跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
伤口修复再生。作者手稿；PMC 2014年10月22日提供。
以最终编辑形式发布为：
伤口修复再生。2010年3月至4月；18(2): 193–201.
2010年2月16日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1524-475X.2010.00570.x
预防性维修识别码：项目经理4206187
尼姆斯：NIHMS635376
PMID：20163569

烧伤后HIF-1α杂合小鼠血管生成受损及循环血管生成细胞动员

张贤杰,1,2,* 刘立新,2,* 魏晓飞,三，* Yee Sun Tan先生,三 拉娜·唐,三 Ryan Chang（瑞安·张）,三 穆罕默德·加纳马,2 莫拉·莱因布拉特,2 盖伊·P·马蒂,2 约翰·哈蒙,2和格雷格·塞门扎三，4,5
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

低氧诱导因子1（HIF-1）是一种转录因子，控制血管对缺氧和缺血的反应。在这项研究中，编码HIF-1α亚单位的基因座上的空等位基因杂合的小鼠（HET小鼠）及其野生型（WT）同窝小鼠遭受了涉及10%体表面积的热损伤。第2天，WT小鼠的烧伤创面中HIF-1α蛋白水平升高，而HET小鼠则没有升高。与CXCR4结合的基质衍生因子1α的血清水平在第2天在WT小鼠中升高，但在HET小鼠中没有升高。在第2天，WT小鼠的循环血管生成细胞也增加，但在HET小鼠中没有增加，包括CXCR4+Sca1类+细胞。激光多普勒灌注成像显示第7天WT小鼠烧伤创面血流量增加，但HET小鼠没有。第7天的免疫组织化学显示CD31数量减少+与WT小鼠相比，HET烧伤创面愈合边缘的血管。根据第21天α-平滑肌肌动蛋白阳性血管的数量，HET小鼠伤口的血管成熟也受到损害。与WT同窝小鼠相比，HET小鼠第14天的剩余伤口面积显著增加。HET小鼠第14天伤口愈合的百分比显著降低。这些数据揭示了HIF-1在烧伤创面愈合过程中促进血管生成的信号通路。

介绍

美国每年有数百万人遭受烧伤(1,2). 在目前的治疗中，美容和功能效果往往都不令人满意(三). 旨在通过组织再生而不是纤维疤痕来治愈烧伤伤口的新策略将对烧伤患者产生巨大的潜在益处。烧伤后真皮血管床的修复是组织再生的重要潜在组成部分(4). 然而，我们对调节烧伤创面愈合的潜在分子机制的了解有限，这是开发新疗法的主要障碍。

低氧诱导因子1（HIF-1）促进血管新生和血管重塑，以应对缺氧或缺血(5). HIF-1是一种异二聚体蛋白，由组成型表达的HIF-1β亚基和O2-调节HIF-1α亚单位(6). 在常氧条件下，HIF-1α亚单位泛素化和降解，而在缺氧条件下，HIF-1α积累，与HIF-1β二聚，并激活编码多种血管生成生长因子和细胞因子的下游靶基因的转录，这些因子在伤口愈合中具有潜在的重要性，包括血管内皮生长因子（VEGF）、胎盘生长因子、血管生成素1和2、血小板衍生生长因子B、基质衍生因子1（SDF-1）和干细胞因子(7–12). 角质形成细胞特异性启动子中HIF-1α组成活性形式的转基因表达与皮肤血管生成增加相关(13). 当VEGF从同一启动子表达时，皮肤血管增生与高渗透性无关(14).

血管生成性细胞因子激活内源性内皮细胞并招募循环血管生成细胞（CAC），此处使用该术语表示具有参与血管生成各个方面潜力的异质细胞群。这些细胞包括内皮祖细胞，它们融合到新血管或重塑血管的内皮细胞中，以及髓系、间充质和造血干细胞，它们通过产生血管生成细胞因子促进血管生长和重塑(15–18). CAC从血管、骨髓和其他部位释放，以响应组织损伤部位血管生成细胞因子的产生。在动员进入循环后，CAC回到伤口，参与血管生成。最近对遭受热损伤患者的研究使用流式细胞术分析了外周血中的CAC亚群，以确定表达VEGF受体2（VEGFR2）和祖细胞标记物（CD133、CD144）以及缺乏髓细胞标记物表达（CD15、CD45）的细胞。血管内皮生长因子2+/CD15型−烧伤后12小时内外周血出现细胞(19). CD45型−/CD133型+/CD144型+/血管内皮生长因子2+与健康对照组相比，烧伤后24小时外周血中的细胞显著增加(20).

