美国山毛榉抗蚧虫性筛选技术(fagisuga隐球菌林德）
摘要
山毛榉树皮病（BBD）会导致较高的初始死亡率，留下严重削弱和变形的幸存树木。这种疾病是由入侵的山毛榉鳞昆虫的摄食活动引发的，fagisuga隐球菌，它创建了一个感染的入口点新油桃属真菌种类。没有鳞片侵染，真菌感染的机会很小。在严重受BBD影响的林分中，使用鳞虫卵对健康树木进行人工侵染，表明这些树木能够抵抗疾病复合物中的鳞虫子部分1在这里，我们提出了一个基于休斯顿人工感染技术的方案2，可用于筛选田间和小型盆栽苗和嫁接苗中的抗鳞片病树木。通过树木改良计划和造林操作，鉴定耐尺度树木是BBD管理的重要组成部分。
关键词：环境科学，第87期，林业，昆虫，抗病，美国山毛榉，山毛榉、山毛榉鳞片、，法吉苏加隐球菌、抗性、筛选、生物测定
介绍
自从引入入侵的山毛榉鳞昆虫以来，山毛榉树皮病（BBD）对北美的美国山毛榉木产生了有害影响，法吉苏加隐球菌19世纪90年代末在加拿大新斯科舍省三当山毛榉鳞昆虫将其取食针插入树皮中，形成小裂缝，为其中一种细菌的感染提供入口时，这种昆虫-疾病复合物就开始了新墨西哥真菌种类(二氏新粘菌或阴道新粘菌).随着真菌菌丝体的生长，大面积的组织可能会死亡，最终完全包围树木。疾病造成的损害使树木衰弱，在大风中容易折断4据报道，第一波疾病的死亡率高达50%5幸存的树木通常会严重变形，因为溃疡会降低树木作为木材产品的价值。这种树有探根的倾向，这导致形成“山毛榉灌丛”，阻止其他更理想的物种建立，降低了林分的经济和生态价值6虽然山毛榉树皮病不太可能导致美国山毛榉树灭绝，但它改变了林分组成和健康状况，导致野生动物的食物和栖息地减少7,8.
据报道，在多年来受BBD影响的林分中，树木仍然没有任何疾病症状。人工接种试验表明，这些树对蚧虫具有抗性2.如果没有水垢侵染新墨西哥感染，尽量减少真菌的影响。美国山毛榉大规模死亡原因新墨西哥以前从未报道过在没有鳞片侵染的情况下感染，因此对山毛榉鳞片昆虫的抗性导致对BBD的抗性。
最近关于BBD管理的研究主要集中在鉴定、繁殖、繁殖和保留对山毛榉蚧虫有抗性的美国山毛榉树。遗传研究表明，对蚧虫的抗性是可以遗传的，仔细选择和培育抗性树木可以在单代内显著提高9这一发现推动了美国各州和国家森林管理者的努力，以建立具有抗BBD能力的美洲山毛榉区域种子园，为恢复种植提供具有遗传多样性的抗BBD种子来源10, 11研究还表明，通过移除易感树木和保留抗性树木对林分遗传进行造林操作，可以改善林分9,12.
通过树木改良活动或通过实施造林处方来管理BBD需要有能力选择和区分山毛榉抗鳞片病树木和易感树木。这里介绍的方法是根据Dave Houston首次介绍的一种方法改编而来，用山毛榉鳞卵人工接种幼苗1该方法可作为筛选工具，用于鉴定与抗性相关的数量性状位点（QTL），或在遗传研究中区分抗性和敏感性盆栽苗或嫁接分株。或者，它可以用于筛选田间成熟树木，以确定种子园发展或田间保留的抗性树木。可以识别并移除易感树木，以将疾病影响降至最低。
协议
1.植物材料：成熟的大田树、盆栽苗或盆栽嫁接
对于实地测试，选择没有大规模虫害或疾病迹象的成熟健康的美国山毛榉树进行可能的抗性测试。还需要识别明显易受感染的树木，以用作控制(图1).
为了测试盆栽苗或嫁接物，请按照Koch&Carey，2004中的描述收集和发芽山毛榉或Carey中的描述嫁接接穗等, 2013.
