据推测，记忆是通过细胞机制如长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）改变突触强度来编码的1然而，这些突触过程和记忆之间的因果关系很难证明2这里我们展示了恐惧条件作用三–8LTD和LTP分别可以使联想记忆失活和重新激活。我们首先调节一只动物，使其将脚震与针对杏仁核的听觉输入的视觉基因刺激联系起来，杏仁核是已知的恐惧调节所必需的大脑区域三–8。随后将LTD条件反射的光遗传传递给听觉输入，使电击记忆失活。最后，随后将LTP条件反射的视觉基因传递给听觉输入，重新激活了对电击的记忆。因此，我们利用LTD和LTP设计了记忆的失活和再激活，支持这些突触过程和记忆之间的因果联系。
为了研究突触可塑性与记忆之间的关系，我们使用线索-线索条件反射三–8在大鼠中，中性条件刺激（CS），例如音调，与厌恶性非条件刺激（US）配对时，会产生音调驱动的条件反应（CR），表明对厌恶性刺激的记忆。暂时（但不是非临时）将音调与震撼搭配，产生了稳健的CR（减少了对之前学习到的提示杠杆压力任务的杠杆压力9;)在随后的测试中，仅使用音调（参考。三–8,). 为了研究这种联想记忆的突触基础，我们用来自听觉核团的外侧杏仁核神经输入的光遗传刺激来代替音调。我们注射了一种腺相关病毒（AAV），该病毒表达光敏通道ChR2（oChIEF）的变体，可以在50–100 Hz的刺激下进行10，进入内侧膝状体核和听觉皮层(). 通道到达外侧杏仁核的轴突终末后()，在外侧杏仁核的背端放置了一个允许光线传输的插管(). 光CS单独（2分钟10 Hz 2 ms脉冲序列，见方法）对杠杆按压没有影响(). 然而，暂时（但不是非暂时）将光学CS与脚部电击（参见方法）配对会导致CR()对消亡敏感（见下文），并在条件反射期间被NMDA受体抑制所阻断()，表示关联存储器的生成。
用音调或光遗传学进行恐惧调节一，顶部，条件反射期间大鼠接受音调和电击的示意图。暴露于未配对（N=5，中间）或临时配对（N=5，底部）色调和电击的大鼠在一天后通过色调（绿色）进行测试。时间曲线：对之前学习的提示杠杆按压任务的杠杆按压次数（1分钟箱子）进行标准化。条形图：在音调的第一分钟内，标准化的杠杆按压次数。b、，上图为大鼠在条件反射期间接受光基因驱动输入（ODI）刺激和电击的示意图。大鼠（N=8）接受未配对（中间）和一天后临时配对（底部）ODI和休克。时间图如所示a、，除动物通过10Hz ODI（蓝色）测试外。条形图如所示一对于10 Hz ODI。c（c），顶部，实验设计；在−60 mV（蓝色）、+40 mV（红色）和0 mV下获得的平均光驱动突触反应，这些反应对接受非成对（顶部）或成对（底部）条件反射的动物的细胞保持电位。对痕迹进行缩放以匹配NMDA介导的电流。条形图绘制平均AMPA/NMDA（无条件，2.4±0.2，N=11；非配对条件，2.1±0.2，M=10；配对条件，4.4±0.6，N=8）。比例尺，100 pA，50 ms，1 mm.d，Synaptic修改模型。音调（左）或ODI（右）与电击输入到杏仁核外侧神经元的时间配对导致音调（右）或ODI-输入增强，这可能有助于触发CR。这里和整个过程：NS，无意义；*，p<0.05；**，P<0.01；误差条，SEM。有关详细信息，请参阅方法。
检查光学CS与足震配对后是否发生LTP(，参考三–8)，我们从接受未配对、配对或无条件反射的动物身上制备了杏仁核脑片，并测量了光驱动突触反应的AMPA受体成分（A）和NMDA受体成分（N）(). 在接受配对条件反射的动物中，A/N比率增加，表明LTP已经发生11,12在外侧杏仁核神经元的光驱动输入。
记忆能被激活吗？如果LTP发生在外侧杏仁核的光驱动突触上，并且这种LTP有助于记忆的形成，用LTD逆转LTP（参考文献13,14)应该会使记忆失效。配对光学CS-休克条件处理后显示CR的动物暴露于光学LTD协议（见方法）。一天后，用光学CS测试动物，但没有显示CR，表明LTD使休克记忆失活(). 记忆可以重新激活吗？我们为这些动物提供了光学LTP协议（见方法）。一天后，动物们展示了CR()，表明记忆重新激活。突触能够经历多轮双向塑性13我们因此交付了第二个光学LTD协议；第二天，动物没有产生CR()，表示内存重新激活。随后的光学LTP调节恢复了CR(和)指示内存重新激活。LTD和LTP条件反射的行为效应快速且持久(). 这些实验表明，光学CS-触发休克记忆的一个必要成分可以被LTD失活，而被LTP激活。