刺激CAC从远处和家中动员到伤口可能是HIF-1促进血管生成和血管重塑以应对组织缺血的主要机制(9,11,21,34). 电穿孔辅助基因转移后，小鼠皮肤中HIF-1α组成活性形式的表达足以动员CAC并改善糖尿病小鼠兴奋性伤口的愈合(22). 局部应用HIF-1化学诱导剂也能促进糖尿病小鼠的切除伤口修复(23).

与前面描述的工作不同，我们的研究使用了烧伤模型。切除伤口有干净、无坏死的边界，而烧伤伤口有中央坏死，必须在伤口边缘愈合时清除。烧伤创面面临着从周围修复和再生以及从更多中心区域清除坏死组织的双重挑战。此外，由于热损伤延伸到与产生烧伤的加热元件直接接触的组织之外，因此烧伤创面的边缘没有明确划分。我们最近开发了一种分级热损伤小鼠模型，并证明更严重的伤口与延迟CAC动员、伤口血管化和伤口愈合有关(24). 我们利用该模型研究了在编码HIF-1α的基因座上杂合子为空（敲除）等位基因的小鼠的烧伤创面愈合。

材料和方法

小鼠应变

这个Hif1a型tm1jhu公司小鼠菌株是通过同源重组产生的，以取代Hif1a型带有a的基因新R（右）在胚胎干细胞J1系（来自129/Sv小鼠）中的表达盒，然后将转基因细胞注射到从C57BL/6J小鼠分离的囊胚中(25). 在过去的12年中，该菌株一直通过HET x WT交配保持，小鼠将Hif1a型tm1jhu公司远交129×B6遗传背景上的等位基因。

小鼠烧伤模型

所有程序均由约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。对8周龄雄性WT和HET同窝小鼠进行烧伤创面。小鼠通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）麻醉，背部刮毛，并用奈尔乳膏脱毛（新泽西州普林斯顿Church&Dwight Co.Inc.）。将定制的220克铝棒在100°C水浴中加热5分钟。在每只小鼠的背上产生两次直径为1.2厘米的烧伤，总共约占体表总面积的10%。为了确保燃烧均匀性，只有铝棒本身的重量才为皮肤表面提供压力。选择用节拍器测量的4秒接触时间来产生标准化的全厚度烧伤。烧伤后1小时内腹腔注射生理盐水，根据两次Parkland配方进行液体复苏（4 ml/kg x受伤的体表面积百分比）(即将1.6 ml生理盐水注射到一只20 g的小鼠，烧伤面积覆盖身体表面积的10%）。在最初的24小时内，皮下注射丁丙诺啡（1 mg/kg）用于镇痛。采用这种麻醉和复苏方案，存活率为95%。

蛋白质分离和免疫印迹分析

在第2天，使用直径为8mm的穿孔活检设备从小鼠背部烧伤和对照非烧伤皮肤上采集组织样本。从烧伤伤口头部至少1.5厘米的未烧伤皮肤上打了两拳。通过四次相邻的穿孔活检，从四个象限的烧伤创面中采集组织，每个穿孔包括烧伤创面组织和邻近皮肤边缘。每个直径为8mm的样本约有一半由烧伤创面组成，另一半为邻近皮肤，愈合边缘包括在这些部分之间。样品在液氮中冷冻。样品在含有20 mM HEPES和1.5 mM MgCl的裂解缓冲液中均匀化20.2 mM EDTA、0.1 M NaCl、0.2 mM DTT和蛋白酶抑制剂，然后添加NaCl至最终浓度0.45 M。离心后收集上清液，并添加甘油至最终浓度20%。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对等分样品（250μg）进行分离，并使用兔抗HIF-1α多克隆抗体（Novus Biologicals，Littleton，CO）进行免疫印迹分析，其稀释度为1:500，辣根过氧化物酶结合抗兔免疫球蛋白（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.，Piscataway，NJ）二级抗体，使用ECL试剂进行信号开发（GE Healthcare Bio-Sciences）。

SDF-1酶联免疫吸附试验

收集小鼠血液并在室温下凝固2 h，然后在2000×克。根据制造商的方案（明尼阿波利斯R&D Systems公司）进行ELISA分析之前，收集血清并储存在−80°C下。

CACs的短期培养分析

如前所述，对外周血进行CAC检测(11,26). 通过Histopaque-1083（Sigma-Aldrich）密度梯度离心法从外周血中分离出单核细胞。用氯化铵溶解残余红细胞。将单核细胞接种在涂有大鼠卵黄凝集素（1.5×10）的96周板上6细胞/厘米2并在内皮细胞基础培养基2中培养，补充EGM-2-MV SingleQuots（瑞士巴塞尔Lonza）。培养4d后，将细胞置于含有1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁（DiI）标记的乙酰化低密度脂蛋白（LDL）（Invitrogen，Carlsbad，CA）的培养基中，浓度为2.4μg/ml，37°C培养2h。然后用4%多聚甲醛固定细胞10min，并与标记的异硫氰酸荧光素（FITC）孵育单叶班德拉在荧光显微镜下计数10μg/ml浓度的凝集素-1（BS-1凝集素；Sigma-Aldrich）持续1h，用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（Invitrogen）复染，DiI-acLDL摄取和FITC-BS-1结合染色阳性的细胞。

