用定点自旋标记研究膜结合α-突触核蛋白的结构

摘要

蛋白α-突触核蛋白是路易体的主要成分，路易体是一类细胞内包涵体，在帕金森病（PD）中具有高度特征(1). α-突触核蛋白在帕金森病中的致病作用已得到该病家族型遗传研究的支持(2–4)以及各种动物模型(5). 除了参与帕金森病，α-突触核蛋白还可能在阿尔茨海默病、路易体痴呆、多系统萎缩和Hallervorden-Spatz综合征中发挥重要作用(6,7).

虽然尚未完全理解，但α-突触核蛋白的生理功能可能涉及调节突触可塑性的作用(8)突触前小泡池大小和神经递质释放(9–11)以及囊泡回收(12). 与这些膜相关功能相一致，α-突触核蛋白已被证明与脂质体相互作用在体外(13–16). 根据圆二色性分析，这种相互作用导致α-突触核蛋白从溶液中的非结构单体发生构象变化(13,17,18)α螺旋膜结合蛋白。基于序列分析，人们很早就认识到α-突触核蛋白的N末端部分可能介导脂质相互作用(8,13). α-synuclein的N末端包含7个重复序列，每个重复序列由11个氨基酸组成(图1). 这些重复序列与载脂蛋白中发现的重复序列相似，有人提出α-突触核蛋白的脂质相互作用可能与载脂蛋白质的脂质相互影响相似(8,13). 随后通过分析α-突触核蛋白缺失突变体实验证实了N末端参与膜相互作用(15)脂质体结合的α-突触核蛋白的核磁共振研究(18–20). 后一项研究揭示了膜结合诱导的N末端重复区域的有序性，而高电荷C末端保持非结构化，因此不参与膜相互作用。然而，除了这些数据之外，直接的结构信息，例如膜结合α-突触核蛋白的精确位置、长度、方向和螺旋数，仍然未知。

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图1。

人α-突触核蛋白序列。140-aa人α-突触核蛋白含有7个N末端11残基重复序列（数字用罗马数字表示）。粗体字母表示对R1进行单一替换的位置。

更多关于α-突触核蛋白在SDS胶束存在下的结构，SDS胶粒也诱导了螺旋结构。SDS-结合α-突触核蛋白的核磁共振研究(19,20)发现存在两个延伸螺旋（残基1-41和45-94），在残基42、43和44处出现断裂。根据建模，这种延伸螺旋结构与每转3.6 aa的规则螺旋周期不一致(20). 然而，通过假设周期性轻微改变为每转3.67 aa，从而形成α-11/3螺旋线（11 aa组成3圈），数据可以得到调和(20).

本研究的目的是获得囊泡结合α-突触核蛋白的结构信息，并确定所提出的SDS-结合α-联核蛋白模型是否适用于膜结合形式(21,22). SDSL的基本策略要求在特定位置引入含氮氧化合物的侧链。最常用的侧链，通常称为R1（参见图6，其发布为支持信息通过标记特定的半胱氨酸残基生成。

分析R1标记蛋白质的EPR谱特征可以提供有关主干动力学、二级和三级结构以及残余距离的结构信息(21,22). R1标记蛋白质的EPR谱中包含的最重要特征之一是迁移信息。通过对R1迁移率的分析，人们可以区分至少三种不同的类别：引入环或未折叠区域的位点，有序结构表面的位点，或埋藏在蛋白质核心内的位点。在膜蛋白的情况下，可以通过研究R1对顺磁对撞机（如O）的可及性来获得额外的二级结构和膜形貌信息₂和螯合镍[镍（II）-乙二胺-N、 N个'-二乙酸（NiEDDA）](21).

