世界胃肠病学杂志。2005年1月14日；11(2): 293–295.
良性胆道狭窄机制的形态学和免疫组化研究
耿志敏、姚英敏、刘庆光、牛新杰、刘晓红，西安交通大学第一医院肝胆外科，中国陕西省西安市710061
收稿日期：2003年3月2日；2003年3月5日修订；2003年4月3日接受。
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目的：探讨良性胆道狭窄的发病机制。
方法：建立28只犬胆管损伤模型。分别于术后第3天、第1、3周和第3、6周切除吻合组织并进行光镜和电镜检查。免疫组化染色分别检测CD68、TGF-β1和α-SMA。
结果：胆管粘膜上皮恢复缓慢，慢性炎症持续时间长，成纤维细胞增殖活跃，细胞外基质过度沉积。肌成纤维细胞功能活跃，并贯穿于整个过程。术后1周至6个月，粘膜下固有层巨噬细胞、肉芽组织、成纤维细胞和血管内皮细胞TGF-β1、肌纤维母细胞α-SMA表达较强。
结论：胆管的愈合类型属于倒置。肌成纤维细胞是胆道瘢痕挛缩和狭窄的主要原因。CD68、TGF-β1和α-SMA的高表达与成纤维细胞增殖活跃、细胞外基质过度沉积和胆管瘢痕挛缩密切相关。
关键词：良性胆道狭窄，免疫组织化学
简介
良性胆道狭窄在胆道手术中很难处理。其术后表现为胆管瘢痕挛缩和狭窄，尤其是肝门及以上部位[1,2]. 为了探讨良性胆管狭窄的形成机制，本实验建立了胆管损伤修复动物模型。观察组织愈合过程中胆管损伤和修复过程中的组织学和超微结构变化。通过免疫组织化学染色动态检测不同愈合阶段巨噬细胞、TGF-β1和α-SMA的表达强度、阳性细胞计数和分布。
材料和方法
动物模型
用2.5%硫喷妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉了平均体重为15.3 kg的28只杂种狗。切开右上腹直肌，在十二指肠上缘2cm处分离总胆管（CBD）（分离范围在1cm以内）。然后在两侧垂直轴线之间横向切开中央商务区前壁，切口长度约为其周长的三分之一。然后采用显微外科技术，用无创Dexon缝合线对CBD切口进行吻合，针孔距离0.5-0.6mm，边缘距离0.3-0.4mm。然后闭合腹部。术后抗感染治疗3天，然后拔除引流管。
动物的一般状况
观察动物的一般情况和行为，包括饮食、活动、反应、引流和术后并发症。
组织学观察
以下病理检查适用于3号标本第个d、 在1中标准和3第个周和3周第个, 6第个术后1个月，每次随机选择5只犬。
取下吻合口和吻合口周围约2cm的组织，并将其固定在10%甲醛溶液中。标本分别用HE染色、Masson染色和Verhoeff染色进行显微镜观察。用VIDAS图像分析系统计算胶原面积百分比，观察胶原含量的变化。选择了气孔周围疤痕明显的一块组织，并将其修剪成1毫米的小块三在低温下，然后在2.5%戊二醛溶液中立即固定。用TEM（HITCH-600）观察并拍照。使用EIKO-IB-3型离子镀膜机将组织块镀金，并使用扫描电子显微镜（KYKY-2000）进行观察和拍照。为了测量细胞外胶原蛋白的含量变化，使用VIDAS图像分析系统分析TEM的每张照片，并根据三维分析原理计算相对细胞外体积密度（ECVD）的变化。
免疫组织化学观察
大鼠抗人巨噬细胞（CD68）单克隆抗体和大鼠抗人类平滑肌肌动蛋白（actin 1A4）单抗购自中山生物科技公司。兔抗人TGF-β1多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology Incorporation。第二抗体、山羊抗鼠IgG标记的生物素和山羊抗兔IgG标志的生物素是ZYMED掺入的产物。SP检测试剂盒是ZYMED公司的产品。