流式细胞术

CXCR4的数量+/Sca1类+如前所述，通过荧光激活细胞分选（FACS；LSR II Becton Dickinson，San Jose，CA）测定外周血中的细胞(11). 向100μl等分全血中添加1μl Fc块（CD16/CD32；BD Pharmingen），然后分别添加2μl藻红蛋白（PE）结合的抗CXCR4单克隆抗体和FITC-标记的抗Sca1单克隆抗体（BD Pharmingen）并在4°C的黑暗中孵育25分钟。加入1毫升氯化铵溶液（不列颠哥伦比亚省温哥华市干细胞技术公司），在4°C的黑暗中孵育10分钟以裂解红细胞。将单核细胞制成颗粒，重新悬浮在染色缓冲液中（0.5%牛血清白蛋白/2 mM EDTA，PBS中）。前向散射中的活细胞数与对侧面散射窗口进行选通，并从FITC的点图中记录数据与PE。采集150000个事件进行分析。

激光多普勒灌注成像（LDPI）

使用633-nm氦氖扫描激光多普勒成像设备（英国德文郡摩尔仪器公司）测量伤口区域的血流，该设备利用近红外激光二极管测量皮下血流，作为运动红细胞光散射的函数（多普勒频移）。对于每个测量点，都会生成一个信号，该信号与组织灌注成线性比例，组织灌注定义为血细胞速度和浓度的乘积。该信号称为激光多普勒灌注指数，在计算机屏幕上以二维彩色图像表示。同时制作了一张照片图像，以便对相应的烧伤区域进行直接的解剖比较。对于每次烧伤，在将图像导出到软件包LDISOFT（Lisa Development AB，Linkoping，Sweden）后选择伤口部位。然后，计算感兴趣区域内的平均激光多普勒灌注指数值。将扫描仪放置在每只动物上方50厘米处，并在第0、3、7和14天进行连续扫描，以评估伤口中的血流。

免疫组织化学

用IHC锌固定剂（不含福尔马林；BD Pharmingen，加州圣地亚哥）固定小鼠伤口组织24小时和5μm-制备了厚石蜡切片。为了防止非特异性结合，使用100μl含有2%正常兔血清（CD31）或马血清（α-平滑肌肌动蛋白）的封闭溶液（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch）30分钟，然后使用100μl初级抗CD31抗体（1:50稀释；新泽西州富兰克林湖BD Pharmingen）或抗α-平滑肌肌动蛋白抗体（1:200稀释；西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）在室温下应用于切片1小时。用生物素化二级抗体进一步培养切片（1:500稀释；加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）。链亲和素-生物素-辣根过氧化物酶用于信号放大，二氨基联苯胺用于染色（Vector Laboratories）。用苏木精进行30秒的反训练。3%H2O（运行）2（Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ）用于阻断内源性过氧化物酶活性。所有载玻片均以盲法检查。

伤口面积计算

在第0、7、14和21天，追踪伤口边界就地在透明醋酸纤维纸上。图像以600 dpi（Paperport 6000，Visioner，Fremont，CA）进行数字化，并使用NIH Image软件分析（Scion Image，Frederick，MD）计算伤口面积（像素）。

统计分析

结果显示为平均值±平均值标准误差（SEM）。根据情况，使用Sigma Stat（SYSTAT Software Inc.，Point Richmond，CA）通过Student t检验或ANOVA分析组间平均值差异的显著性。

结果

烧伤后第2天HIF-1α表达分析

我们建立了一个定量的小鼠烧伤创面模型，在该模型中可以可靠地产生均匀、分级的热损伤，并且我们通过组织学分析表明，4秒的烧伤接触时间会导致可重复的全层烧伤(24). 在烧伤后第2天从烧伤组织和未烧伤组织中提取HIF-1α蛋白，并用免疫印迹法进行检测。在WT小鼠中，HIF-1α蛋白水平低于未燃烧组织中的检测水平，而HIF-1β很容易在燃烧组织中检测到(图1). 相反，HET小鼠烧伤组织中HIF-1α蛋白水平没有明显增加。股动脉结扎后3天，HET小鼠的缺血肢体也观察到HIF-1α诱导的完全丧失(11)和HET小鼠大脑中间歇性缺氧10天(31). 这些其他缺氧缺血应激模型在不同时间点的反应完全丧失表明，未能检测到HET小鼠烧伤创面中HIF-1α蛋白水平的升高不太可能是诱导延迟所致，并为HET小鼠的烧伤创面血管损伤提供了分子基础，即如下所述。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms635376f1.jpg