LTD停用，LTP重新激活内存在ODI和休克成对调节两天后，对一组大鼠（N=12）进行CR测试（a）.图如中所示试验结束后，动物接受光学LTD方案，并在一天后进行CR测试（b）试验后，动物接受光学LTP方案，并在一天后进行CR测试（c）试验结束后，动物接受另一种光学LTD方案，并在一天后进行CR测试（d）试验结束后，动物再次接受光学LTP，并在一天后进行CR测试（e） ●●●●。f、，标准化杠杆在不同协议（如图所示）后将一分钟压入光学CS。克，外侧杏仁核发生突触修饰的细胞模型可能有助于向ODI提供LTD（左）或LTP（右）协议后的行为反应。
在上述实验中，LTP是否恢复了对电击的记忆？或者，LTP条件反射仅仅增强了随机输入，而随机输入足以驱动外侧杏仁核神经元，从而减少杠杆压力？也就是说，通过LTP协议生成CR是否需要预先进行光学CS-shock配对？事实上，LTP协议仅在之前接受过光学CS-电击条件反射的动物中产生CR(). 这些结果支持LTP重新激活由光学CS-休克配对形成的记忆，并被LTD钝化的观点。
LTP仅在先前的成对条件反射后产生条件反射一群幼稚的动物(a、，N=4）在LTD方案后一天进行CR测试(我)，后续LTP协议后一天(ii（ii）)，在随后的配对光学CS电击调节后一天（iii），后续LTD协议后一天(iv（四）)以及后续LTP协议后一天(v（v）).不及物动词，按照指定的协议，标准化杠杆图在一天内将一分钟压入光学CS。一组独立的幼稚动物(b、，N=5）在LTP方案后一天进行CR测试(我)，成对光学CS-休克调理后一天(ii（ii）)，后续LTD协议后一天(三)以及后续LTP协议后一天(iv（四）).v、，按照指定的协议，标准化杠杆图在一天内将一分钟压入光学CS。请注意，只有在先前的配对条件作用之后，才能看到CR遵循LTP协议。
为了证实测试和条件刺激产生了预期的突触效应，我们在麻醉大鼠的外侧杏仁核中进行了在听觉区域表达oChIEF的体内记录（见方法）。在记录部位的短暂光脉冲产生体内场反应（类似于杏仁核脑片中的视觉诱发反应；)不受光学CS的影响，受光学LTD调节的抑制，并受光学LTP调节的增强(;). 这些结果证实了用于干扰行为的突触刺激调节协议，以预期的方式修改了突触。
10Hz、LTD和LTP协议的体内电生理反应a、 b、c、，左侧杏仁核外侧区对单一光刺激的活体内场反应（平均20个反应）显示了条件反射方案。指示刺激前后现场EPSP斜率（归一化为基线期）的单个实验（中间）或10个实验的平均值（右侧）的绘图。处理后30–40分钟的平均基线标准化值：10 Hz，102.2±5%；1赫兹，82±8%；100赫兹，118±9%。比例尺，1 mV，10 ms。
为了进一步研究这些突触刺激条件反射协议和记忆过程之间的关系，我们测试了这些协议对听觉线索-听觉条件反射的影响。我们首先询问了光学LTD是否可以使色调诱导的恐惧条件反射失活。在两组幼稚动物中，我们用AAV-oChIEF感染了单侧听觉区域，并用药物切除了对侧杏仁核（见方法）。一组动物接受了与电击相匹配的音调，这导致了音调诱发的CR(). 第二组动物接受了相同的音调，并立即进行电击调节，随后执行光学LTD协议。第二组患者的声调诱发CR显著降低(); 随后没有光学LTD协议的声调调节产生了声调诱发CR(). 这一结果与一种记忆模型相一致，在这种模型中，音调条件作用在听觉输入到外侧杏仁核时诱导LTP，随后在这些突触处的LTD逆转LTP，从而使记忆失活。