免疫组化SP法检测CD68、TGF-β1和α-SMA的表达，并与阳性和阴性对照组进行比较。用VIDAS图像分析系统分析各组切片单位面积内的阳性细胞数量，阳性细胞在细胞质中呈棕黄色颗粒染色。
统计分析
所有数据均表示为平均值±标准偏差。差异采用方差分析，CD68、TGF-β1和α-SMA表达采用线性相关分析。
结果
手术后动物的一般情况
术后12 d，1只犬死于胆瘘，2只犬分别于术后4、5个月死于梗阻性黄疸，25只犬存活。早期犬的食欲、活动和反应正常，但后期8只犬中有4只出现梗阻性黄疸，术后3个月出现食欲下降、体重减轻、尿色变深和高岭土大便。从腹腔排出平均30-40 mL血-血混合物。
组织学变化
胆管吻合口粘膜坏死，术后3d脱落，有急性炎症反应。术后1周造口表面渗出消失，粘膜下可见肉芽组织增生。胆管壁越来越厚。Masson染色和Verhoeff染色可见胶原纤维排列紊乱，粘膜下弹性纤维断裂成段，毛细血管样胶原排列不规则。术后3周吻合口粘膜出现慢性炎症反应，粘膜部分恢复。气孔壁增生，瘢痕组织明显增厚，部分纤维组织透明变性，毛细血管增生、扩张、充盈。在Masson和Verhoeff染色中，新胶原纤维大量增殖，密集排列在结节或年轮中。由微血管环绕的新胶原结节含有高密度成纤维细胞，放射状新胶原纤维密集排列。新生胶原结节区缺少弹性纤维。术后3～6个月，吻合口粘膜被慢性炎症细胞浸润，固有层有少量粘液腺，粘膜几乎完全修复，但排列紊乱，变薄。这里增生的毛细血管比以前退化得更多。气孔壁较前变薄，胶原纤维排列更加紊乱致密。肝脏标本显示肝脏充血和胆汁淤积。
超微结构变化
透射电镜术后1周，吻合口瘢痕组织中可见成纤维细胞增殖。细胞是活跃的，处于合成状态。细胞外可见许多胶原纤维，直径40-80nm。它们比正常细胞薄，密集排列成束，分散在周围，没有方向性。同时，可以观察到一定数量的较大、扁平和纺锤形肌成纤维细胞。细胞膜附近除了粗面内质网丰富、高尔基体发达外，还存在发育良好的微丝和平行长轴的致密体。此外，瘢痕组织中可见炎性细胞和渗出性红细胞浸润。术后3周，瘢痕组织中成纤维细胞和肌成纤维细胞的功能更加活跃。肌成纤维细胞百分比增加。微丝和致密体更容易观察到。粗面内质网扩张，中性粒细胞和红细胞数量减少。巨噬细胞和淋巴细胞在此阶段成为主要的炎症细胞。细胞外胶原纤维过度沉积，呈漩涡状或年轮状，密集分散排列。术后3个月，瘢痕组织中细胞仍保持活性，肌成纤维细胞数量达到最高。细胞外胶原纤维排列仍无方向性，部分胶原纤维融化成不规则团块。术后6个月，纤维细胞出现，但功能仍相对平静。肌成纤维细胞数量减少。胶原纤维开始显示出一定的方向性，并呈波浪状排列。
扫描电镜术后1周，吻合口粘膜上皮坏死脱落，无修复。术后3周，粘膜部分修复，但较正常粘膜变薄，绒毛低而扁平。术后3个月，粘膜修复基本完成，但粘膜上皮排列紊乱，乳头低平，间隙增大。
胶原纤维面积百分比与ECVD
术后不同阶段造口胶原纤维面积和ECVD的百分比如表所示.
表1
术后各组胶原纤维面积和EVCD百分比（%）(n个=5，平均值±SD）。
| 组 | 胶原纤维面积百分比 | EVCD公司 |
| 1标准周 | 54.38±3.86 | 58.23±4.56 |
| 三第个周 | 69.26±5.24 | 70.67±3.32 |
| 三第个瞬间 | 78.06±4.13 | 81.42±3.74 |
| 6第个瞬间 | 72.48±4.52 | 75.48±4.36 |
免疫组织化学观察
CD68在胆管粘膜固有层表达，但在粘膜下层表达较弱。正常对照组CD68表达为阴性。TGF-β1在肉芽组织、成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞的细胞质和细胞膜中表达。正常胆管壁纤维组织中TGF-β1表达较弱。α-SMA在肌成纤维细胞和平滑肌组织的细胞质中表达。在正常胆管壁中，α-SMA仅在少量平滑肌组织中表达（表).
