记忆巩固和长期增强(LTP)需要蛋白质合成(1,2). 因此,重要的是要弄清蛋白质合成是否可以在单个突触水平上调节突触可塑性,以及它如何影响突触结构。突触后N-甲基的强烈刺激可立即诱导与LTP相关的脊柱增大-d日-CA1锥体神经元中天冬氨酸(NMDA)敏感的谷氨酸受体(传统方案)(三–5). 即使在没有突触后棘突的情况下,也可以诱导脊椎扩大(三)虽然,如果突触刺激后紧跟着突触后棘波(一种棘波计时协议),会诱导出一种更强大的LTP形式,它在神经元网络的发展和学习中起着重要作用(6). 在大鼠脑切片中,我们使用谷氨酸的双光子去盖技术,检测了单棘刺激诱导的树突状棘的结构可塑性(7)在CA1锥体神经元中没有或存在突触后棘波(uncasing是一种生物惰性前体的光释放)。
切片培养的CA1锥体神经元用含有荧光染料Alexa594(50μM)和β-肌动蛋白(5μM)的溶液进行全细胞灌注(8). 后一种蛋白质被包括在内,因为我们发现它延缓了可塑性的丧失(三) (图S1和支持在线文本). 我们检测到棘头体积(ΔV)显著增加(>50%)H(H))在大多数(41个中的37个)小脊髓中,通过重复(1 Hz下80次)的4-甲氧基-7-硝基吲哚基(MNI)谷氨酸去壳刺激,在20 ms内与突触后棘波配对(棘波计时协议或去壳加棘波)(). 重复的谷氨酸去盖作用(1.6±6.6%,n=9个脊髓,在镁的存在下)不会导致脊髓扩大2+)或单独使用峰值(-3.0±2.6%,n=54)。当峰值在开盖后>50ms触发时,也未诱发(3.9±3.4%,n=10)。脊髓扩大仅限于受刺激的脊髓;它没有扩散到相邻的脊椎(). NMDA受体阻滞剂d日(–)-2-氨基-5-磷酸(AP5,50μM)可防止无盖加棘波诱发的脊柱扩大(n=9)()以及常规放大(三)由镁中无尖峰的非时效引起2+-自由溶液() (8). 随后的实验是用小脊柱(VH(H)<0.1微米三),其中大多数(95%)因无冠加棘波而扩大(图S2). 这种增大与突触后谷氨酸敏感性增加有关(图S3、A至D).
海马薄片培养中CA1锥体神经元单个确定的脊髓突触后棘波应用或不应用谷氨酸开盖诱导的脊髓头部扩大。(一个和E类)在没有茴香霉素(A)或存在茴香霉碱(E)的情况下,在时间0通过不加套管加尖峰刺激的脊椎的时间-z积分(z-stack)图像。箭头表示MNI-谷氨酸双光子非电离斑点;开放符号表示相邻的脊椎。(B类和F类)ΔV变化的时间过程H(H)分别用于(A)和(E)中所示的受激(实体符号)和相邻(开放符号)棘。(C类和D类)ΔV变化的平均时间过程H(H)对于在没有AP5(实心圆圈)或AP5存在(实心正方形)的情况下,通过无盖加(C)或无(D)尖峰刺激的脊椎。开放圆表示在没有AP5(开放圆)的情况下来自相邻脊椎的数据。在Mg中进行无尖峰开箱2+-自由溶液。数据为平均值±SEM(n=10至27个脊柱)。(C)和(G)中显示的控制迹线是在用于试验的同一批切片制剂中进行的27次试验的平均值。(G公司和H(H))在缺乏(圆形)或存在茴香霉素(红色方块)或环己酰亚胺(绿色三角形)的情况下,通过无盖加(G)或无(H)尖峰刺激的脊椎的棘头体积变化的平均时间过程。数据为平均值±扫描电镜(n=7至27棘)。
我们发现无刺加棘波诱导的脊柱扩大与无刺无刺诱导的脊柱增大之间存在关键差异(,,). 首先,前一方案导致了第二个长期阶段()不同于后者(). 总ΔVH(H)在60分钟的记录时间后,明显值为132±22%(n=27)()与无尖峰情况下的45.7±9.6%相比,无尖峰条件下的无尖峰(n=20)(). 在脊椎诱发的谷氨酸诱导电流振幅增加方面也存在类似差异,为162±38%(n=12)(图S3B)无卡套管加或不加卡套管时为36±7%(n=9)(三)分别为峰值。较大的长期扩大并不仅仅归因于刺激强度,因为无盖加尖峰产生的即刻扩大(67.5±11.2%,平均值±SEM)()比不带尖峰的去盖诱导的小(三)(92.4±10.7%,P<0.01)().
