核酸研究。2004; 32(8): 2298–2305.
α1诱导的DNA弯曲是Mcm1–α1复合物转录激活所必需的
美国新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学瓦克斯曼研究所及分子生物学和生物化学系，邮编08854
收稿日期：2003年12月23日；2004年4月1日修订；2004年4月1日验收。
摘要
酵母Mcm1蛋白是MADS-box转录因子家族的创始成员，该家族通过与不同辅因子蛋白的相互作用参与调节不同的基因集。Mcm1与Matα1蛋白相互作用，激活α细胞类型特异性基因的表达。为了了解辅因子α1对Mcm1–α1依赖性转录激活的需求，我们分析了Mcm1对α特异基因启动子的招募体内发现Mcm1能够在缺乏α1的情况下与α特异基因的启动子结合。这表明α1的功能比单纯招募Mcm1更复杂。包括Mcm1在内的多个MADS-box转录因子诱导DNA弯曲，有证据表明转录激活可能需要适当的弯曲。我们分析了在α1存在和不存在的情况下，Mcm1–α1结合位点的Mcm1依赖性弯曲，发现与其他Mcm1结合位点相比，仅Mcm1在该位点表现出减少的DNA弯曲。然而，α1的加入显著增加了DNA-bend，我们提供证据表明，该bend是完全转录激活所必需的。这些结果支持这样一个模型，即转录激活需要Mcm1–α1复合物适当弯曲DNA。
简介
DNA结合蛋白的MADS-box家族参与了多种真核生物的转录调控，包括酵母、植物和哺乳动物(1). Mcm1是酵母中的一种MADS-box转录因子，是一种参与调节多种基因的基本蛋白；包括细胞配对类型、细胞周期、渗透调节和精氨酸代谢(2–5). 为了发挥这些调节作用，Mcm1与几种不同的辅因子相互作用，这些辅因子有助于确定其功能。例如，在细胞类型测定中，Mcm1结合一-激活其转录的特定基因一-细胞类型(6). 然而，在α细胞型中，Mcm1在这些启动子元件上与α2蛋白相互作用以抑制这组相同的基因(7,8). Mcm1还与α1蛋白相互作用，结合P'Q启动子元件，激活α特异性基因的表达(9,10). 因此，辅因子相互作用显著改变了Mcm1 MADS盒蛋白的功能和特异性。
α-特异性基因上游的P'Q元件与来自启动子的一致性P元件的比较一-特定的基因显示它们是相似的（图。). 然而，P'Q与Q（α1的结合位点）直接侧翼的一致P元素显著不同(9). 由于Mcm1不能从P'Q位点自身激活转录，α1蛋白必须通过增加其与该位点的结合能力或招募转录机制来帮助Mcm1【综述(2)].
共识P元素与STE3型P'Q公司。这个STE3型除简并侧碱基5–8（粗体）外，P'Q与共有P-元素表现出很强的守恒性，其两侧为Q位点，即α1的结合位点。根据Mcm1的晶体结构，预测了Mcm1与位点外部区域的DNA接触(13). 碱性触点用实线表示，磷酸盐触点用虚线表示。星号表示Mcm1结合位点的对称轴。位置-7和7对共有P-元件的DNA弯曲很重要(16).
几种MADS-box蛋白的晶体结构表明，许多蛋白在结合位点时会在DNA中产生显著的弯曲(11–13). 生化和遗传分析表明，这种弯曲在转录激活中起着重要作用(14–18). 例如千立方厘米1-V34A突变将P元件的表观弯曲角从95°降低到82°，导致转录激活减少了10倍以上，但对DNA结合亲和力的影响很小(17,19). 其他结合亲和力缺陷较大的突变体对激活的影响小于V34A突变体，这表明弯曲可能在激活中起作用。有趣的是，当千立方厘米1-对V34A突变株与α1复合物中激活P'Q元件的能力进行了分析，与许多其他突变株相比，该突变株的转录激活缺陷较轻，表明Mcm1–α1的激活不需要DNA弯曲，或者α1有助于介导弯曲(19).
