促进癌细胞存活的辐射诱导信号通路（综述）

摘要

1.简介

放射治疗作为癌症治疗的主要手段，在局部疾病控制中发挥着关键作用。当与化疗（即化学放疗）结合时，放疗提供了额外的益处，从而更好地控制疾病并显著提高癌症患者的生存率(1——三). 然而，放射抗性和放射治疗后残留疾病的存在仍然是导致治疗效果丧失的主要问题(4——7). 目前，无论是预测放射治疗对单个癌症患者的益处还是对癌细胞的放射增敏作用，都没有可用的临床方法。因此，对辐射后促进癌细胞存活的机制的进一步了解可以帮助制定药理学策略来提高辐射治疗的疗效。

辐射暴露可诱导多种细胞信号通路，从而导致细胞反应，包括凋亡、细胞衰老和细胞周期检查点激活/DNA修复(8). 在辐射诱导的促生存信号通路中，一些参与诱导细胞周期阻滞和促进DNA修复，而其他参与抑制凋亡诱导(9,10). 这些途径协同作用，保护癌细胞免受辐射的细胞毒性影响，最终导致放射抗性的发展。本文综述了电离辐射对癌细胞存活有积极影响的信号通路。

2.HER（也称为ERBB或EGFR）信号

受体酪氨酸激酶（RTKs）的HER家族由定位于细胞膜上的HER1、HER2、HER3和HER4组成(11). HER RTK具有类似的蛋白质结构，包含细胞外区域（配体结合和二聚体结构域）、跨膜区域和细胞内区域（蛋白酪氨酸激酶结构域和磷酸化调节尾）(12). 在HER受体中，HER2没有已知配体，HER3的激酶活性很低(12). 配体与HER1、HER3和HER4的配体结合域的结合导致受体的同源或异源二聚化，随后在受体的c末端调节尾中的几个酪氨酸发生反磷酸化(12). 磷酸化酪氨酸形成下游适配器和信号传感器的对接位点，激活下游信号通路，包括PI3K/AKT、RAS/RAF/MEK/ERK、磷脂酶C-γ/蛋白激酶C和JAK/STAT通路(13,14). 在这些途径中，PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK级联被证明在辐射后的细胞存活中起重要作用(图1) (15).

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图1

辐射诱导HER受体活化，进而激活PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路，促进细胞存活。

此前曾报道过电离辐射后HER1磷酸化增加，表明HER激活(16——18). 我们最近对人类乳腺癌细胞的研究表明，电离辐射不仅会导致HER1的磷酸化增加，还会导致HER2、HER3和HER4的磷酸化增加(19). 虽然负责HER受体磷酸化的机制尚未确定，但先前的研究表明，抑制HER RTK磷酸化的受体蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）可以通过氧化被活性氧/氮物种（ROS/RNS）有效抑制(20). 先前的研究也表明辐射通过线粒体依赖机制诱导ROS/RNS的产生(21). 因此，响应辐射产生的ROS/RNS可能导致PTPs的抑制，从而导致HER-RTK的激活。需要进一步研究，以检查辐射后HER RTK激活的可能性。

HER-RTK的抑制已被证明可增加癌细胞的放射敏感性。HER泛抑制剂CI-1033对HER RTK的抑制可显著提高人结肠癌细胞的放射敏感性在体外和体内(22)而吉非替尼对HER1的抑制和赫赛汀对HER2的抑制分别使EGFR扩增的胶质瘤细胞和乳腺癌细胞放射增敏(23,24). 一般来说，HER受体的促生存功能至少涉及两种可能的机制。第一种机制是基于HER受体激活AKT和ERK1/2信号的能力，它们在抑制细胞凋亡中起关键作用(15). HER受体促生存功能的另一种可能机制是通过调节细胞周期检查点反应和DNA修复。在我们最近的研究中，我们发现辐射后HER2的激活对于G2/M细胞周期检查点反应的激活是必要的(19). 此外，据报道，HER1可促进DNA-依赖性蛋白激酶（DNA-PK）的激活，DNA-PKs在NHEJ介导的DNA双链断裂（DSB）修复中起着重要作用(25,26).

3.细胞外信号调节激酶（ERK1/2）途径

在多种细胞类型中，电离辐射诱导MAPK家族成员的快速激活，包括ERK1/2、JNK和p38(27,28). 其中，辐射诱导的ERK1/2信号激活已被证明在促进细胞对辐射的反应中发挥重要作用(29——31).