谷氨酸去盖加或不加突触后棘突诱导的脊髓颈可塑性。(一个和B类)带(A)或不带(B)尖峰的MNI-谷氨酸盐去盖前后的脊椎图像。箭头表示脊椎颈部。(C类)在没有山莨菪碱(黑圈)或有山莨菪素(红色方块)的情况下,通过不加钩环加棘突或不加钩链(蓝色圆圈)引起的脊柱长度变化*P<0.05,**P<0.01(Mann-Whitney U检验)。(D) 棘颈荧光强度增加与ΔV的相关性H(H)由无盖正(黑圈;Spearman相关系数=0.37,P=0.013)或无(蓝圈,P=0.16)尖峰引起。数据对应于在最大脊柱头部增大时观察到的增加。(E类和F类)在缺乏或存在茴香霉素的情况下,通过无盖加(E)或无(F)峰刺激的脊椎的棘颈荧光强度变化的时间进程。数据为平均值±SEM(n=10至41个脊柱)。
脊柱头部逐渐长期扩大对BDNF-TrkB信号的依赖性。(一个到F类)BDNF-TrkB信号传导抑制剂的作用,包括K252a[(A)和(B])、TrkB[(C)和(D)]抗体和TrkB-Fc[(E)和(F)]对谷氨酸去钙加上[(A,(C),和(E)]或不加[(B),(D),和。控制轨迹是在用于测试实验的同一批切片制备中分别进行的14次和20次无刺和无刺实验的平均值。(G公司和H(H))在不存在(对照)或存在蛋白质合成抑制剂或BDNFTrkB信号传导的情况下,在不加套管加(G)或不加(H)峰的情况下开始40至60分钟后测得的脊柱头部平均增大。所有数据均为平均值±SEM(n=8至20个脊柱)***P<0.001与相应的控制值(Mann-Whitney U检验)。NS,不显著。
脊椎头部逐渐扩大的长期阶段完全依赖于蛋白质合成。用蛋白质合成抑制剂茴香霉素(n=10个棘)或放线菌酮(n=8个)预处理海马脑片可消除该第二相()不会对直接阶段产生实质性影响(). 茴香霉素还阻断了谷氨酸诱导的受刺激脊髓电流大小的逐渐长期增加(图S3、E和F). 相反,不带棘突的去盖引起的脊柱增大不受茴香霉素的影响(n=11)(和图S4、C和D)或环己酰亚胺(n=7)。即使重复刺激次数进一步增加(高达80倍,n=18),情况也是如此。
松开加上棘突通常会导致脊椎长度缩短或脊椎抽搐(和). 41个脊椎中有23个脊椎明显缩短(平均值=–9.9±3.2%)()在剩下的脊椎中,它似乎被脊椎头部的扩大所抵消。相比之下,在没有刺突的情况下,很少(20个中有2例)因未结扎而引起脊柱抽搐(和图S4A); 相反,由于脊柱头部扩大,这种脊柱通常会拉长(6.7±4.9%)(). 为了检测脊柱颈的可塑性及其时间进程,我们测量了脊柱颈的荧光强度(8),因为很难清楚地描绘出脊椎颈,尤其是当脊椎抽搐时。我们检测到无盖加棘波产生的棘颈荧光显著增加(128±19%,平均值±SEM,n=41)()但无尖峰的去盖产生的荧光要少得多(43±12%,n=20)。脊髓颈荧光的增加与ΔV的增加无关H(H)无尖峰开盖()这表明,棘颈荧光的增加并不仅仅代表了棘头的增大。棘颈荧光的增加与棘头增大逐渐平行(和)并被茴香霉素抑制(和)脊椎抽搐(2.0±1.9%)(). 相反,在没有刺突的情况下开盖引起的颈部荧光的较小增加不受樟柳霉素的影响(). 脊椎抽搐可能涉及脊椎器械(9)和脊椎颈部的翻译机构(10,11)用于蛋白质合成依赖性的棘头扩大。
经证明,LTP的后期阶段需要BDNF(12–14),尽管此要求的性质因感应协议而异(15–18). 因此,我们研究了BDNF是否在无盖加棘波诱导的渐进性长期脊柱增大中发挥作用。K252a(200 nM)是一种酪氨酸激酶抑制剂,可阻断BDNF-TrkB信号传导,可消除脊柱头部的长期增大(n=13)()而它对无盖脉冲引起的即刻增大没有影响()或无尖峰(n=15)(). 抗TrkB抗体(n=9)也能阻止脊柱头部的长期扩大(),而相同的抗体不影响由未封端加尖峰诱导的立即扩增()或无尖峰(n=8)(). 由于TrkB-Fc融合蛋白作为BDNF的清除剂(n=10)也能消除脊椎头部的长期增大,因此,由无盖加棘突诱导的TrkB活化依赖于BDNF分泌(). 同样,没有尖峰的非去盖诱导的即刻棘头增大在很大程度上不受清道夫的影响(n=10)(). 此外,K252a(TrkB抗体或TrkB-Fc)可消除非激活加尖峰诱导的棘颈荧光增加(图S5). 因此,脊柱结构的逐渐长期可塑性强烈依赖于BDNF的内源性分泌,并且这种分泌需要突触后棘突。