光学LTD协议显著降低听觉恐惧条件反射；光学LTP不能逆转听觉消光单独的动物组暴露于(一)配对音调和电击调节（N=5），或(b条)根据光学LTD协议对音调和冲击条件进行配对，然后用音调（绿色）测试CR。c中，显示的动物(b条)随后暴露于配对色调和电击条件下，并进行CR测试。日期：，光学LTD显著降低听觉恐惧条件反射。e中，显示的动物(c（c）)暴露于听觉消退方案并测试CR；f、，动物接受光学LTP和CR测试。克，光学LTP并没有逆转听觉消退。一组天真的动物（N=5）接受了成对的光学调节，并进行了CR测试(小时); 然后接收光学消光协议（参见方法）并测试CR(我); 然后接收光学LTP协议并测试CR(j个).k、，光学LTP并没有逆转光学消光。
接下来，我们研究了消光，这是一个反复接触CS（在没有US的情况下）导致CR降低的过程。光学LTP能逆转音调调节的消光吗？动物接受了音调调节和消退协议（见方法），消除了CR（图6e）。光学LTP协议的传递并没有产生CR（图6f，g），这与消亡不是成对条件作用期间增强的突触减弱的观点一致14类似地，接受成对光学CS电击条件处理的动物产生了一个CR，该CR可以通过重复暴露于光学CS（参见方法）而消除，而光学LTP并没有恢复CR（图6h，i，j，k），再次证明灭绝不是LTD。
先前的研究检查了LTP、LTD和记忆之间的关系，采用了药理学（例如参考文献。15)或遗传（例如参考文献16,17)干扰和演示细胞和行为过程之间的相似性的操作。其他研究测量了记忆形成所需区域的随机取样点，以检测记忆形成后生物化学和突触传递的变化18–21然而，在这些研究中，对用于形成记忆的突触进行选择性扰动是不可能的。在这里，通过光学隔离可用于形成联想记忆的神经输入，我们可以选择性地操纵由该输入驱动的突触，并直接评估细胞和行为过程之间的关系。
如A/N增加所示，在外侧杏仁核视基因输入形成联想记忆产生LTP。这种LTP似乎是必需的，因为传递LTD条件刺激可以有效地逆转LTP，从而消除视基因输入诱发记忆的能力。此外，随后将LTP条件刺激传递到视基因神经输入恢复了CR。我们的数据支持这样的观点，即LTP已经重新激活了厌恶刺激的记忆，因为在没有事先形成记忆的情况下传递LTP协议不会引发CR。我们的发现表明，通过激活选定的输入而形成的厌恶事件的记忆可以通过条件反射协议来关闭和打开，条件反射协议在这些输入处产生双向突触可塑性，从而加强了突触可塑性和记忆形成之间的因果关系22.
值得注意的是，幼稚动物的光学LTP并没有产生CR；而在这些动物中，光学LTP在光学CS-休克配对和光学LTD后确实产生了CR。这一结果表明，听觉输入对外侧杏仁核的非特异性增强不足以产生CR。这可能是对输入子集的特异性增强，据推测，这些神经元也被脚部电击激活，是产生条件反应所必需的。此外，光学CS与冲击的配对可能会产生产生CR所需的额外修改（不仅仅由光学LTP产生）23–26因此，杏仁核听觉输入的LTP可能是必要的，但不足以产生联想记忆。
我们的研究补充了最近的研究，这些研究利用光遗传学来研究神经元集合如何代表记忆27–29在这些研究中，没有检查突触机制。我们的研究表明，LTP用于形成代表记忆的神经元集合。此外，我们的研究结果预测，LTD可以被用来分解它们，从而使记忆失活。
行为分析
培训
对大鼠进行训练，使其联想到杠杆按压以获得奖励（每次杠杆按压40μl 10%蔗糖）。在训练期间，大鼠被限制饮水时间表（每天自由饮水2小时）。培训环境是一个模块化操作测试室（12.5×10×13英寸），不锈钢格栅地板和开放式屋顶位于消声隔间内（弗吉尼亚州圣奥尔本市Med Associates）。试验室配备了一个可伸缩的响应杆、一个液体分配器插座和分配器上方的一个指示灯，当液体被注入分配器时，指示灯会发出信号。液体消耗量由容器中的头部进入检测器检测；每次连续的液体奖励都在头部从容器中取出后延迟15秒。该系统通过MED-SYST-16接口进行控制和数据采集，该接口由运行在PC上的MED-PCR IV软件控制。最初训练大鼠将奖励与分配器插座上方的灯光联系起来。在45分钟的训练中，选择头部至少有60个进入容器的大鼠进行杠杆按压训练。
杠杆-压力训练是在与上述相同的背景下进行的，但这一次老鼠必须按下杠杆才能接受液体。水平压力机打开了容器上方的灯，在之前的培训课程中，他们将其与容器中的液体联系在一起。选择在训练的前10分钟内每分钟至少有6次反应的大鼠进行条件反射。
音调调节