为了更全面地了解DNA弯曲和辅因子相互作用与转录激活的关系，我们分析了P'Q元素与野生型和突变Mcm1蛋白的弯曲以及与α1的复合物。我们的结果表明，α1辅因子有助于复合物介导的DNA弯曲，弯曲角度的改变导致转录激活的显著降低。这些结果支持了α1–Mcm1复合物对完全转录激活的适当DNA弯曲要求的模型。
材料和方法
酵母和细菌菌株和质粒
在酵母菌株JMY041（MAT）中进行染色质免疫沉淀一ade2-1 trp1-1 his3-11,15可以1-100 ura3-1 leu2-3 mcm1Δ：：kan第页/pSL1574-MCM1 CEN URA3）或EC7（MATαade2-1 trp1-1 his3-11,15可以1-100 URA3-1 leu2-3112 MATα1Δ：：trp1 MCM1Δ:：kan第页/pSL1574-MCM1 CEN URA3）分别源自W303-1A和W303-1B。用含有未标记Mcm1（pJM231，Mcm1 CEN HIS3）的野生型或突变衍生物或V5标记衍生物（pJM421，MCM10-V5 CEN HIP3）的质粒转化菌株，这两种质粒都补充了Mcm1Δ菌株的活力(17). 丢失带有MCM1野生型拷贝的质粒pSL1574的细胞通过在5-FOA存在下生长来选择。此外，将这些菌株转化为pRS415，作为空载体对照，或转化为pEC43的衍生物（MATα1-Myc CEN LEU2），该衍生物从其天然启动子表达MATα1，在C末端带有13-Myc标记。如前所述，通过递归PCR，在pEC43中的MATα1的ORF的以下位置构建沉默限制性位点：PstI（bp 61）、NheI（bp 95）、StuI（bp111）、EagI（bp134）、XbaI（bp175）、NruI（bp 210）、SpeI（bp250）、EcoR1（bp 280）、SphI（bp 369）、XmaI（bp 435）、BamHI（bp 530）(20). 工程化的MATα1构建物补充MATα1Δ菌株进行交配，并在与未修饰基因相同的水平上激活异源STE3-lacZ启动子的转录。
转录检测
通过监测酵母菌株EC7中Mcm1–α1依赖的转录激活lacZ公司来自pTBA23（2µURA3公司)包含CYC1（日历年1）-lacZ公司记者推广人CYC1（日历年1）UAS已删除(16). 转录报告结构包含一个P'Q野生型位点STE3型（pEC25）或具有T的P'Q站点–7到G突变（P'Q-T–7G） （pEC111）(9). β-半乳糖苷酶测定用独立分离株进行，一式三份，计算的β-半乳糖苷酶值的标准偏差<10%(17).
染色质免疫沉淀分析
根据上述程序进行Mcm1结合的染色质免疫沉淀分析(21). 培养物（50 ml）培养至OD6000.8，用1%甲醛交联30分钟。细胞在冰镇TBS中清洗两次，并在-80°C下冷冻。然后将细胞悬浮在500µl FA裂解缓冲液[（50 mM HEPES–KOH pH 7.5，140 mM NaCl，1 mM EDTA，1%Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，1 mM-苯甲基磺酰氟（PMSF），1×完整蛋白酶抑制剂（Boehringer-Mannheim）]和0.5 g酸洗玻璃珠中，并在4°C下旋转40 min。在4°C、14000 r.p.m.的条件下离心1分钟，以清除裂解产物。将上清液超声6×5 s，以将染色质剪切至～500 bp片段，然后在4°C下于14000 r.p.m.离心5 min。去除总计50µl的上清液以进行总染色质（TC）对照。