烧伤创面HIF-1α蛋白水平分析。从非烧伤皮肤（NS）和烧伤创面（BW）样品中制备组织裂解物，这些样品是在烧伤创面2天后从野生型（WT）和HIF-1α杂合全（HET）小鼠中获取的。使用HIF-1α和β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析，作为负荷对照。

烧伤后第2天SDF-1的表达分析

缺血皮肤中SDF-1表达以HIF-1依赖性方式增加(9)和肢体(11)组织和切除伤口(22). 第2天，WT小鼠的血清SDF-1水平显著升高(图2). 相反，烧伤后HET小鼠的血清SDF-1水平没有增加，导致HET小鼠在第2天的血清SDF1水平显著低于WT同窝小鼠（0.8±0.1与1.3±0.2纳克/毫升；P（P）<0.05，方差分析和Tukey后验）。诱导HIF-1α和SDF-1之间的时间相关性与HIF-1直接与编码SDF-1的基因启动子结合并激活其转录的证明一致(9).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms635376f2.jpg

血清SDF-1水平分析。在烧伤后第0、1和2天分别从WT和HET小鼠中采集外周血样本。对血清样本进行SDF-1的ELISA检测(n个=每种情况下4–9）*P（P）<0.05，方差分析与Tukey检验。

HIF-1α缺乏损害循环血管生成细胞的动员

我们假设，血清SDF-1水平升高的一个重要后果是烧伤后CAC向外周血的动员增加。为了验证这一假设，对外周血单个核细胞进行了分离、培养体外在有利于内皮细胞生长的条件下，测定内化DiI-标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL）和结合FITC-标记的BS-1凝集素的细胞数量(图3A). 尽管DiI-acLDL+/FITC-BS-1型+细胞最初被认为是内皮祖细胞，最近的研究表明，绝大多数是促血管生成的髓样细胞(17,27). 烧伤前，HET小鼠的CAC计数显著低于WT同窝小鼠（12±5与38 ± 6;P（P）<0.05，方差分析和Tukey后验）。烧伤后第1天，HET和WT小鼠的CAC平均计数均急剧下降至无法检测到的水平，这可能反映了烧伤前循环中细胞的伤口归巢。在WT小鼠中，CACs在第2天显著增加，然后在第4天逐渐降低到基础水平以下，这可能反映了新动员的细胞回到伤口。相反，在第2-4天，在HET小鼠中未观察到烧伤诱导的CAC数量变化。因此，在第2天和第3天，HET小鼠的CACs显著低于WT小鼠。基因型之间的差异在第2天最大，此时HET小鼠的CACs数量比WT同窝小鼠低约18倍。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms635376f3.jpg

WT和HET小鼠的循环血管生成细胞。（A） 在烧伤后第0、1、2、3和4天从WT和HET小鼠采集外周血样本。收集每个基因型3只小鼠的血样，分离单核细胞，在内皮生长因子存在下培养4天，并测定每200倍视野中显示DiI-AcLDL摄取和FITC-BS-1结合的细胞数。CAC的平均数量（±SEM，n个=每种情况下3个池）*P（P）<0.05，用Tukey检验进行方差分析。（B） 在烧伤后第0、1、2和3天从WT和HET小鼠采集外周血样本。通过流式细胞术测定共表达CXCR4和Sca1的单核细胞的百分比(n个=每种情况下4）*P（P）<0.05，用Tukey检验进行方差分析。

为了分析携带特异性细胞表面受体的细胞的动员情况，对烧伤前后WT和HET小鼠的外周血单个核细胞进行流式细胞术分析，重点是表达趋化因子受体CXCR4（特异性结合SDF-1）和干/祖细胞抗原Sca1的细胞。CXCR4的数量+/Sca1类+与基线水平的WT小鼠相比，HET小鼠中的细胞（以总单核细胞数的百分比表示）显著降低(图3B)，这与上述CAC培养分析的数据一致。同样与这些结果一致的是，CXCR4的数量+/Sca1类+WT小鼠外周血中的细胞增加，但HET同窝小鼠中的细胞没有增加，导致循环CXCR4的数量显著降低+/Sca1类+第2天HET小鼠的细胞（0.025±0.005%[HET]vs.0.063±0.014%[WT]；P（P）<0.05，方差分析和Tukey后验）。综上所述，这些结果表明HIF-1α缺乏与CAC对烧伤的反应受损有关。值得注意的是，与我们之前对129S1/SvImJ小鼠烧伤创面愈合的研究一致(24)，WT小鼠的CAC动员是暂时的，因为在两种培养物中仅在烧伤后第2天观察到CAC数量增加（相对于未烧伤的小鼠）(图3A)和FACS(图3B)分析。综合起来图1–三证明WT小鼠对烧伤创面愈合的关键血管生成反应发生在第2天，而HET小鼠没有。