辐射后，ERK1/2通过MEK1/2的双重酪氨酸和苏氨酸磷酸化被激活，而激活反过来又导致160多个底物的磷酸化/活化(32). 其中一些底物是转录因子，调节编码抗凋亡蛋白的基因的表达(27,32). ERK1/2信号传导靶向的最具特征性的抗凋亡转录因子是环AMP反应元件结合蛋白（CREB）和CAAT/增强子结合蛋白β（C/EBP-β）。作为对辐射的反应，ERK1/2磷酸化/激活p90^rsk公司激酶，它反过来激活CREB和C/EBP-β，从而诱导许多抗凋亡蛋白的表达，包括Bcl-xL、Mcl-1和C-FLIPs(33——35). 此外，ERK1/2可以直接磷酸化和抑制一些促凋亡蛋白，包括Bad、Bim和caspase 9(36——39). 因此，通过增加抗凋亡蛋白的表达/活性和抑制促凋亡蛋白的活性，辐射诱导的ERK1/2信号激活的净效应是抑制受照细胞的凋亡。

我们小组和其他小组的研究表明，辐射后ERK1/2信号的激活对于G2/M细胞周期检查点的激活是至关重要的(29,31,40——42). 辐射诱导ERK1/2信号是激活G2检查点关键调节器所必需的，尤其是ATR和BRCA1(31,42). ERK1/2信号通路在促进DNA修复中也起着重要作用。辐射诱导的ERK1/2信号传导与DNA修复相关基因的转录上调有关，如ERCC1、XRCC1和XPC公司(43,44). 此外，ERK1/2信号可以激活DNA-PK（在NHEJ介导的DSB修复中起关键作用）和PARP-1（识别受损DNA上的单链DNA断裂（SSB））(44——47). 此外，ERK1/2信号通路作为共济失调毛细血管扩张症突变（ATM）依赖性同源重组（HR）DSB修复的阳性调节器发挥作用(48). 因此，ERK1/2信号通过促进G2/M细胞周期检查点激活和增加DNA修复，积极调节辐射后的癌细胞存活。与这些观察结果一致，越来越多的研究表明，Ras的组成性激活导致癌细胞的放射抗性增加，而MEK或ERK的抑制导致癌细胞放射增敏(29,40,41,49).

虽然辐射激活ERK1/2信号的确切机制尚未明确阐明，但有人提出了几种信号机制参与这种激活。正如我们和其他人所证明的那样，电离辐射后HER家族受体的快速激活有助于乳腺癌和肺癌细胞ERK1/2信号的激活(17). 此外，HER受体的这种作用涉及Ras GTPase。已证实Ras对HER受体激活（主要是HER1和HER2）的反应激活，Ras-N17显性阴性突变体的异位表达通过辐射消除了ERK1/2的激活(50,51). 通过将Grb-2募集到激活的HER受体，Grb-2被激活并与SOS蛋白形成复合物，从而触发Ras/Raf/MEK/ERK信号的激活(图1) (50,51). 此外，激活的Ras可以诱导HER1配体的产生，通过自分泌反馈回路进一步激活HER1，然后Ras/Raf/MEK/ERK信号(52,53). 辐射诱导ERK1/2激活的另一机制涉及肿瘤抑制因子BRCA1。我们实验室的研究表明，使用shRNA降低乳腺癌细胞中BRCA1的表达显著降低了辐射后ERK1/2信号的激活(42). 相反，使用药物抑制剂或siRNA抑制ERK1/2信号也会导致辐射乳腺癌细胞中BRCA1蛋白的不稳定(42). 这些结果表明，ERK1/2和BRCA1对电离辐射的反应存在正反馈回路。最后，DNA损伤传感器ATM也与辐射诱导的ERK1/2激活有关(48). 辐射后激活ERK1/2需要ATM，因为ATM抑制部分阻断辐射诱导的ERK1/2激活(48). 相反，抑制ERK1/2信号也可以减弱辐射诱导的ATM磷酸化，以及ATM向DNA损伤灶的募集(48). 这些研究表明，辐射响应中存在另一个正反馈回路，这一次涉及ATM和ERK1/2。总的来说，这些研究表明，ERK1/2信号通路在辐射反应中的激活受多种相互调节的信号通路的调节。

4.AKT信号通路

AKT信号通路在细胞生存中起着至关重要的作用。在各种类型的恶性肿瘤中检测到这种信号级联的异常激活，并与肿瘤发生有关(54). AKT通过抑制凋亡信号级联和激活促生存信号通路发挥促生存因子的作用(图2). 激活后，AKT磷酸化并抑制一些促凋亡Bcl-2家族成员，包括Bad、Bax和Bim(55——57). 此外，通过直接抑制和排除促凋亡转录因子FOXO3a（Forkhead box O3），AKT还抑制促凋亡因子Bim和Noxa的表达(58——61).

