现在，许多生物过程都可以通过超分辨荧光显微镜技术进行可视化。然而，基于定位的技术主要依靠固定或缓慢移动的样本来收集结构信息。通过牺牲最初使显微镜成为如此强大工具的因素，这些超分辨率技术通常可以获得10倍的分辨率提升：即对活细胞成像的能力。在受激发射损耗成像的情况下，与该技术相关的扫描方法在成像整个细胞区域时可能无法检测到更快的分子事件。
结构照明显微镜（SIM）是这些方法的替代方法(1). 它将传统荧光显微镜的分辨率提高了两倍；它的优点是使用宽场系统，以相对较低的激光功率提供对整个细胞的快速采集速度；它与标准荧光灯兼容。通过使用物理光栅从激光器产生干涉图案，可以产生周期性照明。这种图案照明使来自更高空间频率的信息被向下调制（即移位）到透镜的光学传递函数（支持区域），从而捕获比通常获得的更高分辨率的空间信息。
为了量化细胞内分子的定向运动，时空图像相关光谱（STICS(2))已应用。STICS利用空间图像的时间相关性，通过相关函数测量滞后帧中像素与周围像素的相似性。相关函数提供关于流速和方向性的信息，同时通过固定对象过滤器对静态结构进行折扣，通过减去像素强度的移动平均值来实现。
T细胞和抗原呈递细胞之间免疫突触的形成需要许多动力学过程(三)和细分受限的聚类事件(4–6)发生。肌动蛋白的聚合对于细胞在其靶抗原呈递细胞上的扩散至关重要(7)以及细胞移动和迁移(8). 在突触形成T细胞的基底膜上观察到密集网状的皮质肌动蛋白逆行流动，它可能在质膜上信号分子的圈闭和聚集中起作用(9)以及迁移细胞的前沿(10). 丝状肌动蛋白是一种非常动态的(7)，密排，薄（7-nm）结构(11,12).
在这里，我们对在全内反射荧光（TIRF）显微镜系统上采集的SIM数据执行STICS，该系统产生75纳米深度的消逝场用于激发。据我们所知，这是首次使用宽场显微镜在亚分辨率长度尺度上量化分子动力学的图像相关方法的演示。为了证明这项技术，我们分析了CD4中的二维肌动蛋白流+免疫突触形成过程中的T细胞，在涂有特定抗体的盖玻片上的抗原T细胞受体交联后进行。
一显示了TIRF SIM设置的示意图。激发光（488 nm）通过偏振模块，然后通过相位块，产生衍射光束。然后通过衍射滤光片模块隔离−1级和+1级激光束。这些一阶激光束以一定角度穿过物镜，以在玻璃-水界面上产生全内反射条件。两个渐逝波干扰样品，产生结构化照明。然后，该装置通过三个方向产生横向和旋转位移，产生九个原始图像，其中包含的空间频率高于标准光学显微镜物镜通常可以获得的空间频率。
b条显示了从TIRF SIM获得的更高分辨率。所示为所收集的傅里叶频率与传统显微镜的频率相比(红色虚线). 还使用稀疏的100-nm直径荧光珠测量分辨率。
c（c）显示了这些珠子的放大图像，从中可以获得线条轮廓(黄色箭头). 此轮廓一半最大处的全宽(
d日)给出了120nm系统的横向分辨率。
(一)TIRF SIM设置示意图。(b条)通过傅里叶变换证明采集频率的空间分辨率加倍(叠加红圈演示规则的空间频率限制）。(c（c）)100-nm珠子的SIM重建图像（比例尺0.5μm） 。(d日) (绘制的线条)珠子显示全宽，最大半宽为120 nm。
然后，我们应用STICS分析来量化使用TIRF SIM获得的T细胞突触中的肌动蛋白流().