调节室是一个盒子（12×10.5×13英寸），在一个更大的消声盒内有一个带电的网格地板（宾夕法尼亚州阿伦顿市Coulbourn Instruments）。大鼠在调理前24小时完全接触到水。调节方案包括10次20秒音调（音调音量80 dB）的试验，随机间隔（平均间隔时间3分钟）。在配对组中，音调与0.5秒0.5毫安的脚电击同时终止（或一个20秒的音调与1秒0.5毫安脚电击一起终止，用于轻度调节，). 在未配对组中，音调和电击间隔至少1分钟。配对组和未配对组在相同的背景下接受相同数量的音调（CS）和电击（US）；然而，只有配对组的语气和震惊相吻合。第二天，将经过条件处理的大鼠置于试验箱中，以测量CS对其杠杆按压的影响（有关详细信息，请参阅测试部分）。
光学调节
将大鼠放入调节室，并将其连接至473 nm固态激光二极管（OEM激光系统）的光纤跳线，200μm光纤的输出功率为15–20 mW。在进行调节之前，允许他们在房间里探索3分钟。光学调节是以随机间隔施加10列蓝光（10个10Hz的脉冲，持续时间2ms），平均间隔3分钟。对于成对调节，光刺激与0.5 s的0.5 mA脚跳共同终止；在非配对条件反射中，光和电击至少分开1分钟。配对组和非配对组在相同的环境中接受相同数量的光刺激和电击；然而，只有配对组的光照和电击是一致的。电击和光的传输由脉冲发生器控制（Master-8；AMPI，耶路撒冷，以色列）。条件反射后，大鼠在盒子里再呆三分钟，然后回到家里的笼子里。
测试
在条件反射后，大鼠被限制饮水24小时，然后进行杠杆压力测试。测试是在与培训相同的背景下进行的，只是地板是一块带有白色和红色条纹的塑料板。测试是一个7分钟的过程，在这个过程中，大鼠必须按下杠杆来接收液体（10%蔗糖）。将大鼠连接到光纤接插线上，放置在小室中，允许其在接触杠杆之前探索环境5分钟。在测试过程中，大鼠可以自由接触杠杆，无光时间为3分钟，然后是2分钟的光照（10 Hz脉冲，持续时间为2 ms）和2分钟的无光时间。实验结束后，老鼠被送回了家中的笼子。只有连续两天在点亮期间杠杆按压持续减少（>30%）的大鼠才被用于进一步的行为阶段。对那些试验失败的患者进行组织学检查，以确定插管和病毒注射的位置().
用同样的方法对有张力的大鼠进行测试，只是它们接受了2分钟的张力而不是光刺激。
LTD入职培训
在测试后的一小时内，将大鼠放置在一个单独的环境中，一个半透明塑料容器（22.5×15×12 in.）连接到光纤跳线上，允许其在LTD诱导前探索环境3分钟。用900个光脉冲以1 Hz的频率诱发光学LTD，每2 ms。诱导后，大鼠在房间里再呆3分钟，然后再回到家中的笼子里。
LTP诱导
在测试后的一小时内，将大鼠放在单独的环境中，将一个纸板箱（20.5×15.5×14.5 in.）附在光纤跳线上，允许其在LTP诱导前探索环境3分钟。用5束光（每束100个脉冲，100 Hz）以3分钟的间隔诱导光学LTP。诱导后，大鼠在房间里再呆3分钟，然后再回到家中的笼子里。在所有行为分析中，每只动物的光照强度保持不变。实验结束时，对动物进行灌注，并验证光纤的位置。
全身注射MK80132
用异氟醚麻醉大鼠5分钟，然后在无菌盐水中腹腔注射MK801（0.2 mg/kg）。注射后30分钟实施调节方案。
灌注、切片和成像
灌流前，给大鼠服用氯胺酮/地塞米托（分别为75和5 mg/kg）混合物腹腔注射然后用~150 mL生理盐水经心灌注大鼠，然后在0.1M磷酸盐缓冲溶液（PB，pH 7.4）中灌注~150 mL 4%多聚甲醛。然后将大脑在相同的溶液中固定过夜，冲洗干净并储存在0.1M PB中用于切片。
用振动切片系统将大脑冠状切成150μm的切片，并保存在PB中。使用Olympus MVX10荧光显微镜对切片进行成像，以验证AAV-oChIEF-tdTomato在MGN、听觉皮层中的表达及其对背侧杏仁核的投射。此外，还验证了光纤套管在外侧杏仁核上方的正确位置。
体外记录
