丙型肝炎病毒急性感染过程中自然杀伤细胞的激活

摘要

简介

丙型肝炎病毒（HCV）可在绝大多数接触者中建立慢性持续感染，宿主免疫反应被认为在决定感染命运中起着重要作用。感染的慢性演变与适应性免疫受损有关^1-三，这可能受到先天性反应的影响，因为先天性免疫系统除了其直接抗病毒活性外，还可以通过多种不同机制引导下游适应性反应^2,4其中，自然杀伤细胞（NK）的功能至关重要，因为NK细胞在人类肝脏中富集，具有细胞毒性潜力，分泌包括TNF-α和IFN-γ在内的细胞因子，并可与树突状细胞（DC）相互作用^5-7因此，通过与树突状细胞的相互作用，它们既是抗病毒效应器，也是适应性反应的重要调节器⁸.

NK细胞由激活受体和抑制受体的组合控制⁹来自这些受体的信号的整合可以确定NK细胞是否会被激活。这些受体包括抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR），以及激活的天然细胞毒性受体和NKG2D¹⁰KIR结合多态性MHC I类分子；特别是，KIR2DL2和KIR2DL3结合第1组HLA-C等位基因，而抑制性受体KIR2DL1结合第2组HLA-C等位基因¹¹与HCV感染相关的是，抑制性KIR及其MHC I类配体（KIR2DL3和HLA-C组1）的特定组合对慢性HCV感染具有保护作用^12,13此外，HLA-C可以影响NK细胞的成熟，因为在发育过程中，NK细胞需要与同源MHC I类配体相互作用，才能充分发挥功能¹⁴因此，同源HLA-C配体的存在或缺失可以影响表达KIR的NK细胞的细胞因子反应，从而影响抗病毒免疫反应。

横断面研究表明，NK细胞在慢性HCV感染中受到干扰。循环中的NK细胞数量可能减少，NK细胞亚群分布向产生细胞因子CD56的数量增加倾斜^明亮的人群，相对于细胞毒性CD56^昏暗的亚人口^15,16这可能是由于IL-15产生缺陷所致¹⁷，但也可能与干扰素-α的慢性刺激相一致¹⁸此外，自然细胞毒性受体和NKG2D表达可能异常，慢性丙型肝炎患者NK细胞产生的细胞因子倾向于产生Th2型细胞因子IL-10，IFN-γ生成受损^18-21HCV E2蛋白与CD81结合可直接损害慢性HCV感染中NK细胞的功能，CD81对NK细胞具有抑制作用^22,23在使用干扰素-α治疗期间，NK细胞上的CD81表达降低，也可能会恢复被抑制的NK细胞活性^24,25.

慢性HCV感染中NK/DC串话异常，这可能是由于NKG2A表达亚群异常所致^26,27此外，干扰素-α激活NK细胞，浆细胞样树突状细胞在慢性HCV感染中产生这种细胞因子是异常的²⁸.CD56^明亮的与自发清除感染者相比，慢性感染者的NK细胞增加²⁹这些个体NKG2A/C表达和CD56的频率也较高^明亮的NK细胞产生更多IFN-γ。此外，在慢性感染中，NKG2A⁺NK细胞与疾病活动相关³⁰.

鉴于缺乏关于急性HCV感染中NK细胞反应的信息，本研究旨在分析HCV感染急性期NK细胞的频率和功能特征，以确定NK细胞是否被急性激活，以及NK细胞受体的表达是否会影响HCV感染的急性结局。

材料和方法

结果

急性HCV感染患者的NK细胞比例异常

分析了22名患有急性HCV感染和不同疾病结局的白人患者PBMC中NK细胞的频率(表1)17例血清阴性健康对照组。患者在临床表现时被登记并进行测试，这与检测到的ALT水平升高相一致，或者在1-2周后ALT已经下降时进行测试(表1). 流式细胞术鉴定NK细胞为CD56⁺CD3（CD3）⁻并进一步分为CD56^明亮的和CD56^昏暗的亚群体(图1A). 与健康对照组相比，急性肝炎患者的NK细胞百分比较低，但仅在对照组和自限感染组之间差异具有统计学意义（9.2%±6.1%vs 14.5%±5.8%，p=0.05）(图1B). 急性HCV感染不同结局患者的NK细胞百分比无显著差异。在NK细胞池中，CD56的比例^明亮的自限性（13.1%±6.5%）和慢性病（16.1%±12.0%）患者的NK细胞均高于对照组（6.7%±4.1%；p=0.006和p=0.005）。CD56型^昏暗的与对照组相比，两组急性HCV感染患者的NK细胞均减少(图1B). 因此，在急性HCV感染中，CD56的相对比例^明亮的和CD56^昏暗的无论结果如何，NK细胞都会发生改变。感染恢复期的系列样本分析显示CD56下降^明亮的自限感染患者的NK细胞在急性期1至3个月后已明显存在（从13.1±6.5到6.0±3.2；Student t检验为p=0.03，重复测量方差分析为p=0.0062）。这种早期下降在CD56短暂下降的慢性进化患者中无法检测到^明亮的NK细胞在3-6个月的时间点，但后来没有维持(图1C). 在CD56中观察到相反方向的变化^昏暗的急性期后1-3个月，自限感染中逐渐增加的NK细胞达到与健康对照组相当的数值。这种行为在慢性进化患者中没有出现，因为CD56的频率^昏暗的在1-3个月和>6个月的时间点，NK细胞仍显著低于健康对照组(图1C).