一显示了STICS分析的示意图。从原始数据中，首先通过减去像素值的移动平均值来过滤不动对象。矢量图是根据Hebert等人之前发表的时间序列相关分析获得的。(2)和Brown等人。(13).
b条显示了一个成熟T细胞免疫突触的重建TIRF SIM图像，代表了从1.28 fps的时间序列中获得的时间点（参见电影S1在中支持材料). 从该重建图像中，选择了两个具有代表性的区域。在这些区域中，伪彩色肌动蛋白流动载体被覆盖在荧光强度图像上。这些震级范围为0.01μ米/分钟(蓝色)至5.61μ米/分钟(红色). 可以观察到，所有的流动矢量都径向指向突触中心。此流的直方图如所示
c（c）直方图显示峰值逆流速度为1.91±1.27μm/min。这些数据代表了n个=TIRF SIM成像的7个T细胞突触。
(一)STICS分析，通过移动平均滤波器将移动结构与固定结构隔离(我)并将像素子集合并为超像素块(ii（ii）); STICS软件通过时间关联空间荧光波动(三). 然后，该代码输出矢量图，显示方向性和流速。(b条)接触刺激盖玻片5分钟后，T细胞肌动蛋白流动的TIRF SIM图像。(缩放区域)在突触外围逆行肌动蛋白流动。(c（c）)T细胞突触载体流速统计直方图(n个= 7).
方法
Jurkat T细胞在添加10%FCS和1%青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中培养，37°C，5%CO2大气。成像前24小时通过电穿孔将LifeAct-EGFP转染细胞。T细胞在37°C的1×HBSS中重新悬浮，补充20 mM HEPES，并在用特定抗体刺激后刺激产生免疫突触(αCD3和αCD28；BioLegend，San Diego，CA和BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ）固定在1.0号盖玻片底皿上（Labtek，Brendale，Queensland，Australia）。在成像之前，让突触在37°C下成熟5-10分钟。
TIRF SIM成像是在N-SIM系统（日本东京尼康）上进行的，该系统采用100×1.49 NA油浸物镜，使用488 nm激发激光以1.28 fps的速度成像3-5分钟。所有细胞在37°C下成像。SIM图像在ANALYZE软件（尼康）中以30 nm的像素分辨率重建，照明调制对比度和高分辨率噪声抑制均设置为1。
使用MATLAB软件（0.29版；马萨诸塞州纳蒂克的MathWorks；http://wiseman-group.mcgill.ca/). 通过从每个子区域图像中减去21帧的平均帧来过滤不动物体。矢量图是通过将8×8像素组合成一个超级像素来生成的。这些装箱像素移动1个像素以生成下一个矢量。最大延迟时间设置为20张图像。
结论
超分辨率荧光显微镜正成为越来越受欢迎的生物研究工具，但并非所有技术都与活细胞成像和动力学测量完全兼容。在这里，我们已经证明，TIRF SIM成像可以与STICS分析相结合，以量化活细胞亚分辨率长度尺度上的分子动力学。对于SIM数据，图像分辨率达到了120 nm，这使得可以生成网格间距为30 nm的流矢量图，每个矢量都是使用240-nm平方区域的数据生成的。我们将此方法应用于分析T细胞免疫突触处的肌动蛋白流，该突触是针对激活的、抗身体涂层的盖玻片形成的。
使用我们的方法，我们发现即使在成熟的突触中，突触外围的皮质丝状肌动蛋白（即dSMAC）也逆行流向细胞中心（即cSMAC）。这与之前通过波形记录仪和传统分辨率显微镜对肌动蛋白流的分析一致(7,14)也显示出逆流，但空间分辨率降低。我们的分析表明肌动蛋白的流动部分的速度为～0.5–4μ米每分钟，再次与之前的数据一致。
该技术的局限性包括TIRF照明，由于消逝波的深度，需要在盖玻片附近放置一个平坦的样品。这是必需的，因为STIS分析假设为二维分子流。重建的SIM图像需要九张原始图像（基于50毫秒曝光时间，帧速率限制为≈1s）。
荧光显微镜的非侵入性和活体细胞相容性是该技术如此广泛的部分原因。并非所有超分辨率成像技术都具有这些优势。我们相信，活细胞TIRF SIM和图像相关方法的结合将是在亚分辨率长度尺度上量化分子流的有力工具。