我们对α-突触核蛋白膜相互作用的SDSL分析表明，N端重复区域形成一个延伸的螺旋结构，很少有三级接触，而C端保持未折叠状态。不同重复序列中的等效位置位于与膜邻近性相关的结构上可比较的位置，这表明了一种结构模型，其中单个11-aa重复序列占据三个螺旋匝。

材料和方法

α-突触核蛋白半胱氨酸突变体的产生和蛋白质纯化。M.Goedert（英国剑桥大学医学研究委员会分子生物学实验室）提供了克隆在pRK172质粒中的人类α-突触核蛋白。人类α-突触核蛋白不含任何半胱氨酸残基。半胱氨酸突变体的产生以及野生型和突变体蛋白的纯化已被描述(23).

单半胱氨酸蛋白质的自旋标记。蛋白质储备通过1×10过滤⁵MWCO旋转过滤器（Millipore）用于去除寡聚物。将DTT添加到样品中，最终浓度为1 mM。使用PD-10色谱柱（Pharmacia）在10 mM Hepes（pH 7.4）、100 mM NaCl缓冲液中通过尺寸排除去除DTT。在室温下，将MTSL自旋标记的5×摩尔过量[（1-氧基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-3-甲基）-甲硫代磺酸盐]与蛋白质样品孵育30分钟。使用PD-10列通过大小排除删除多余的自旋标签。由于标签的高反应性和折叠不良结构中引入的半胱氨酸的自由可及性，预计在这些条件下可以进行近定量标记。这种近定量标记确实通过几个测试案例的质谱法进行了验证。

EPR实验。在10mM Hepes（pH 7.4）、100mM NaCl缓冲液中，以1:250摩尔比将自旋标记的蛋白质（5μM）与小的单层囊泡孵育，并通过使用YM-100（Amicon）自旋过滤器浓缩和洗涤未结合的蛋白质。通过在Jasco（Easton，MD）J-810光谱仪上使用圆二色性监测螺旋结构的形成，独立确认了自旋标记α-突触核蛋白的膜相互作用。光学透明的单层囊泡含有30%的1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-（磷酸-我-丝氨酸）/70%1-棕榈酰-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱（wt/wt）（阿凡提极性脂质(24). 通过电子显微镜进一步对囊泡进行了表征，发现囊泡的平均大小为300–400Ω。在装有介质谐振器的Bruker（Billerica，MA）EMX光谱仪上，利用1.5G的场调制，在1.59 mW入射微波功率下记录了EPR谱₂和NiEDDA可达性（∏O₂和∏NiEDDA）通过使用常用的功率饱和方法进行测定(25). NiEDDA的最终浓度为3 mM，而O的最终浓度₂是与缓冲液平衡的空气。在对照实验中验证了我们的制剂的稳定性，这表明EPR谱和可接近性在一周的时间过程中没有变化。如中所述结果，在膜相互作用后变得有序的位点的光谱继续保留剩余的尖锐光谱成分。使用C.Altenbach（加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系）慷慨提供的软件，我们能够通过减去清晰的光谱成分来对光谱进行基线校正。减去的量通过各自光谱的双重积分进行估算，并与之前公布的估算值密切一致(13).

Φ参数的深度标定与分析。为了校准R1在不同位置的浸没深度，我们利用了之前建立的关系，即d[欧]=一·Φ +b条式中Φ=ln∏（O₂)/π（NiEDDA）。获取以下参数一和b条，我们使用了1-棕榈酰-2-硬脂酰-(n个-多西尔）-锡-发表的带有自旋标签的甘油-3-磷酸胆碱（阿凡提极性脂质），位于酰基链上的5、7和10个位置(25). 在上述条件下，对于含有α-突触核蛋白的囊泡中的自旋标记磷脂酰胆碱，我们发现一=5.9和b条=-4.1。

为了估计与膜结合α-突触核蛋白衍生物获得的Φ值相关的误差，对几个位点进行了三次实验，发现误差约为0.1–0.2个单位。通过使用在绘图员软件包（Golden software、Golden、CO）。拟合变量为振幅、偏移量、相位和周期。

结果

膜相互作用后α-突触核蛋白的构象变化。为了表征膜相互作用引起的结构变化，我们生成了R1标记的α-突触核蛋白衍生物，并记录了它们在溶液中以及与膜结合时的EPR谱。可溶性单体α-突触核蛋白的EPR谱已经发表过(23)但这里显示的是说明膜相互作用的潜在光谱变化。如所示图2（黑色），单体R1标记的α-突触核蛋白衍生物产生了尖锐的EPR线型，这是环状或未折叠区域的特征。这些结果与之前的研究非常一致，这些研究表明单体α-突触核蛋白在很大程度上是未折叠的(13,17,18).