剩余的上清液用蛋白G–琼脂糖珠预先清除，然后用1µl抗V5抗体（Invitrogen）孵育过夜。将蛋白G–琼脂糖珠（50µl）孵育1 h，并在低盐洗涤（0.1%SDS，1%Triton X-100，150 mM NaCl 2×TE）中洗涤1×；1×高盐洗（0.1%SDS，1%Triton X-100，500 mM NaCl 2×TE）；1×氯化锂清洗液（0.25 M氯化锂，1%IGEPAL，1×TE，1%去氧胆酸钠）；1×TE中为2×。用250µl洗脱缓冲液（1%十二烷基硫酸钠，0.1 M NaHCO）洗涤2倍，从珠子中洗脱蛋白质-DNA复合物三). 通过添加20µl 5 M NaCl逆转交联，并在65°C下培养4 h。通过添加10µl 0.5 M EDTA、20µl Tris pH 7.4、2µl蛋白酶K（10µg/µl）并在42°C下孵育45 min来进行蛋白酶消化。然后对样品进行苯酚-氯仿萃取，并用乙醇沉淀DNA。
如前所述进行定量PCR(22)使用1/50免疫沉淀DNA片段和1/1000 TC材料，总反应体积为50µl。PCR扩增STE6标准或STE2型启动子区作为阳性对照。引物用于扩增行动1或YDL223C型作为阴性对照。
蛋白质纯化
野生型和突变型Mcm1蛋白用于体外除蛋白表达于大肠杆菌凝血酶裂解后未去除BL21（密码子+）和麦芽糖结合蛋白（MBP）(17). 分离的Mcm1蛋白的均一性>95%。α1蛋白从表达pSL2187的BL21（密码子+）细菌细胞中纯化为MBP–α1融合物(23)在含有氨苄西林和氯霉素的LB培养基中培养至OD6000.6，然后用0.3 mM异丙基-β进行诱导-天-14°C下硫代吡喃半乳糖苷20 h。如前所述，细胞被裂解，蛋白质被纯化到>95%的均一性，不包括MBP的裂解(23). 蛋白质浓度通过Bradford分析进行标准化，并在考马斯染色SDS-PAGE凝胶上进行验证。
电泳迁移率变化分析
含有STE3型P'Q野生型或P'Q-T–7G最终标记为[γ-32P] 根据制造商的说法，ATP使用多核苷酸激酶，并通过Qiagen核苷酸去除柱（Qiagene）纯化。将寡核苷酸与3倍多余的匹配链混合，在90°C下孵育20分钟，然后在水浴中缓慢冷却至25°C过夜，制成双链寡核苷酸。如前所述，用BamHI、NheI、HindIII或EcoRI产生的末端标记片段进行循环排列测定(16)包含P-PAL位点，STE3型-P'Q或P'Q-T–7G站点。与纯化Mcm1的所有结合反应1–97或MBP–α1在10 mM Tris–HCl（pH 7.5）、40 mM NaCl、4 mM MgCl中进行2、6%（w/v）甘油、10 mg/ml BSA、10µg/ml超声鲑鱼精子DNA和32P标记DNA探针（4500 c.P.m），总体积为30µl，室温下放置60分钟。所有蛋白质稀释液均在20 mM Tris–HCl（pH 8）、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mg/ml BSA、5 mMβ-巯基乙醇和1 mM PMSF中制备。在6%聚丙烯酰胺凝胶上分析样品[在0.5×TBE缓冲液中运行60分钟用于电泳迁移率偏移分析（EMSA），180分钟用于200V下的圆形排列]。凝胶在电泳后干燥，暴露在荧光屏上，并在Storm 840型分子动力学荧光成像仪上扫描。使用IPlab凝胶成像软件定量凝胶。
结果
Mcm1结合体内在没有α1的情况下