HIF-1α缺乏对创面血管化和灌注的影响

我们假设CAC的动员及其随后向伤口的募集将刺激血管生成，从而增加烧伤创面组织的灌注。为了分析HIF-1α缺乏对烧伤后组织灌注的影响，在第0、3、7和14天用激光多普勒灌注成像（LDPI）测量皮肤血流(图4). 与HET小鼠相比，WT小鼠烧伤后第7天的伤口血流量显著增加（313±33与253±14个LDPI单元，P（P）<0.05，方差分析和Tukey后验）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms635376f4.jpg

WT和HET小鼠烧伤创面血流量。在第0、3、7和14天对烧伤创面进行激光多普勒灌注成像（平均值±SEM，n个=每种情况16）*P（P）<0.05，用Tukey检验进行方差分析。

为了研究HIF-1α缺乏对组织血管生成的影响，采用定量免疫组织化学方法评估血管生成。在第7天和第21天切除烧伤创面，并进行PECAM-1（CD31）和α-平滑肌肌动蛋白（SMA）免疫组织化学染色。第7天，CD31的数量+统计每个伤口肉芽组织愈合边缘200倍视野内的血管数(图5). CD31型+HET小鼠的血管计数显著低于WT小鼠（17±2与27 ± 3;P（P）<0.05,方差分析和Tukey后验）。第7天，愈合边缘的SMA染色呈阴性（数据未显示），这与预期相符，因为未成熟血管缺少周细胞。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms635376f5.jpg

第7天，WT和HET小鼠烧伤创面血管化。在每个烧伤创面肉芽组织愈合边缘进行PECAM-1（CD31）免疫组织化学染色。在每个面板中，邻近坏死烧伤伤口的愈合边缘用紫色勾勒出来。中间面板中的箭头表示毛囊，用于识别伤口附近的正常真皮。左下方的条形图显示CD31的平均数+愈合边缘每200x场（下图）的血管数（±SEM，n个=每个基因型5个）*P（P）<0.05，用Tukey检验进行方差分析。

在第21天，还使用CD31抗体在每个伤口的中心进行血管计数(图6)和SMA(图7). CD31型+HET小鼠的血管计数显著低于WT小鼠（14±2与25 ± 3;P（P）<0.05,方差分析和Tukey事后测试）。在HET小鼠中，SMA的数量+与WT小鼠的伤口相比，每个伤口中心200倍视野内的血管也显著减少（10±2与16 ± 2;P（P）<0.05,方差分析和Tukey事后测试）。这些结果表明，部分HIF-1α缺乏会损害烧伤创面愈合过程中的血管形成和成熟，即使在完全闭合创面后，血管形成的差异也会持续到第21天。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms635376f6.jpg

CD31分析+第21天烧伤创面的血管。在WT（B）和HET（C）小鼠各创面愈合中心进行PECAM-1（CD31）免疫组织化学染色，并测定平均染色血管数（±SEM，n个每种基因型=12）如图（A）所示*P（P）<0.05 vs WT，ANOVA with Tukey test。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms635376f7.jpg

SMA分析+第21天烧伤创面的血管。在WT（B）和HET（C）小鼠各伤口愈合中心进行SMA免疫组织化学染色，并计算平均染色血管数（±SEM，n个每种基因型=12）如图（A）所示*P（P）<0.05 vs WT，ANOVA with Tukey test。

烧伤创面闭合分析

为了研究HIF-1α缺乏是否影响烧伤伤口愈合，我们比较了HET小鼠及其WT同窝小鼠烧伤伤口闭合的动力学。在第0天、第7天、第14天和第21天用数字平面仪测量非上皮化伤口面积(图8). HET小鼠的剩余伤口面积（10700±1600像素）比其第14天的WT室友大35%(图8A)，差异具有统计学意义(P（P）<0.05,方差分析和Tukey后验）。此外，第14天愈合率>95%的伤口百分比(图8B)在HET小鼠中显著降低(P（P）<0.01, χ2测试）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms635376f8.jpg

WT和HET小鼠烧伤创面愈合动力学。条形图显示了在第0天、第7天、第14天和第21天通过计算机辅助平面测量法测量的伤口面积（平均值±SEM，n个=每种情况16）*P（P）<0.05 vs WT，采用Tukey检验的方差分析。插图显示了第14天愈合率>95%的伤口的百分比*P（P）<0.01 vs WT，χ2测试。