在盆栽土壤混合物中种植幼苗或嫁接苗，每2.8立方英尺袋添加47克微量营养素、477克缓释肥料15N-3.9P-9.9K、700克粗珍珠岩和75克硫酸铝。如果生长季节后期需要，每周用200 ppm的可溶性17N-1.3P-14.1K给植物施肥。
在生长季节，把植物放在荫凉处。在11月至4月期间将植物转移到受控温度的储存设施（~4°C）之前，让植物在秋季在室外休眠。
2、山毛榉鳞卵采集
在BBD肆虐的林分中，检查严重肆虐的树木（很容易通过其“粉刷”外观识别，图1A)用手放大镜确认鸡蛋的存在，鸡蛋通常在7月中旬至8月中旬大量出现。
用漆刷将成虫、卵和其他碎片的白色蜡状团块轻轻刷入一个可密封的一加仑收集袋中(图1B). 从至少三棵不同的树上收集，间距至少为12米。
如果需要，在4°C的温度下将鸡蛋存放在密封的收集袋中最多两周。用胶带将一小块（2.5平方厘米）潮湿的聚乙烯泡沫粘在袋子的内侧，以防止鸡蛋变干。
为了将鳞片卵（0.15 x 0.25 mm）与成虫（0.60 mm）和碎片分开，使用一小段2'PVC管和一个联结器制作一个筛子，以支撑一块250微米的方形尼龙网(图2).
将收集袋中的成虫、蜡、鸡蛋和碎片的混合物倒在筛子上，用小油漆刷轻轻鼓励鸡蛋通过筛网进入下面的玻璃皮氏培养皿中。应该避免使用塑料皮氏培养皿，因为它们含有更多的静电，因此很难移动鸡蛋。筛分前后的鸡蛋如所示图3.
提纯的鸡蛋可以在4°C的培养皿中储存至少一周。为了防止鸡蛋变干，用胶带将一块潮湿的泡沫粘在盖子上，并用保鲜膜密封。
3.鸡蛋存活率测定
为了评估鸡蛋的生存能力，使用10毫升注射器在60毫米玻璃皮氏培养皿底部周围涂抹一圈薄凡士林(图4A).
将大约100个鸡蛋转移到环的中心，将盖子放在皮氏培养皿上，并用Parafilm密封。让密封的皮氏培养皿在室温下保持不受干扰2周，或者如果鸡蛋在开始分析之前储存在4°C下，则保持3周。
孵化后的若虫会卡在凡士林中，很容易计数，空卵和未孵化卵的颜色和光泽很容易区分(图4B). 用若虫的数量除以空卵加上剩余的满卵的总和来计算存活率。良好的存活率应在孵化卵的75%至90%范围内。
4.田间大型成熟山毛榉抗鳞性筛选
为了进行定量测试，使用解剖显微镜数出500个鸡蛋，然后用小抹刀轻轻地将它们洒在预先缓冲的开孔10 x 15 x 1.3 cm矩形聚乙烯泡沫的中心。为了抑制泡沫，将其弄湿，然后挤出尽可能多的水。对于定性测试，可以数出500个鸡蛋，放在一个小玻璃瓶中，并画出一条“填充”线，用于测量大约500个鸡蛋的额外批次。
将泡沫垫放在测试树上，蛋面对着树皮。用绳子、绳子、麻线或塑料涂层的金属丝将泡沫垫固定到位。应使用塑料或金属材料，而不是更容易被野生动物清除的天然纤维材料。
在预先切割好的23 x 30 cm透湿防水房屋包装的顶部和侧面用醋酸酯基硅胶粘合剂进行划线，并将其放在泡沫测试垫上。将房屋包裹的边缘压到树上，形成防水密封。将尼龙绳或塑料涂层五金线缠绕在树和房屋包装上，在粘合剂凝固时将其固定到位(图5).