表2
CD68、TGF-β1、α-SMA在胆管愈合中的表达(n个=5，平均值±SD）。
| 组 | CD68型 | 阳性细胞（%） | 转化生长因子-β1 | 阳性细胞（%） | α-SMA | 阳性细胞（%） |
| 正常 | - | 3.7±0.6 | -～+ | 12.3±3.5 | + | 14.4±5.3 |
| 1标准周 | ++～+++ | 65.3±5.3一 | +++ | 68.3±5.2一 | ++～+++ | 54.6±6.4一 |
| 三第个周 | ++ | 42.2±4.2ab公司 | +++ | 65.3±4.2一 | +++ | 63.1±5.7一 |
| 三第个瞬间 | ++ | 45.1±6.2ab公司 | ++～+++ | 59.4±5.0一 | +++ | 68.9±4.2一 |
| 6第个瞬间 | ++ | 39.3±4.4ab公司 | ++ | 55.1±6.4一 | ++ | 51.4±5.7一 |
讨论
瘢痕的形成是伤口愈合的必然结果，伤口愈合必然伴随着不同程度的瘢痕形成。胶原在病变区域过度沉积可能导致瘢痕过度增殖[三-6]. 术后良性胆道狭窄的主要表现是瘢痕挛缩和胆管狭窄，但狭窄形成的机制尚不清楚。我们发现胆管上皮细胞恢复较差，慢性炎症持续存在，成纤维细胞增殖活跃，胶原过度沉积于粘膜下层，愈合后重建较差。这些都导致瘢痕增生，吻合口狭窄发生率高。
近年来，肌成纤维细胞与瘢痕挛缩的关系逐渐明确[7,8]. 肌成纤维细胞是非典型的成纤维细胞，在超微结构上具有成纤维细胞和平滑肌细胞的特征。在本实验中，在瘢痕组织中观察到大量肌成纤维细胞。术后1周，肌成纤维细胞出现，术后3周达到高峰并维持较长时间。细胞的周期性增生和肉芽组织的增生性收缩几乎一致，表明肌成纤维细胞在愈合过程中起重要作用，是术后胆管瘢痕挛缩和胆管狭窄的重要原因。作为分化标志物，α-SMA可以区分肌成纤维细胞和成纤维细胞[9,10]. 我们的研究证实，肌成纤维细胞是良性胆道狭窄的重要原因。
伤口愈合的基础是炎症细胞和修复细胞之间的一系列相互作用。巨噬细胞作为一种主要的炎症细胞和免疫细胞，被认为是组织修复的“指导员”，它不仅参与组织的炎症和免疫反应，而且通过直接或间接、单一或协同的方式释放多种介质，影响组织的血管生成和纤维化[11,12]. TGF-β是与瘢痕形成密切相关的最受谴责的生长因子，是一种强大的有丝分裂原，在细胞分裂、增殖和迁移中发挥重要作用。这就是TGF-β1诱导肉芽组织形成的原因。如果这种功能变得太强，TGF-β1会导致瘢痕形成[13-16].
我们的研究不仅证实了TGF-β1的自分泌，还证实了CD68和TGF-，直接或间接在细胞与细胞外基质的相互作用中发挥重要作用，导致炎症细胞和修复细胞功能障碍以及胶原代谢紊乱，可能导致胆管损伤愈合时间延长、细胞外基质过度沉积、瘢痕挛缩、，吻合口狭窄。
我们的研究表明，CD68和TGF-β1的高表达可能与刺激胆汁引起的胆管壁慢性炎症有关。持续的炎症反应导致巨噬细胞大量聚集，巨噬细胞合成并分泌MDGF、TGF-β1、，等多肽生长因子可导致成纤维细胞高度增殖、胶原过度合成和胆管瘢痕狭窄。因此，减少胆汁刺激性炎症，缩短愈合时间，抑制巨噬细胞的过度浸润和过度功能，可以减少胆管瘢痕的增殖。
工具书类
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