最后,我们研究了外源性BDNF是否能够替代突触后棘突,诱导蛋白质合成依赖性的棘头扩大。低浓度(20 ng/ml)BDNF在浴中的应用本身并不会导致脊椎扩大(n=30)()或内向电流(0.5±1.2 pA,n=5)() (19,20). 然而,与在没有BDNF的情况下观察到的结果相比,在有BDNF(20 ng/ml)的情况下,无尖峰的去盖导致了长时程棘头增大(n=16)的显著增强(n=20)(、和支持联机文本). BDNF还诱导脊髓颈荧光逐渐增加(110±21%,P<0.05)(). BDNF对受刺激的脊椎具有选择性作用,对邻近脊椎没有观察到这种作用(n=16)(),并被茴香霉素阻断(n=11)(). BDNF因此诱导了额外的棘头增大,这取决于蛋白质合成,并对受刺激的棘具有特异性。即使在刺激偏移后0.5分钟(n=17)施用BDNF,也能诱导脊柱头部扩大,但在刺激后10分钟施用BDNF10时,BDNF并不能诱导脊柱头部增大(n=10)(). 外源性BDNF并没有进一步增加非去盖加棘突诱导的棘头增大(n=6)(),表明有足够量的BDNF在突触刺激与突触后棘波配对时释放。即使存在BDNF(n=9),茴香霉素也能阻止无盖加棘突诱导的棘头扩大()表明BDNF的作用需要蛋白质合成。
外源性BDNF对脊柱可塑性的影响。(一个和B类)BDNF(蓝条)对ΔV的影响H(H)(A) 和全细胞电流(B)。(A)中的数据代表ΔVH(H)相对于时间0,为平均值±SD(n=30个脊椎)。(C类)在BDNF存在的情况下,谷氨酸去钙化刺激的脊椎的时间跨度z堆栈图像没有峰值。箭头表示MNI-谷氨酸双光子去壳点。(D类)ΔV的时间进程H(H)对于在没有BDNF(黑色圆圈)或BDNF单独存在(实心蓝色方块)或与茴香霉素(红色方块)一起存在的情况下,通过不带尖峰的去盖刺激脊髓。还测定了BDNF对邻近脊髓(开放蓝色方块)的影响。数据为平均值±SEM(n=11至20个脊椎)。(E)在突触刺激抵消后的指定时间段内(0分钟),在BDNF不存在或存在的情况下,通过无尖峰的去套扎诱导的棘头增大。数据为平均值±SEM(n=10至20个脊椎)*与对照值相比P<0.05(Mann-Whitney U检验)。(F类)如(D)所示,在缺乏或存在外源性BDNF和茴香霉素的情况下,通过无盖加棘波诱导的脊柱增大。
我们已经证明,突触刺激与突触后棘波相结合会导致脊椎头部逐渐长期扩大,这是由BDNF介导的,并且依赖于蛋白质合成(图S7). 相反,单靠突触刺激不足以触发BDNF分泌(图S7)即使它诱导细胞内钙浓度显著增加2+]我}(>10μM)的脊椎通过NMDA受体(21). 因为BDNF的分泌不是由1-Hz的尖峰序列单独诱导的(22,23)我们的数据表明,这种神经营养素的分泌对突触输入和突触后棘波的同步性作出反应。考虑到这种同步事件只会导致钙的短期流入2+在每个峰值(<2μM)期间通过NMDA受体(24,25)突触后棘波在BDNF的胞吐中起关键作用;例如,涉及[Ca2+]我通过电压门控钙增加树突轴2+频道。因此,BDNF的分泌受到神经元网络中相关活动的精细调节,并可能通过自分泌或旁分泌机制巩固附近受刺激的突触。BDNF对显示立即增大的脊椎具有选择性作用,这可能是选择性捕获的结构标签(26)蛋白质合成机器(11,27)以及可塑性蛋白的捕获(2,28)用于长期的脊椎扩大。因此,BDNF充当巩固突触可塑性的联合信使,而蛋白质合成过程可以在单棘水平调节树突状结构。