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图2

PI3K/AKT介导的信号传导促进细胞存活。i） 辐射激活PI3K导致AKT磷酸化/活化；ii）AKT磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad、Bax、Bim和Noxa；iii）AKT磷酸化并激活促生存转录因子NF-κB，导致促生存基因上调BCL-2型和BCL-XL型; iv）AKT磷酸化促生存蛋白XIAP，结合并抑制诱导凋亡所需的caspase 3/7/9；v） AKT磷酸化/激活mTOR激酶，后者磷酸化/活化抗凋亡蛋白Mcl-1；vi）FOXO3a上调促凋亡蛋白Bim和Noxa的基因表达。AKT对FOXO3a的磷酸化导致蛋白质的抑制和细胞核排斥。

AKT也积极调节抗凋亡途径(图2). AKT诱导NF-κB转录因子活化，从而促进广泛的抗凋亡基因的转录，尤其是BCL-2型和BCL-XL型(62). 此外，AKT磷酸化/激活促生存蛋白XIAP（凋亡蛋白X连锁抑制剂），导致XIAP与caspases 3、7和9的结合增加，并抑制这些caspases，这些caspase的活性对诱导凋亡至关重要(63). AKT靶向的另一个关键促生存途径是mTOR信号通路。AKT磷酸化并激活mTOR激酶，导致抗凋亡蛋白Mcl-1磷酸化/激活(64,65). 此外，AKT对低氧诱导的细胞凋亡具有负调节作用。放射治疗后，辐射往往会在组织中诱导缺氧，并可能导致受损组织中的细胞凋亡(66,67). 低氧诱导的细胞凋亡需要糖原合成酶激酶（GSK）激活线粒体依赖性死亡信号通路(67,68). 然而，辐射后激活AKT可以通过磷酸化抑制GSK的活性，从而激活糖酵解和葡萄糖转运，抑制凋亡诱导(69). 最后，AKT直接参与辐射后DNA-PK催化亚单位的激活，促进NHEJ介导的DSB修复，从而提高细胞存活率(70). 这些研究确立了AKT介导的信号通路在癌细胞对辐射反应中的促生存作用。

人们广泛观察到PI3K/AKT信号通路对电离辐射的反应(15). 这种激活的一种可能机制涉及HER RTK。HER RTK激活后，HER3羧基末端调节尾中的磷酸化酪氨酸可形成6个对接位点，用于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）p85适配器亚基的招募(71). 随后，PI3K的p110催化亚基磷酸化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌糖醇(三,4,5)-三磷酸（PIP3），然后导致膜募集和激活含有磷脂结合（PH）结构域的蛋白质，如磷酸肌醇依赖性激酶（PDK）1(72). 活化的PDK1磷酸化AKT-Thr308并导致初始AKT活化(72). AKT的完全激活需要PDK2进一步磷酸化其Ser473(72). 此外，突变K-Ras还通过激活EGFR配体的自分泌，对辐射反应中PI3K-AKT信号的激活起到积极作用(73,74).

PI3K/AKT信号转导的促生存功能有望积极促进肿瘤细胞的放射抗性。事实上，越来越多的研究表明，通过药物抑制剂或基因途径抑制PI3K/AKT信号传导，可增强癌细胞的放射敏感性在体外和体内(75——77). 此外，PI3K/AKT抑制增加辐射敏感性涉及DNA修复的减少和凋亡诱导的增强(70,75,76,78,79). 另一方面，在一些基于细胞的模型中，抑制PI3K/AKT对辐射敏感性影响不大(29,80——83)表明PI3K/AKT非依赖机制参与辐射敏感性的调节。

5.细胞周期检查点信号

为了应对DNA损伤，细胞周期检查点经常被激活，以阻止细胞周期的进展，从而为细胞修复损伤留出时间(84). 根据检测到损伤的细胞周期阶段，细胞可以被阻滞在细胞周期的G1/S或G2/M边界(图3) (84). 如果损伤是不可逆转的或细胞周期检查点功能失调，可能会触发凋亡来消除受损细胞(84). 因此，功能正常的细胞周期检查点通过抵消DNA损伤的细胞毒性来促进细胞存活。

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图3

辐射诱导G1和G2细胞周期检查点激活和DNA修复。大多数癌细胞在G1检查点有缺陷，通常是由于G1检查点关键调控因子的突变/改变（蓝色），但包含功能性G2检查点。

G1/S转换由Cdk4/6激酶和细胞周期蛋白D的活性控制，其活性主要由p53/p21途径调节(80). G2/M边界由Cdc2/Cyclin B复合物紧密控制，其活性是细胞周期G2/M过渡所必需的(85). 大多数癌细胞中的G1检查点都有缺陷，通常是由于G1检测点关键调控因子（p53、Cyclin D等）的突变/改变所致(80)而G2检查点的激活在癌细胞中很少受损，因为该检查点主要通过p53依赖性机制发挥作用(图3) (86). 事实上，在缺乏功能性G1检查点的癌细胞中，取消G2检查点通常会使细胞对辐射敏感(87).

