF CD34⁺暴露于细胞因子和AZD1480的细胞与仅暴露于细胞素的培养物中产生的细胞数量相关。总细胞数，CD34⁺，CD34⁺CD90型⁺，CD34⁺CXCR4系列⁺两种培养物中的细胞数量均减少JAK2V617F系列-正极或负极SP或PB MF CD34⁺暴露于AZD1480的细胞。（E-F）通过以下两种药物的治疗，可检测HPC（CFU-GM，BFU-E）的数量也得到了类似的减少JAK2V617F系列-正或负SP（E）或PB（F）MF CD34⁺带有AZD1480的电池。P（P）全部>.05。JAK2V617F-正极和JAK2C617F-负极（每个n=5）。

AZD1480治疗对MF-NRC的影响

我们通过移植SP MF CD34来检测AZD1480对SP MF-SC的影响⁺6名患者的细胞单独或细胞因子加AZD1480处理后进入NSG小鼠。因为SP CD34的植入能力⁺每个患者的细胞差异很大，我们首先对人类细胞嵌合的程度（hCD45的百分比）进行了统计分析⁺细胞）在小鼠接受等量SP MF CD34培养物产生的总细胞⁺单个患者的细胞单独暴露于细胞因子和细胞因子加AZD1480。如所示图5A-B移植后4或6个月，hCD45的数量相似⁺在接受SP MF CD34的受体小鼠的骨髓和脾脏中均检测到细胞⁺单用细胞因子或细胞因子加AZD1480治疗的细胞（每个患者：P（P）全部>.05）。接下来，我们通过分析相对hCD45来确定AZD1480对SP MF NSG再增殖细胞（NRCs）的影响⁺接受细胞因子加AZD1480处理的小鼠与接受细胞因子单独处理的小鼠之间实现了细胞嵌合。同样，如所示图5C，AZD1480治疗并未导致hCD45的减少⁺在受体小鼠的骨髓或脾脏中实现了细胞嵌合。此外，hCD45⁺从这些小鼠的骨髓和脾脏中采集并分离细胞，并对其进行分析JAK2V617F系列或标记染色体异常。年略有下降（9%和7%）JAK2V617F系列hCD45的等位基因负荷⁺SP10 CD34移植小鼠的骨髓和脾脏中观察到细胞⁺分别用AZD1480处理的细胞与用SP10 CD34移植的小鼠中观察到的细胞相比较⁺单用细胞因子治疗的细胞(表2). 如所示表2，hCD45的数量相似⁺SP7 CD34移植小鼠骨髓和脾脏分离的细胞⁺细胞中含有标记染色体异常。此外，所有人类BM CD45⁺SP8 SP CD34移植小鼠的细胞分离⁺单用细胞因子或细胞因子联合AZD1480处理的细胞具有标记染色体异常(表2). 这些发现表明JAK2抑制剂治疗不会影响恶性SP MF-SC。令人惊讶的是，没有hCD45⁺移植SP9的小鼠骨髓和脾脏中的细胞被观察到携带JAK2V617F系列或染色体异常(表2)，存在于原发性CD34中⁺细胞，表明正常NRC或恶性NRC缺乏JAK2V617F系列或者标记染色体异常是导致本例供体细胞嵌合的原因。

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图5

AZD1480治疗对MF-NRC的影响。（A-B）SP-MF造血细胞移植的程度由hCD45的百分比表示⁺NSG小鼠骨髓（A）和脾脏（B）中检测到的细胞。P（P）每名受试者均>.05（n=6）。横条表示hCD45百分比的平均值⁺NSG小鼠骨髓和脾脏中的细胞。（C） 相对hCD45⁺接受SP-MF-CD34的小鼠骨髓和脾脏实现细胞嵌合⁺细胞因子联合AZD1480处理的细胞与接受细胞因子单独处理的小鼠的细胞相同。骨髓和脾脏：P（P）>0.05（n＝6）。

这项工作得到了国立卫生研究院国立癌症研究所（1P01CA108671；R.H.）的资助。