体内DNA足迹分析得出结论，在缺乏α1的情况下，Mcm1无法结合P'Q元素，这表明α1可能主要起到将Mcm1招募到P'Q元件的作用体内(24). 然而，Mcm1的结合亲和力仅略有降低（3倍）体外与P元素相比，P'Q位点表明Mcm1可能是独立的体内(25). 要描述体内Mcm1单独与P'Q元素结合，并与α1染色质免疫沉淀复合（图。). 正如预期的那样，在α1存在的情况下，Mcm1与α特异基因的启动子紧密结合（图。，车道7）。有趣的是，即使在缺乏α1的情况下，Mcm1与这些位点的结合水平也很高（图。，车道3）。由于Mcm1与α特异基因的启动子结合体内但未能激活转录，这表明α1在转录激活中的作用比单纯招募Mcm1到这些启动子中更大。
Mcm1在缺乏α1的情况下结合P'Q元素体内使用含有未标记Mcm1（1、2、5和6道）或V5-epitope标记Mcm2（3、4、7和8道）的裂解液，使用抗V5抗体进行染色质免疫沉淀。A类材料一用空载体（pRS415，1-4通道）或野生型α1（pEC43，5-8通道）转化菌株。面板显示了所示启动子区域PCR扩增的溴化乙锭染色凝胶。使用α特异基因引物的PCR产物STE3型,SAG1公司和MF公司α1显示。的启动子片段一-特定的STE6标准Mcm1结合的基因作为阳性对照。YDL223C型，一个不受Mcm1调控的基因，用作阴性对照。通道1、4、5和8显示使用TC作为模板的PCR产物，而通道2、3、6和7使用免疫沉淀产物（IP）。
α1蛋白增加了与P'Q元素结合的Mcm1的弯曲度
有证据表明DNA弯曲可能在MADS-box蛋白的转录调控中起作用(16–18). 为了确定α1是否影响Mcm1中P'Q元素的DNA弯曲程度，我们使用包含P'Q位点的循环排列片段进行EMSA。如前所述，Mcm1在P-PAL元件处诱导了大约99°的明显弯曲角（图。，1-4车道）(16). 然而STE3型P'Q位置仅以76°的视角度弯曲（图。，9–12车道）。弯曲角的减小可能是由于P'Q位置退化侧基底+5至+8处的次优接触所致。P'Q元件的DNA弯曲度进一步降低千立方厘米1-V34A，在DNA弯曲所需的残基处含有突变[图。，13–16车道；(17)]。在α1和Mcm1都存在的情况下，存在迁移率明显较慢的移动带（图。，17–20车道）。α1的存在显著增加了P'Q位置的弯曲度，使其表观角度达到94°。有趣的是，在α1存在的情况下千立方厘米1-V34A突变体的DNA弯曲程度与野生型蛋白相似（图。，将车道17-20与21-24进行比较）。这些结果表明，α1的存在增加了P'Q位点的DNA弯曲，并能够抑制V34A突变引起的弯曲缺陷。
α1–Mcm1复合物比单独的Mcm1诱导DNA发生更大的弯曲。利用P-PAL（通道1-8）或STE3型-P'Q现场（车道9–24）如图所示。通道1-4、9-12和17-20显示与野生型Mcm1蛋白结合。5–8、13–16和21–24车道显示千立方厘米1-V34A突变体。车道1-16表示仅由Mcm1约束，而车道17-24表示存在α1约束。显示了每个绑定复合体的计算弯曲角度。
除V34A外，Mcm1中的其他几个突变也会导致P元件的弯曲缺陷(17,18). 就他们自己而言千立方厘米1突变体显示P'Q位点的弯曲度降低（图。B–F，1–4车道）。弯曲度的相对减少与这些与P元素结合的突变体的相对减少相当(17,18). 例如，T66A突变只导致表观弯曲角度略有下降（图。E、 通道1–4），而V34A、S37A双突变体导致显著减少（图。F、 车道1-4）。尽管这些突变体自身的弯曲度显著降低，但与野生型蛋白相比，在α1复合物中，没有任何突变体显著改变了表观弯曲角（图。A–F，9–12车道）。