讨论

本研究表明，与WT同窝小鼠相比，HIF-1α表达降低的HET小鼠损伤了烧伤创面的血管生成。基因型之间伤口愈合率的明显差异较小，这可能是因为与人类不同，小鼠主要通过伤口挛缩进行愈合，因此，由于小鼠模型的这一主要局限性，血管受损对伤口愈合的影响可能被低估。其他研究表明，HIF-1α在伤口愈合中的重要性，在这些研究中，发现具有损害兴奋性伤口愈合的条件的动物，如衰老和/或糖尿病，其诱导HIF-1(21–23,28,29). 研究表明，烧伤既能抑制HIF-1α的诱导，也能抑制同一动物远端同时发生的切除伤口的愈合(30). 内皮细胞HIF-1α完全缺乏的条件性敲除小鼠表现出兴奋性皮肤伤口愈合受损(10). 然而，原发性HIF-1α缺乏对烧伤创面愈合的影响，如本文所研究的，以前尚未得到解决。

HET小鼠烧伤创面血管生成明显受损，这在创伤愈合早期多血管期的血液流量减少和组织学上都有记录，即使在创伤愈合晚期，血管减少也持续存在。对CACs的分析表明，HET小鼠血管生成受损至少部分是由于烧伤后促血管生成细胞动员减少所致。烧伤创面HIF-1α蛋白的诱导、血清SDF-1水平的诱导和CXCR4的动员+/Sca1类+HET小鼠烧伤后第2天的细胞均显著受损，这为HET小鼠第7天观察到的烧伤创面组织灌注和血管损伤提供了分子机制(图9). 该模型与先前报道的HIF-1→SDF-1信号在缺血性创面皮瓣和切除创面血管化中的作用一致(9,29).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms635376f9.jpg

HIF-1在烧伤创面血管化和愈合中的作用。

值得注意的是，HIF-1α杂合敲除小鼠在伤口愈合和血管生成方面表现出明显的损伤。先验，由于两个功能基因拷贝中有一个失活，HET小鼠产生的HIF-1α蛋白预计比WT同窝小鼠少约50%。然而，与WT小鼠烧伤创面中HIF-1α蛋白水平的显著增加相反，HET小鼠烧伤创口中未观察到HIF-1β的显著诱导。在股动脉结扎HET小鼠的肢体肌肉中也观察到HIF-1α诱导的显著缺失(11)慢性间歇性缺氧HET小鼠的大脑(31). 这些模型的数据表明存在前馈机制，可以放大WT小鼠的HIF-1反应，并导致HET小鼠HIF-1α水平的下降大于线性。

本研究的结果具有几个重要的临床意义。首先，由于编码HIF-1α基因座的遗传多态性，患者在烧伤后可能会出现HIF-1活性受损，这已被证明可以预测冠状动脉侧支的缺失(32)表现为稳定型心绞痛而非心肌梗死(33)冠心病患者。HIF-1诱导受损也可能发生在老年患者中(11,11,24)，糖尿病(23;28)或两者兼而有之(22). 第二，增加HIF-1α水平的基因或药物策略已被证明可以促进缺血肢体肌肉的血管化(11)和切除伤口(21–23,28)并且可能有助于烧伤创面的治疗，特别是对于具有已知危险因素的患者，如衰老和糖尿病。人体主要烧伤创面被切除并移植。在HET和WT小鼠中对这些程序进行建模的进一步研究可能会提供更多有关HIF-1在烧伤愈合中作用的临床相关数据。

致谢

该项目的资金由美国国立卫生研究院公共卫生服务拨款P20-GM78494、亨德里克斯伯恩基金、约翰·霍普金斯湾景基金、北京新星计划第2004B29号拨款、中国奖学金委员会和约翰·霍普金细胞工程研究所提供。

缩写

HIF-1型低氧诱导因子1
HET公司杂合子
重量野生型
血管内皮生长因子血管内皮生长因子
SDF-1型基质衍生因子1
CAC公司循环血管生成细胞
血管内皮生长因子2血管内皮生长因子受体2
FITC公司异硫氰酸荧光素
英国标准-1单叶班德拉凝集素-1
DiI公司1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚碳菁
acLDL公司乙酰化低密度脂蛋白
体育课藻红蛋白
座椅模块组件α-平滑肌肌动蛋白