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图2。

R1标记的α-突触核蛋白的重叠。在无（黑色）和有（红色）小单层囊泡的情况下测量样品。在100G扫描宽度下收集光谱，并将其归一化为相同的自旋数。数字表示引入R1的位置。

接下来，我们记录了R1标记的α-突触核蛋白衍生物在30%磷脂酰丝氨酸/70%磷脂酰胆碱小单层囊泡（直径≈300–400º，参见材料和方法). 如所示图2（红色），在重复区域（残基41、70、73、75和79）引入R1时检测到光谱变化。相反，在最后40 aa内的位置观察到很少或没有变化，这证实了在重复区域内发生构象变化，但在蛋白质的C末端部分内没有变化(18–20).

先前的研究表明，α-突触核蛋白的脂质体相互作用取决于囊泡的尺寸，较小的高度弯曲的囊泡导致最强的相互作用(13,16). 然而，即使对于本研究中使用的小单层囊泡，已知膜相互作用不完全，约10–15%的蛋白质未结合(13). 使用类似于参考文献中所述的凝胶过滤实验。13，我们对本研究中使用的脂质体获得了类似的结果（数据未显示）。与这些结果一致，我们在膜载α-突触核蛋白衍生物的EPR谱中观察到少量类似于可溶性形式的残留尖锐成分。该组分的总量与10-15%的未结合蛋白一致，尽管少量非特异性背景标记可能会进一步促进这些品系的形成。如中所述材料和方法，这些光谱成分可以很容易地减去。在重复区域内标记的膜结合α-突触核蛋白的所有光谱(图3)表现出高度相似的线型，这是脂质或溶剂暴露螺旋表面位点的特征。此外，一些光谱中存在少量不动组分，例如在位置35和41处（见指向其他外峰的箭头）。虽然同一螺旋内最近的相邻接触会导致这种固定(26)不同蛋白质之间偶尔的碰撞可能会进一步导致观察到的线形。然而，总的来说，所有地点的固定程度仍远低于球状埋藏地点的典型观察结果(27–29)或包装良好的膜蛋白(30,31). 对EPR谱中心线宽的分析进一步支持了这一发现，如图3。中心线宽（或其倒数）是一个常用的移动性参数。埋藏地点具有高度特征光谱，线宽值为5至8G(27–29). 相比之下图3具有2.8和4.25G之间的中心线宽值，因此不能被认为是掩埋的。

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图3。

膜结合α-突触核蛋白的EPR谱。以100 G的扫描宽度收集与小单层囊泡结合的R1标记的α-突触核蛋白的光谱，并将其归一化为相同数量的自旋。从原始光谱中减去剩余的尖锐光谱成分（参见材料和方法). 箭头表示固定组件。

二级结构和膜拓扑。为了进一步完善膜结合α-突触核蛋白的二级结构和拓扑结构，我们测定了O₂和NiEDDA可达性（∏O₂和∏NiEDDA），用于位于重复序列V–VII中的残基59–90（参见材料和方法). 非极性O₂优先分配到膜中，而极性更强的NiEDDA优先分配到溶剂中(21). 因此，高O₂-可接近的残留物暴露在膜中，而更多的NiEDDA暴露残留物则暴露在溶剂中。