在每个测试树上至少放置两个测试垫，最好放在树干的相对侧。在每个现场，将测试垫放置在至少2棵易感树木上（有明显的自然鳞片侵染）作为对照。在将测试垫放置在对照树上之前，使用硬毛刷清除任何自然产生的介壳虫或虫卵。注：带卵的泡沫垫也可以放在树上，用于饲养鳞片卵，这在感染程度较低的地区特别有用。
5.盆栽苗或嫁接苗的抗垢性筛选
为了进行测试，选择直径至少为1 cm的盆栽树木（土壤线上方5 cm的卡尺），这些树木足够高，可以在其上放置至少2个单独的测试垫。必要时修剪小的侧枝，为测试垫腾出空间。
使用解剖显微镜数出150个鸡蛋，并将其分散在预切好并润湿的2.5 x 7.6 x 1.3 cm开孔聚乙烯泡沫垫上。
将泡沫垫贴在幼苗上，鸡蛋面贴在树皮上，使用塑料涂层钢丝。在泡沫上方用一小块房屋包装纸包裹幼苗，并用乙酸酯基硅胶密封（参见图6A).
包括已知的易感幼苗家族或嫁接作为对照。
6.数据收集
注：在测试树上放置泡沫垫和鸡蛋大约52至57周后，可以收集数据。重要的是，要等到成虫开始产卵后才能进行，这样才能确定它们的繁殖能力。在一些抗药性强的树木上，很少有成虫生长，但没有繁殖。
小心地取下泡沫垫，并使用手持透镜或放大镜（10倍）计算树皮上的成虫鳞片数量。
当泡沫垫被移除时，一些成年人和大多数卵簇被泡沫从树上拔下并不罕见（参见图7). 使用解剖显微镜，计数仍附着在泡沫垫上的卵簇和成虫。
具有代表性的结果
图6显示了抗性幼苗(C类)和两株易感幼苗(天,E类)表现出不同程度的敏感性。人工感染测试建立57周后，易感成熟树木的外观示例如所示图5B。当泡沫从树上剥落时，鳞虫及其卵簇粘在泡沫上的情况并不罕见，如所示图7这就是为什么必须从树和泡沫垫收集数据的原因。
图8图中显示了在两个不同的林分中，每100个虫卵在人工感染的树木上形成的成虫平均数量，一个位于宾夕法尼亚州的阿勒格尼国家森林（ANF），另一个位于密歇根州的卢丁顿州立公园（LSP）。这两个林分都感染了BBD，在每个林分中，鉴定出一组健康树木（抗LSP和抗ANF），并根据DNA分析确定为克隆树（数据未显示）。在LSP（LSP敏感）也鉴定出BBD敏感树的克隆簇，但在ANF中使用了五种不同的敏感树（ANF敏感）。克隆簇内和克隆簇之间的大小随胸径的变化而变化，范围为2.1至12.8英寸。图8结果表明，尽管在易感树木上建立的成虫数量存在很大差异，但在易感和抗性树木之间检测到明显差异。与感病树木相比，这两个抗性集群中的成虫数量变化较小。在ANF抗性群集中，所有12个被测克隆都没有成虫，而在LSP抗性群集中一些克隆只有少量成虫。然而，在这两个地点，抗性和易感树木的平均值的标准偏差没有重叠。
LSP（LSP敏感）中克隆相关树的成虫数量变化大于ANF敏感树（ANF敏感），尽管这些树不是克隆树，并且具有遗传差异。生存力测试（数据未显示）表明，这种差异并非由于鸡蛋的生存力存在很大差异。这种变异可能是由于遗传和环境差异造成的，并说明了在每个试验点都有易感对照品供参考的重要性。
图1。从规模化的美国山毛榉树上收集鳞片卵。A类美国山毛榉，树势严重。B类用画笔将成虫及其卵刷入下面一个可密封的储物袋中。
图2。建造筛子，将鳞片卵与成虫和其他污染物分离。将一个4 x 4英寸预先切割好的250微米尼龙网正方形放在一根4英寸直径为2英寸的PVC管和一个联轴器之间，以形成筛子。
图3。在（A）和（B）筛分之前和之后对鸡蛋进行称重。A类从树上采集后，在解剖显微镜下观察成蚧虫、卵和碎片的混合物。B类.通过筛子得到的纯化鸡蛋。