脚注

利益冲突

作者表示没有利益冲突。

工具书类

1.美国烧伤发病率和医疗保健使用：估计、趋势和数据来源。烧伤护理康复杂志。1996;17:95–107.[公共医学][谷歌学者]
2Kerby JD、McGwin G，Jr、George RL、Cross JA、Chaudry IH、Rue LW、。，第三，烧伤后死亡率的性别差异：美国烧伤协会国家烧伤知识库的分析结果。烧伤护理研究杂志。2006;27:452–6.[公共医学][谷歌学者]
三。Treddget EE。热损伤后纤维化和伤口愈合障碍的基础。创伤杂志。2007;62：第69系列。[公共医学][谷歌学者]
4Folkman J.血管生成是生物学和医学中的组织原理吗？儿科外科杂志。2007;42:1–11.[公共医学][谷歌学者]
5血管生成、血管生成和动脉生成：血管形成和重塑的机制。细胞生物化学杂志。2007;102:840–7.[公共医学][谷歌学者]
6Wang GL，Jiang BH，Rue EA，Semenza GL。缺氧诱导因子1是一种受细胞O2张力调节的碱性螺旋-环-螺旋PAS异二聚体。美国国家科学院院刊。1995;92:5510–4. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
7Forsythe JA，Jiang BH，Iyer NV，Agani F，Leung SW，Koos RD，Semenza GL.低氧诱导因子1激活血管内皮生长因子基因转录。分子细胞生物学。1996;16:4604–13. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
8Kelly BD、Hackett SF、Hirota K、Oshima Y、Cai Z、Berg-Dixon S、Rowan A、Yan Z、Campochiaro PA、Semenza GL。通过组成活性形式的低氧诱导因子1对非缺血组织中血管生成生长因子基因表达的细胞类型特异性调节和血管生成的诱导。圆形Res。2003;93:1074–81.[公共医学][谷歌学者]
9Ceradini DJ、Kulkarni AR、Callaghan MJ、Tepper OM、Bastidas N、Kleinman ME、Capla JM、Galiano RD、Levine JP、Gurtner GC。通过HIF-1诱导SDF-1，低氧梯度调节前体细胞的运输。自然医学。2004;10:858–64.[公共医学][谷歌学者]
10Tang N，Wang L，Esko J，Giordano FJ，Huang Y，Gerber HP，Ferrara N，Johnson RS。内皮细胞中HIF-1α的缺失破坏了肿瘤发生所必需的低氧驱动的VEGF自分泌环。癌细胞。2004;6:485–95.[公共医学][谷歌学者]
11Bosch-Marce M、Okuyama H、Wesley JB、Sarkar K、Kimura H、Liu YV、Zhang H、Strazza M、Rey S、Savino L、Zhou YF、McDonald KR、Na Y、Vandiver S、Rabi A、Shaked Y、Kerbel R、Lavalley T、Semenza GL。衰老和低氧诱导因子1活性对肢体缺血后血管生成细胞动员和灌注恢复的影响。圆形Res。2007;101:1310–8.[公共医学][谷歌学者]
12Simon MP，Tournaire R，Pouyssegur J.内皮细胞的血管生成素-2基因在缺氧时通过位于其第一内含子的HIF结合位点以及中心因子GATA-2和Ets-1上调。细胞生理学杂志。2008;217:809–18.[公共医学][谷歌学者]
13Elson DA、Thurston G、Huang LE、Ginzinger DG、McDonald DM、Johnson RS、Arbeit JM。在过度表达低氧诱导因子-1α的转基因小鼠中诱导无渗漏或炎症的高血管生成。基因发育。2001;15:2520–32. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
14Thurston G、Suri C、Smith K、McClain J、Sato TN、Yancopoulos GD、McDonald DM。转基因过度表达血管生成素-1小鼠的抗渗漏血管。科学。1999;286:2511–4.[公共医学][谷歌学者]
15Asahara T、Murohara T、Sullivan A、Silver M、van der Zee R、Li T、Witzenbichler B、Schatteman G、Isner JM。血管生成的假定祖细胞内皮细胞的分离。科学。1997;275:5302, 964–7.[公共医学][谷歌学者]
16Grant MB、May WS、Caballero S、Brown GA、Guthrie SM、Mames RN、Byrne BJ、Vaught T、Spoerri PE、Peck AB、Scott EW。成人造血干细胞在视网膜新生血管形成过程中提供功能性成血管细胞活性。自然医学。2002;8:607–12.[公共医学][谷歌学者]
17Rehman J，Li J，Orschell CM，March KL。外周血“内皮祖细胞”来源于单核细胞/巨噬细胞并分泌血管生成生长因子。循环。2003;107:1164–9.[公共医学][谷歌学者]
18Kinnaird T、Stabile E、Burnett MS、Lee CW、Barr S、Fuchs S、Epstein SE。骨髓基质细胞表达编码广泛动脉生成细胞因子的基因，并通过旁分泌机制促进体内外动脉生成。圆形Res。2004;94:678–85.[公共医学][谷歌学者]
19Gill M、Dias S、Hattori K、Rivera ML、Hicklin D、Witte L、Girardi L、Yurt R、Himel Rafii S。血管创伤诱导VEGFR2（+）AC133（+）内皮前体细胞快速但短暂的动员。圆形Res。2001;88(2):167–174.[公共医学][谷歌学者]