对于细胞外场电位记录急性切片（如33)由3-4个月大的大鼠制备，在内侧膝状体核/和/或听觉皮层表达AAV-oChIEF。用Axopach-1D放大器（Axon Instruments）在外侧杏仁核背端记录细胞外场电位，玻璃电极（1-2MΩ）充满灌注溶液。听觉投射到外侧杏仁核是由记录部位上方的光学刺激引起的。为了测量AMPA-R场电位，在实验结束时添加了2,3-二羟基-6-硝基-7-磺胺酰-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮（NBQX）（10μM）。使用Igor Pro（Wavemetrics）编写的自定义软件采集和分析数据。所含灌注液：119 mM NaCl、2.5 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2，26 mM氯化钠三，1 mM NaH2人事军官4，11 mM葡萄糖（pH 7.4），并用5%CO2/95%O2充气。
对于整个细胞记录，急性切片（如中所述34–36)由3-4个月大的大鼠制成，在内侧膝状体核和/或听觉皮层表达AAV-oChIEF。使用玻璃移液管（3-4 MΩ）从外侧杏仁核背尖的单个细胞中获得完整的细胞记录，移液管内充满以mM计含有甲烷磺酸铯115、CsCl 20、HEPES 10、MgCl的内溶液22.5，钠2ATP 4，钠三pH 7.25时，GTP 0.4、磷酸肌酸钠10和EGTA 0.6。体外灌注包括人工脑脊液（ACSF），含有119 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO三，1 mM NaH2人事军官4，11 mM葡萄糖，补充1 mM MgCl2和2 mM CaCl2100μM苦曲霉毒素和1 mM L-抗坏血酸钠。每隔10秒，通过使用外荧光显微镜产生的2毫秒蓝光刺激外侧杏仁核的听觉投射，并通过放置在记录细胞正上方的60倍物镜，诱发突触反应。AMPA:NMDA比值计算为刺激后50 ms，−60mV的峰值电流与+40mV的电流之比；这两个值都是从0毫伏的电流中减去的。
体内记录
在将AAV-oChIEF-tdTomato注射到听觉区域四周后（8只动物同时注射在MGN和听觉皮层；2只动物仅注射在听觉皮层；结果汇总），大鼠在记录前2小时每隔10分钟注射三次700μl氨基甲酸乙酯（330 mg/ml）进行麻醉37然后安装在定制的立体定向框架上，角度可调，以便在录制过程中将头部固定在固定位置。体温由加热垫调节。使用无菌手术工具暴露颅骨，并制作一个孔（约3 mm），中心为−3.3 mm AP和4.2 mm ML。记录电极是一个玻璃吸管（4–5 mΩ），填充0.9%NaCl。记录电极连接到Axopatch-1D放大器。使用Instrutech A/D接口将信号放大（X1000）、滤波（2K Hz）并在10 kHz下数字化。使用Igor Pro（Wavemetrics）编写的自定义软件采集和分析数据。
为了进行光学刺激，将光纤粘在玻璃吸管上，使光纤尖端高出玻璃吸管尖端500μm，形成一个optrode。光纤连接到473 nm固态激光二极管（OEM激光系统）。光学刺激的参数与行为期间使用的参数相同（2 ms持续时间，15–20 mW强度）。刺激开始后，以7°角缓慢降低optrode。在记录位置（DV:-7至-7.5）建立至少30分钟的稳定基线（刺激频率0.033Hz）后，诱发2分钟的10Hz刺激，然后是40分钟的0.033Hz刺激。随后的LTD和LTP，使用行为分析中使用的相同参数，分别诱导40分钟。在记录之前和之后立即监测电极电阻和光强度，以确保记录过程中没有变化。记录完成后，对所有动物进行灌注，并验证记录位置。
分析
对每分钟的杠杆按压次数进行装箱，并将其标准化为光刺激前的两分钟时间。抑制率是通过将调节刺激（音调或光学刺激）的第一分钟内的杠杆按压次数除以紧接在刺激之前的次数来测量的。
为了最小化电压依赖性电导分量，场兴奋性突触后电位的初始斜率13使用定制的MatLab程序进行测量。
兴奋性突触后电流振幅是通过平均覆盖峰值振幅的固定3ms窗口并从刺激前的平均电流窗口中减去来测量的。文本和图表中给出的所有值均表示平均值±SEM。使用学生配对和非配对t检验，p<0.05被视为显著。所有行为数据也采用Wilcoxon秩和检验（Matlab统计工具箱）进行分析，得出与t检验相同的显著性值。