Mcm1–α1复合物增加了P'Q-T处的弯曲–7G站点。利用结合位点位置置换的EMSA，每个面板代表野生型Mcm1(A类)或千立方厘米1-突变体V34A(B类)，S37A(C类)，K40A(D类)，T66A(E类)和V34A/S37A(F类). 每个面板的1-4通道和9-12通道显示绑定到STE3型-P'Q现场。每个面板中的车道5-8和13-16显示与STE3型-带T的P'Q站点–7G替代。1-8号车道没有α1，9-16号车道有α1。将显示每个复杂体的计算弯曲角度。
为了进一步测试α1是否影响复合物的弯曲，我们检测了与包含碱基对替换的突变P'Q位点T的结合–7G.在P位点的情况下，这种替换显著影响Mcm1依赖的DNA弯曲(17,18). T型钢–7G替代还导致P'Q位置的弯曲度减少了Mcm1（图。A、 车道5-8与1-4）。表观弯曲角的差异与具有类似突变的P元素的减少相当(16). Mcm1中的S37A、K40A和T66A突变导致P'Q-T的表观弯曲角进一步降低–7G站点（图。C、 D和F，1-4车道与5-8车道）。然而，V34A和V34A、S37A双突变体在P'Q-T作用下弯曲度没有进一步降低–7G站点（图。B和F，泳道1-8）。这可能表明V34和T之间存在直接接触–7位置，如前面在P元素处看到的Mcm1(13,17). 有趣的是，在与α1的复合物中，P'Q-T的弯曲角–7由WT、S37A、K40A或T66A突变体介导的G位点没有减少，但比野生型蛋白对野生型位点的弯曲程度显著增加（图。A、 相比之下，V34A和V34A、S37A双突变体的弯曲度没有进一步增加，但DNA的弯曲角度与野生型蛋白与野生型位点结合引起的弯曲角度类似（图。B和F，将9–12车道与13–16车道进行比较）。这些数据表明，在α1络合物中千立方厘米1-V34A突变抑制了由于P'Q-T而增加的弯曲缺陷–7G元件。
α1与Mcm1–DNA复合体的相互作用不会因DNA弯曲的变化而改变
接下来，我们比较了Mcm1突变体在野生型P'Q和P'Q-T中单独和与α1复合物的相对结合亲和力–7G来确定这些氨基酸替换是否影响复合物的形成。的相对结合亲和力千立方厘米1P'Q位点的突变体都与P元素的亲和力相当(17). 除K40A外，Mcm1突变体与P'Q结合，与野生型蛋白相比减少了2.5倍（数据未显示）。此外，P'Q-T–7G突变并没有显著改变野生型或突变型Mcm1蛋白的结合亲和力（数据未显示）。
为了确定α1与Mcm1–DNA复合体的相互作用是否受到DNA弯曲程度的影响，我们通过EMSA分析了这种相互作用。二元Mcm1–DNA复合物的形成被归一化，以解释千立方厘米1P'Q和P'Q-T的DNA结合–7G.α1与Mcm1–DNA复合体相互作用的能力不受影响，即使严重千立方厘米1DNA弯曲突变体（图。). 此外，P'Q-T–7G突变并未导致α1结合亲和力下降。K40A突变体表现出与α1相互作用相反的效果，部分抑制了结合缺陷。P'Q-T下降–7G与V34A和V34A-S37A双突变体在α1相互作用中表现出大约2倍的减少。然而，总的来说，二元Mcm1–DNA复合物的弯曲程度与α1与复合物相互作用的能力之间没有相关性。
影响Mcm1依赖性弯曲的突变不会改变与α1的相互作用。野生型和突变型Mcm1蛋白自身的DNA结合亲和力进行了标准化。将α1的连续稀释液（3倍）添加到每个Mcm1突变体中。相对于Mcm1野生型蛋白，α1与Mcm1–DNA复合物相互作用的倍数降低。