∏O型₂和∏NiEDDA表现出异相周期性，这是不对称溶剂化螺旋的特征，其中一面暴露于磷脂，另一面暴露于溶剂（见图7，发布为支持信息在PNAS网站上）。O中包含的膜地形信息₂R1的NiEDDA可达性可以方便地用对比参数Φ[Φ=ln（∏O₂/∏NiEDDA）]，数值越大，表明膜插入深度越深。如所示图4A类Φ值显示出明显的周期性，与螺旋结构一致。残留物59、63、67、70、74、77、81、85和89具有较高的Φ值并且暴露在油脂中(图4A类，红色），而残基61、65、68、72、76、79、83、86和90的Φ值较低，并且暴露在溶剂中(图4A类，绿色）。最大值彼此非常相似，表明所有油脂暴露部位的浸没深度都相当。这一结果与外周结合螺旋而非跨膜螺旋的概念密切一致；在后一种情况下，随着残基接近双层中心，相应的值将首先线性增加，然后随着残基远离双层中心而减少(21).

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图4。

R1标记的α-突触核蛋白的二级结构和拓扑结构。(A类)O的比率₂通过对比参数Φ总结了NiEDDA的可达性。高Φ值表示脂质暴露位点（红色），而低Φ值表示溶剂暴露位点（绿色）。虚线表示余弦函数的最佳拟合，导致每转3.67 aa的周期。(B类)当残留物以每转3.67 aa的周期在螺旋轮上绘制时，油脂暴露部位（红色）位于一侧，而溶剂暴露部位（绿色）位于另一侧。白色圆圈表示Φ值既不是最大值也不是最小值的残数。灰色显示的残留物未经测试。指示重复位置（编号1-11）。

先前的SDSL研究表明Φ值与膜插入深度成正比，插入深度可以通过使用含有自旋标记磷脂的囊泡进行校准(25). 基于中所述的校准材料和方法，我们估计脂涂层R1侧链的平均浸没深度（Φmaxima）约为11º。应该强调的是，该浸没深度对应于R1侧链的N-O部分的位置。自然，在膜表面结合螺旋中，面向膜的R1侧链将指向螺旋之外的膜。因此，这些残留物的浸泡深度将比螺旋骨架的深度更深。为了将观察到的浸泡深度与螺旋骨架的浸泡深度联系起来，我们检查了蛋白质的晶体结构，其中R1被引入螺旋结构中(26). 在这些结构中，R1硝基部分和螺旋中心之间的距离在7–10º范围内。基于这些简单的几何考虑，我们估计螺旋的中心位于≈1–4º的浸没深度，进一步支持了α-突触核蛋白不会深入膜的观点(32). 这一估计也属于相关载脂蛋白序列的预测范围(33)并与最近对18-aa载脂蛋白a-1衍生肽的x射线衍射研究结果一致，该研究表明磷酸盐下方的浸泡深度约为3º(34).

为了进一步表征Φ图中的潜在周期性，我们将数据拟合到也表现出规则周期振荡的数学函数。图4A类示出了数据与余弦曲线的最佳拟合，年-偏移、相位和周期是变量。如图所示，拟合很好地再现了Φ的周期性，结果是每转3.67 aa(R（右）²= 0.87). 该值与理想螺旋线（每转3.6 aa，R（右）²= 0.48; 参见图8，发布为支持信息（PNAS网站上）表明11个氨基酸（而不是理想的10.8个氨基酸残基）可能会构成三个回合。与此想法一致，我们发现基于每转3.67 aa的周期性的螺旋轮很好地代表了数据。如所示图4B类，所有暴露在油脂中的残基（红色圆圈）都落在螺旋的一个面上，而暴露在溶剂中的位点（绿色圆圈）则落在相反的面上。

根据该模型，给定残留物的膜接近性由其在重复中的位置决定。例如，重复位置3和7始终暴露在油脂中，而重复位置1和5始终暴露在溶剂中。如果重复1到4的结构相似，我们会期望有类似的模式。为了验证这一概念，我们测定了早期重复序列中重复位置1和5的残基（残基9、31和35）以及重复位置3和7的残基的Φ值（残基26、33和44）。残基9、31和35的Φ值<1.0（分别为0.36、0.56和0.63），这表明它们是溶剂暴露位点，而残基26、33和44的Φ值>2.0（分别为2.20、2.87和2.06），这与这些残基的脂质暴露一致。因此，来自这些位置的数据与预测非常一致，即相同的重复位置很可能位于与膜接近的等效位置。