图4。鸡蛋活力测试。A类在孵化后用石油环在皮氏培养皿中诱捕若虫。B类在一个没有用手抓着的蛋的右边的I型若虫。C类孵化后的蛋比孵化前不透明的黄色蛋颜色更浅、半透明。
图5。田间成熟美国山毛榉的人工侵染。A类.贴有乙酸酯基硅胶的房屋包装，以防止泡沫垫上积聚过多水分，泡沫垫下面有鸡蛋。B类。放置52周后，拆除了房屋包装，并将泡沫垫剥离，以显示这棵易感树木下方的水垢定植情况。
图6。美国山毛榉盆栽苗的人工侵染。答：茎上附着有鸡蛋的泡沫。B。房屋包装覆盖泡沫。C、。抗药性幼苗56周后去除泡沫D。易感幼苗，E.公司。和一株高度敏感的幼苗。请单击此处查看此图的放大版本。
图7。泡沫垫上的成虫鳞片和卵簇。成虫的鳞片被白色的蜡状碎屑包围并部分覆盖。较小、光滑、有光泽的卵位于成虫的顶部和蜡内。这将作为一个成虫和一个卵簇进行评分。
图8。比较两个独立林分人工感染树木上建立的成虫平均数量。将宾夕法尼亚州阿勒格尼国家森林（ANF）和密歇根州卢丁顿州立公园（LSP）的抗性树木与易感对照树木进行比较。每个组中测试的树木数量在下面的括号中列出，每100个鸡蛋中的成虫数量是组内所有树木的平均数。条形图表示平均值的一个标准偏差。
讨论
该试验成功所需的关键步骤包括对鸡蛋进行活力测试，并在每个测试地点使用敏感对照品，以及使用盆栽材料。同样重要的是，每棵树或幼苗使用一个以上的测试垫。我们发现，无论是在田间还是在盆栽植物的更受控测试中，一个常见的错误源可能是衬垫故障。例如，在野外，即使我们修改了用保鲜膜覆盖测试垫以防止水分过多，但水流下树干可能会偏向树的一侧，导致测试垫的损失。
为了获得准确的结果，重要的是要对垫子下的树表面和泡沫垫本身进行评分。除了成虫和卵簇外，还可以观察到称为I型若虫的鳞片生命周期中的唯一流动阶段。这些移动的若虫最终将其取食触须插入树皮中，成为II型若虫。这两种若虫在大小和外观上与卵形的小卵非常相似，而较大的成虫则具有更球形的形状。因为我的眼睛是红色的，而且在移动，所以我可以把它和鸡蛋区分开来，但这种移动使得准确计数非常困难。II型若虫很容易被误认为是卵子，尤其是在野外用手持透镜或放大镜而不是显微镜记录数据时。基于这些原因，我们建议只计算成虫和卵簇的数量，我们发现这为我们提供了关于测试树支持自我维持规模侵染能力的可重复数据。先前的研究表明，成虫数量与卵簇数高度相关9在许多情况下，只计算成年人可能就足够了；然而，我们观察到一些情况，成虫能够在树木的某些基因型上繁殖，但不会产卵。如果没有繁殖能力，这些树上的鳞片侵染将无法持续。
在野外进行测试时，测试垫对熊的吸引力出乎意料地下降。未来对方案的修改应侧重于使用对熊吸引力较小的材料，或将测试垫放置在不同的高度。这种测试方法的一个局限性是，它不应用于至少没有轻微山毛榉鳞片侵染的地区，以避免山毛榉树皮病传播的风险。
这项技术的实用性在于，它可以作为育种计划的一部分用于评估父母的表现。对于这类子代测试，通常遵循严格的耐鳞片性标准，只允许一个成虫和零个卵簇作为抗性标准。使用这些指南来选择亲本，抗性子代的比例应约为50%，这比自由授粉种子有很大的提高15然而，出于土地管理目的，最好使用不太严格的标准来保留树木，因为支持少量鳞片昆虫的树木可能仍然相对健康。
致谢
作者感谢美国林务局森林健康保护评估监测和特殊技术开发项目提供的资金，这些资金支持了本文所述协议的开发、修改和应用，以识别对山毛榉鳞虫具有抗性和敏感性的树木。我们还感谢俄亥俄州科特兰霍尔顿树木园对我们美国山毛榉抗性筛选项目的持续合作和支持。
工具书类
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