之前显示的两个突变体在与α1的相互作用中有缺陷，千立方厘米1-T66E和千立方厘米1-对S73R进行弯曲分析，以确定相互作用中的缺陷是否会导致弯曲缺陷(26). 如前所述，两个突变体在与α1的相互作用中均显示出明显缺陷（图。A）(26,27). 在缺乏α1的情况下，与野生型Mcm1相比，T66E突变体的相对弯曲度显著降低，而S73R突变体显示出与野生型相当的水平（图。B） ●●●●。然而，在含有α1的复合物中，两个突变体都显示出与野生型蛋白相当的明显弯曲角度。这些数据表明，α1和Mcm1之间相互作用中的缺陷不一定会导致弯曲缺陷。
与α1相互作用的缺陷不会导致Mcm1–α1复合物中的弯曲缺陷。(A类)带有WT-Mcm1、T66E或S73R的EMSA绑定到P'Q站点（分别为车道2、6或10）或与α1复合（分别为通道3-5、7-9或11-13）。Mcm1蛋白浓度在每条车道上保持不变，连续稀释3倍α1。(B类)在没有α1（1–12车道）或存在α1（13–24车道）的情况下，使用Mcm1-WT（1–4、13–16车道）、T66E（5–8、17–20车道）和S73R（9–12、21–24车道。将显示每个复杂体的计算弯曲角度。
α1–Mcm1 DNA弯曲必须处于适当的水平，才能进行完全转录激活
确定表观弯曲角度的变化是否由T引起–7G突变改变转录激活我们构建了异源报告启动子驱动lacZ公司包含单个P'Q或P'Q-T的转录–7G站点。在野生型菌株中，T–7与野生型现场相比，G报告者减少了4倍以上（图。). 由于α1–Mcm1复合物对P'Q-T的DNA结合亲和力–7G与野生型位点具有可比性，这表明弯曲角度的增加会影响激活。我们还分析了千立方厘米1-从P'Q和P'Q-T驱动表达的突变体–7G站点。S37A突变体在P'Q和P'Q-T的水平与野生型蛋白相当–7G站点（图。). 由于野生型和S37A蛋白都显示P'Q-T的弯曲增加–7G、 表观弯曲角的变化可能导致突变位点的活性降低。尽管V34A突变体显示野生型P'Q的活化略有减少，但该突变体能够部分抑制P'Q-T的活化减少–7G位置，与抑制弯曲缺陷的能力相关（图。). T66E和S73R突变体在两个位点的转录激活均显著降低，这可能是由于与α1相互作用的缺陷所致（图。) (18,26).
体内检测DNA弯曲对转录激活的影响。包含P'Q（实心棒）或P'Q-T的报告发起人–7G（开杆）用于驱动紫胶Z在WT或突变Mcm1背景中的表达。通过三次独立分析的平均值测定MATα细胞中报告者的激活，三次分析的差异小于10%。显示了与WT-P'Q位点的WT-Mcm1蛋白相关的激活百分比。
讨论
α1和Mcm1蛋白结合在一起形成一个复合物，通过与称为P'Q的启动子元件结合来激活α特异性基因(2). 为了了解这两种蛋白质对转录激活的需求，我们描述了体内Mcm1与P'Q启动子元件的结合在带有和不带α1的α特异性基因上游。有趣的是，Mcm1与α特异基因启动子结合并不需要α1体内然而，尽管Mcm1自身与P'Q位点结合，但在缺乏α1的情况下，它无法激活转录(2). 这一发现表明α1的功能比Mcm1向P'Q启动子元件的招募更复杂。在本研究中，我们提供了α1转录激活需求的分子见解。
研究表明，当Mcm1与P元素结合时，它会引起DNA的大弯曲，有证据支持这种弯曲可能对转录激活很重要的模型(13,16,17). 然而，由于站点一侧的简并性，Mcm1不会将P'Q站点弯曲到与P-PAL站点相同的程度。这种弯曲度的减少可能解释了为什么Mcm1不能单独激活P'Q启动子的转录。与单独的Mcm1相比，Mcm1–α1复合物显著增加了P'Q元素的弯曲，表明α1的一个功能可能是增加DNA弯曲，以促进转录激活。我们的发现进一步支持了这一模型，即α1的存在抑制了V34A突变体在P'Q位点的弯曲缺陷。这一结果可以解释为什么我们之前观察到V34A突变体在与α1的复合物中的转录激活方面的缺陷比其自身的P-PAL元件的激活不那么严重(19).