讨论

本研究的主要目的是描述单体α-突触核蛋白与磷脂囊泡结合时发生的结构转变。与早期研究一致(15,18–20)，我们发现膜相互作用是由α-synuclein的N末端区域介导的，该区域包含7个11-aa重复序列。相反，即使在存在膜的情况下，蛋白质的带高度负电荷的C末端区域仍然没有结构(图5A类).

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图5。

膜结合α-突触核蛋白的结构模型。(A类)α-突触核蛋白与负电荷膜相互作用时发生的结构变化示意图。α-突触核蛋白的N末端重复区域变成螺旋状并介导膜相互作用。相反，高负电荷的C末端不与脂质相互作用。还显示了电荷分布。α-突触核蛋白的负电荷（蓝色圆圈，负）暴露在溶剂中，而赖氨酸残基（红色/黄色圆圈，正）处于头部基团的负电荷水平（黑色圆圈，负）。(B类)实验测定的脂质和溶剂暴露部位分别为红色和绿色。白色残留物既不会最大程度地暴露在油脂中，也不会暴露在溶剂中。灰色残留物未经测试。螺旋轮周围的数字表示重复位置。(C类)重复序列I–VII的氨基酸序列表。重复位置如表所示。绿色列表示可能暴露于溶剂的重复位置，而红色的重复位置可能暴露于脂质。位置8和9用绿色条纹表示两者暴露的溶剂几乎相等，并且对于给定回合内的两个残基中哪一个更容易接触溶剂可能会有一些变化。同样的考虑因素，除了与脂质接近性有关外，适用于位置10和11，这些位置用红色条纹表示。

N末端重复区内所有41个测试位点的膜结合α-突触核蛋白的EPR谱彼此非常相似。这些位点中的每一个都产生指示与溶剂或磷脂接触的螺旋表面位点的光谱。所有测试位点缺乏强大的R1固定或环路形成，这强烈反对重复区域中的球状或紧密堆积结构。与这一概念一致，重复序列V–VII的连续扫描直接证明了该区域形成了一个单一的细长螺旋。

这种螺旋结构不仅是连续的，没有明显的第三次接触，而且它的折叠方式使相邻的11-aa重复序列中的每一个组成三圈(图4). 事实上，如果单个重复序列不能完全完成螺旋旋转，那么连续重复序列可能很难与膜结合。在这种情况下，接下来的重复将首先必须完成剩余的螺旋旋转，从而在不同的位置连续启动。这里的情况并非如此，因为不同重复中的相同位置落在螺旋轮中的等效位置上，并且具有可比较的膜邻近性。

虽然我们没有测试重复序列I至IV中的每个站点，但对前四个连续重复序列中的关键站点的分析强烈表明，这种结构适用于所有七个重复序列，并且综合螺旋轮汇总了所有重复序列的可访问性数据，如所示图5B类.

对蛋白质序列的检查进一步表明，这种结构通常适用于所有重复序列(图5C类). 例如，所有带负电荷的残基都只位于溶剂暴露的重复位置1、5、8和9(图5A类和B类). 这一结果特别重要，因为带负电荷的残留物会在暴露于疏水膜内部或带负电荷头部基团区域的位置破坏稳定性。

与溶剂暴露重复位置处带负电残基的高密度相反，重复位置2和4处的14个残基中有11个由赖氨酸组成。尽管赖氨酸的正电荷也会使膜内部不稳定，但赖氨酸在头部基团区域的极性/非极性界面上稳定有几个原因。首先，这些残基的正电荷可以与脂头基团的负电荷有利地相互作用(图5A类). 此外，赖氨酸部分具有相对较长的疏水脂肪族链，其可以与双层的烃类区域有利地相互作用。赖氨酸与疏水和亲水区域的这种二分相互作用最初被提出用于载脂蛋白(35)，通常被称为“浮潜”。本研究中估计的浸没深度属于浮潜发生的预测范围(33).