20Fox A，Smythe J，Fisher N，Tyler MP，McGrather DA，Watt SM，Harris AL.烧伤患者内皮祖细胞动员入循环。英国外科杂志。2008;95:244–51.[公共医学][谷歌学者]
21Chang EI、Loh SA、Ceradini DJ、Chang EI、Lin SE、Bastidas N、Aarabi S、Chan DA、Freedman ML、Giaccia AJ、Gurtner GC。年龄通过减少缺血期间低氧诱导因子1α的稳定来减少内皮祖细胞的募集。循环。2007;116:2818–29.[公共医学][谷歌学者]
22.Liu L、Marti GP、Wei X、Zhang X、Zhang H、Liu YV、Nastai M、Semenza GL、Harmon JW。糖尿病小鼠HIF-1α表达的年龄依赖性损伤：电穿孔辅助基因治疗的纠正可增加伤口愈合、血管生成和循环血管生成细胞。细胞生理学杂志。2008;217:319–27. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
23Mace KA，Yu DH，Paydar KZ，Boudreau N，Young DM。糖尿病环境中HIF-1α的持续表达促进血管生成和皮肤伤口修复。伤口修复再生。2007;15:636–45.[公共医学][谷歌学者]
24Zhang X、Wei X、Liu L、Marti GP、Ghanamah MS、Arshad MJ、Strom L、Spence R、James Jeng、Milner S、Harmon JW、Semenza GL。小鼠烧伤程度的增加与循环血管生成细胞动员延迟有关。Arch Surg公司。新闻界。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
25Iyer NV、Kotch LE、Agani F、Leung SW、Laughner E、Wenger RH、Gassmann M、Gearhart JD、Lawler AM、Yu AY、Semenza GL。O的细胞和发育控制2低氧诱导因子1α的体内稳态基因发育。1998;12:149–62. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
26Vasa M、Fichtlscherer S、Aicher A、Adler K、Urbich C、Martin H、Zeiher AM、Dimmeler S。循环内皮祖细胞的数量和迁移活性与冠状动脉疾病的危险因素呈负相关。圆形Res。2001;89：E1–7。[公共医学][谷歌学者]
27Yoder MC、Mead LE、Prater D、Krier TR、Mroueh KN、Li F、Krasich R、Temm CJ、Prchal JT、Ingram DA。通过克隆分析和造血干/祖细胞原理重新定义内皮祖细胞。鲜血。2007;109:1801–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
28Botusan IR、Sunkari VG、Savu O、Catrina AI、Grünler J、Lindberg S、Pereira T、Ylä-Herttuala S、Poellinger L、Brismar K、Catrina-SB。HIF-1α的稳定对改善糖尿病小鼠的伤口愈合至关重要。美国国家科学院院刊。2008;105:19426–31. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
29Loh SA、Chang EI、Galvez MG、Thangarajah H、El-ftesi S、Vial IN、Lin DA、Gurtner GC。老年人伤口愈合过程中SDF-1α的表达是HIF依赖性的。整形再造外科。2009;123：65S–75S。[公共医学][谷歌学者]
30Schwacha MG、Nickel E、Daniel T.烧伤引起的伤口炎症和愈合变化与低氧诱导因子-1α表达受到抑制有关。分子医学。2008;14:628–33. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
31Peng YJ，Yuan G，Ramakrishnan D，Sharma SD，Bosch-Marce M，Kumar GK，Semenza GL，Prabhakar NR。HIF-1α杂合缺陷会损害间歇性缺氧小鼠的颈动脉体介导的系统反应和活性氧生成。生理学杂志。2006;577:705–16. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
32Resar JR，Roguin A，Voner J，Nasir K，Hennebry TA，Miller JM，Ingersoll R，Kasch LM，Semenza GL.缺血性心脏病患者低氧诱导因子1α多态性与冠状动脉侧支循环。胸部。2005;128:787–91.[公共医学][谷歌学者]
33Hlatky MA、Quertermous T、Boothroyd DB、Priest JR、Glassford AJ、Myers RM、Fortmann SP、Iriinable C、Tabor HK、Assimes TL、Tibshirani RJ、Go AS。低氧诱导因子1的多态性和冠心病的初步临床表现。美国心脏杂志。2007;154:1035–42.[公共医学][谷歌学者]
34Sarkar K，Fox-Talbot K，Steenbergen C，Bosch-Marce M，Semenza GL.腺病毒转移到HIF-1a可增强糖尿病小鼠对严重肢体缺血的血管反应。美国国家科学院程序。2009;106:18769–74. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]