α1蛋白可能通过与Mcm1的相互作用增加DNA-bend，其方法是替代P'元件简并侧碱基5–8处缺乏最佳Mcm1–DNA接触的情况，P'元件的简并侧由α1的结合位点直接连接。然而，P'Q位点的DNA弯曲分析表明，Mcm1单独或与α1复合使用不同的机制来弯曲DNA。Mcm1对P'Q元素的DNA弯曲机制与P-PAL位点的弯曲相似。例如千立方厘米1在P-PAL处弯曲缺陷的突变体，例如V34A、S37A、K40A和T66A，当其自身绑定到P'Q元素时，显示出类似的缺陷(17). 此外，T–7P'Q元素背景下的G突变表明Mcm1自身降低了DNA弯曲，与P-PAL类似(16). 这些数据表明，许多Mcm1–DNA接触和Mcm1介导的DNA在P'Q元件处弯曲的机制类似于P-PAL元件。相比之下千立方厘米1弯曲突变体和T–7当Mcm1与α1结合时，G突变会显著改变效应。突变体与α1复合物中的DNA弯曲没有显著降低。事实上，T–7G突变导致Mcm1–α1复合物介导的表观DNA弯曲角增加。与DNA结合的Mcm1–α2蛋白的晶体结构显示出一种复杂的DNA弯曲，而不是位于单个平面上(13). Mcm1–α1蛋白也可能在多个平面上弯曲DNA。与单用Mcm1相比，Mcm1–α1的弯曲表型改变的一个模型是，α1蛋白在相对于Mcm1蛋白的不同平面上诱导DNA弯曲。提供的弯曲数据不能区分DNA弯曲中的多个平面。然而，这些数据表明，Mcm1–α1介导的DNA弯曲具有独特的结构，辅因子相互作用可以显著改变MADS-box蛋白诱导的DNA弯曲。
我们的数据表明，由Mcm1–α1介导的DNA弯曲程度对完全转录激活很重要。P'Q-T公司–7与野生型位点相比，G位点的转录激活水平下降了4倍以上，这可能部分是由于DNA弯曲缺陷所致。活化减少不太可能是由于结合缺陷造成的，因为Mcm1对这些位点的相对结合亲和力差异<1.5倍（数据未显示）。有趣的是千立方厘米1-V34A突变体，在P'Q-T显示出大致野生型水平的DNA弯曲–7G位（98°），也激活了P'Q-T–7G报告蛋白明显优于野生型或S37A蛋白，这两种蛋白都导致了突变位点的过度结合。这些数据表明，通过V34A在P'Q-T下恢复适当的DNA弯曲角度–7G位点导致转录缺陷的部分抑制，提示适当的弯曲角度可能与转录激活有关。
为了理解辅因子相互作用的要求，我们想确定Mcm1–DNA二元复合物的弯曲是否会改变α1结合的能力(18). 我们的数据表明，Mcm1–DNA复合物的弯曲程度与与α1相互作用的能力之间没有显著相关性。V34A、S37A、K40A和T66A突变体，以及V34A和S37A双突变体，当单独结合时，均显示Mcm1介导的DNA弯曲显著降低，但它们与α1相互作用的能力没有相关缺陷体外一个例外是T66E突变，它导致Mcm1介导的DNA弯曲减少以及与α1相互作用的缺陷(18). 与DNA结合的Mcm1的晶体结构表明，T66残基是蛋白质中β层的唯一DNA接触点，位于V34的正上方（图。) (13). T66E突变引入负电荷，可能会以完全弯曲的形式排斥DNA，导致弯曲缺陷(18). 然而，S73残基与T66位于同一β层，对与α1的相互作用很重要，具有近似野生型的DNA弯曲水平。突变S73R还导致与α1相互作用的缺陷，表明β链可能参与与辅因子α1的直接相互作用(26). 这些发现表明，Mcm1与α1辅因子相互作用不需要适当的DNA弯曲。
Mcm1残基T66有助于DNA弯曲和辅因子相互作用(18). Mcm1二聚体的模型基于Mcm1–α2 DNA三元复合物的坐标(13). 右侧面板中突出显示了DNA弯曲所需的残基侧链V34、S37、K40和T66。左图中突出显示了侧链对与α1、T66和S73相互作用的重要性。
蛋白质介导的DNA弯曲在一些情况下参与转录调控：包括Sox2、α雌激素受体和Reb1(28–30). 因此，建立正确的DNA结构对许多基因的正确转录调控至关重要。本研究中的数据揭示了MADS-box转录因子实现转录激活的新机制。我们的结果表明，α1与Mcm1的相互作用促进了蛋白质介导的DNA弯曲，并且弯曲与转录激活的增加直接相关。结果还表明，Mcm1可以通过不同的机制建立DNA弯曲，一种是当Mcm1蛋白单独与DNA结合时，另一种是与辅因子α1复合时。Mcm1自身或与α1复合物中的适当DNA弯曲可能是转录共激活剂与Mcm1结合或作为基础转录机制的支架所必需的。
致谢
我们感谢George Sprague提供本研究中使用的质粒和抗血清。这项工作由国家卫生研究院拨款资助（GM49265）。
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