与上述考虑一致，假设的脂质相互作用位点均不含带电残基。位置7几乎完全由缬氨酸残基和一个丙氨酸残基组成（重复VII）。同样，位置10和11缺乏任何带电或极性残基，尽管存在三个甘氨酸残基（见下文）。重复位置3也是一个主要的膜相互作用位点，主要由苏氨酸残基组成。虽然苏氨酸是一种极性氨基酸，但已在跨膜螺旋体的脂质表面鉴定出它，并被认为具有与丙氨酸和缬氨酸类似的膜相互作用特性(36). 定点突变研究进一步支持了重复位置3处残基的直接膜相互作用，研究表明，在这些位置引入带电残基会抑制膜相互作用(15).

螺旋曲率通常是螺旋周期变化的补充。例如，在左手螺旋线圈的情况下，使用螺旋轮模拟每转3.5 aa的周期，其中等效位置相隔7 aa，并始终落在螺旋轮上的相同位置。尽管螺旋轮模型有助于预测氨基酸之间的相对位置，但事实上，螺旋线圈并不是周期性改变的直螺旋。相反，它们是连续弯曲的α螺旋。螺旋轮模型和固有结构之间的差异是由于螺旋轮是相对于特定参考点绘制的。在螺旋线圈的情况下，该参考点是蛋白质-蛋白质接触面。由于天然结构中螺旋相互缠绕，该参考点不断移动，因此类似位置被放置在与蛋白质-蛋白质界面等效的位置。

在α-突触核蛋白的情况下，产生螺旋轮的参考点位于α-螺旋和膜表面之间。基于这些考虑，可以设想形成一个细长的、连续的α-螺旋结构，其弯曲方式使得类似的重复位置占据了与膜或脂质邻近性相关的等效位置。这种结构可能不仅适用于α-突触核蛋白，也适用于其他11-aa-重复蛋白质，如载脂蛋白(37,38)包裹在规定大小的脂质颗粒周围。螺旋曲率和最有利的囊泡或脂质粒径之间是否存在一般互补性，以及不同重复序列之间的氨基酸插入可以发挥什么作用，仍需确定。

值得注意的是，α-突触核蛋白可以结合到比单层小泡更弯曲的表面。这种能力可以通过SDS胶束中α-螺旋结构的形成来证明，SDS胶粒的周长通常为150º(39). 然而，SDS相互作用和此处研究的SDS相互影响之间的一个关键结构差异是，SDS交互作用导致形成两个被含有残基42–44的环区打断的细长螺旋(19,20). 我们在位置43和44上的数据显示这两个位点都是有序的，残基44充当膜相互作用位点。由于90个或更多氨基酸的连续α-螺旋线长度至少为130º，因此它必须几乎完全包裹SDS胶束，但跨度仅约为小单层囊泡周长的20%。因此，SDS胶束的曲率应变可能需要在其中点（残基42-44）附近破坏细长螺旋。

结合我们最近对α-突触核蛋白淀粉样纤维结构的分析(23)，本研究说明了SDSL可以研究的各种不同结构。除了研究α-突触核蛋白推定生理功能的结构基础外，SDSL还可以用于研究从未折叠或螺旋突触核转变为有毒寡聚体形式时的构象变化(40). 在这方面，值得注意的是，至少在某些条件下，膜相互作用可以促进这种低聚物的形成(41–43)膜相互作用的调节可能是形成有毒低聚物的原因体内(44,45). 因此，这里讨论的螺旋膜结合形式的分子理解可能是我们理解疾病中发生的错误折叠的重要起点。

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：PD、帕金森病；SDSL，定点自旋标记；NiEDDA，镍（II）-乙二胺-N个,N个'-二乙酸。

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