先前的研究确定Cdc2-Y15是G2检查点控制辐射反应的重要位点(88). Cdc2-Y15被磷酸化以响应辐射暴露，并且在辐射诱导的G2/M阻滞期间保持这种磷酸化(88——90). Cdc2-Y15被Wee1和Myt1激酶磷酸化(91,92)并被Cdc25双特异性磷酸酶去磷酸化(93).

ATM和ATR介导的信号通路在辐射诱导的细胞周期检查点反应中发挥重要作用(84). 为了应对辐射诱导的DNA损伤，ATM和ATR激酶被迅速激活，进而激活其各自的下游靶点，包括p53以及Chk1和Chk2激酶(图3) (84). Chk1和Chk2的激活导致Cdc25的磷酸化，导致通常在G2/M边界激活Cdc2/Cyclin B的Cdc25亚细胞隔离、降解和/或抑制(94). Chk2还可以磷酸化p53-Ser20，诱导辐射后p53蛋白的稳定(84). ATM、ATR和Chk2激酶激活p53导致p21蛋白的诱导，p21蛋白可以直接抑制Cdc2/Cyclin B复合物的活性(84).

总之，辐射诱导的细胞周期检查点信号通路促进细胞周期阻滞，而细胞周期阻滞反过来又对细胞对辐射的生存作出积极贡献。

6.DNA修复途径

电离辐射引起的细胞毒性主要是DNA损伤的结果。辐射会导致几种形式的DNA损伤，包括SSB、DSB、糖和碱修饰以及DNA-蛋白质交联(95,96). 其中，DSBs不仅是电离辐射造成的主要损伤形式(97,98)也是最致命的DNA损伤形式，因为未修复的DSB可能导致细胞死亡(97,99).

作为对电离辐射的响应，磷酸肌醇3-激酶相关激酶（PIKK）的激活，包括ATM、ATR和DNA-PK，可以传递和放大DNA-损伤信号，触发DNA修复装置在损伤部位的组装并启动DNA修复(10). DSB通过两种竞争机制之一修复：非同源末端连接修复（NHEJ）和同源重组（HR）(10)这两种机制均由PIKK监管。在不需要序列同源性的情况下，NHEJ在一个通常在连接点产生错误的过程中重新加入自由端(100). Ku70/Ku80异二聚体识别两端，然后招募DNA-PK(100). 一旦形成，这些复合物将末端聚集在一起，以便进一步处理并通过DNA连接酶IV连接(100). 与NHEJ相比，HR以非常高的保真度准确地修复DSB(100). 这个过程在S期和G2期进行，利用完整的姐妹染色单体中的序列信息修复DSB(100). 辐射也会产生SSB，主要是通过ROS/RNS驱动的碱氧化(98). 这种损伤的修复采用碱基切除修复，即使用DNA糖苷酶和AP内切酶去除受损的碱基，然后通过DNA聚合酶和DNA连接酶的作用填补缺口(101). 因此，成功的DNA修复可以促进细胞对辐射的反应，而修复DNA损伤的失败会增强辐射的细胞毒性效应，导致细胞死亡。

7.结论

放射治疗作为一种护理标准，在癌症治疗中发挥着重要作用。然而，放射抗性仍然是限制放射治疗癌症疗效的主要障碍。为了提高放射治疗的疗效，我们有必要充分了解驱动癌细胞克服辐射诱导的细胞毒性的信号网络，从而实现生存。如上所述，电离辐射引起的致命细胞毒性主要是DSB的结果。然而，辐射也会同时诱导多种信号通路，从而保护细胞免受辐射的细胞毒性影响。其中，HER受体、ERK1/2和AKT介导的信号阻止受照细胞发生凋亡诱导，而ATM、ATR和DNA-PK介导的信息则促使细胞进入周期阻滞并启动DNA修复。此外，HER ERK1/2和AKT信号也积极调节细胞周期检查点反应和DNA修复机制。因此，这些信号通路共同作用，将细胞从辐射诱导的损伤中拯救出来，并促进生存(图4). 为了克服放射治疗的耐药性，未来的研究应侧重于开发药理方法，以阻断辐射细胞中这些促生存信号通路的激活。

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图4

促进细胞存活的辐射诱导信号通路概述。辐射激活ATM、ATR和DNA-PK信号导致细胞周期阻滞和DNA修复。辐射激活HER、ERK1/2和AKT信号通路抑制细胞凋亡诱导。辐射后HER、ERK1/2和AKT信号的激活积极调节细胞周期检查点反应和DNA修复。

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