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图1

急性HCV感染时NK细胞亚群的变化

面板A：CD56的代表性流式细胞术斑点图^明亮的CD3（CD3）⁻和CD56^昏暗的CD3（CD3）⁻急性HCV感染人群。B组：NK细胞占淋巴细胞总数的百分比和CD56的频率^明亮的和CD56^昏暗的在14名慢性演变患者（CH，圆圈）、8名自我限制患者（SL，正方形）和17名健康对照者（CTR，三角形）中，NK细胞占NK总人口的百分比。面板C：感染后续阶段NK细胞的变化。上部面板显示NK细胞占活淋巴细胞门的百分比，中部和下部面板显示CD56的相对比例^明亮的（中间）和CD56^昏暗的（下部）NK细胞。

表1

研究对象的临床特征

患者结果	性别	年龄	ALT（淋巴细胞采集时）	HCV-RNA拷贝数/mL	基因型	HLA-C组
慢性病1	F类	64	417	3, 100	2	1,2
慢性2	M（M）	29	875	12,897,741	2	2,2
慢性3	M（M）	29	245	16,242	三	2,2
慢性4	M（M）	44	852	451,916	1安培	1,2
慢性5	M（M）	18	1114	6,775,737	三	1,1
慢性6	M（M）	67	490	10,170	2	1,1
慢性7	F类	33	34	<3200	1	ND（无损检测）
慢性8	M（M）	57	1027	1,344,724	2	1,2
慢性9	M（M）	25	146	528,241	1A/1B型	1,2
慢性10	M（M）	22	358	ND（无损检测）	三	2,2
慢性11	M（M）	22	459	3,807	三	1,1
慢性12	F类	41	225	1,361,225	1安培	ND（无损检测）
慢性13	MM（毫米）	39	210	3,1 998	1B年	ND（无损检测）
慢性14	F类	50	78	ND（无损检测）	2摄氏度	ND（无损检测）
自我限制1	F类	50	567	5,517	1	ND（无损检测）
自我限制2	F类	52	67	1,030,000	1	1,2
自我限制3	M（M）	20	1299	<3200	不适用	1,2
自我限制4	M（M）	28	152	4,957	不适用	1,2
自我限制5	M（M）	18	54	12,991	4	1,2
自我限制6	M（M）	27	54	ND（无损检测）	1	2,2
自我限制7	M（M）	32	940	7,355	2	1,1
自我限制8	F类	25	1966	240,807	不适用	1,2

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急性HCV感染中NKG2D的表达发生改变，而KIR的表达没有改变

首先分析NK细胞表面活化受体NKG2D的表达(图2A). 在整个NK细胞和CD56上表达更高^明亮的和CD56^昏暗的与对照组相比，急性HCV感染患者的亚群与随后的演变无关(图2B和C).

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图2

NK细胞受体在三个患者群体中的表达

面板A-C：NKG2D在NK细胞中的表达（A）)，在CD56上^明亮的自然杀伤细胞（B）和CD56上^昏暗的自然杀伤细胞（C）). 对11名急性HCV感染和慢性演变患者（CH，圆圈）、6名自限感染患者（SL，正方形）和10名健康对照者（CTR，三角形）的急性期受体表达进行比较。面板D：急性HCV感染者中，在感染急性期表达特异性KIR分子的NK细胞百分比由GL183（抗KIR2DL2/3/S2）和EB6（抗KIR2DL1/S1）测定。左侧面板显示了第2组HLA-C同种异型个体中KIR2DL1/S1 NK细胞的频率；中间的面板显示了具有第1组HLA-C等位基因的个体中KIR2DL2/3/S2的频率，右侧面板显示了表达该个体HLA-C等位基因KIR同源物的NK细胞总数（第1组、第2组或第1组和第2组）。

然后分析抑制性KIR受体的表达水平。当前的抗体不能分别将抑制受体KIR2DL1或KIR2DL2和KIR2DL3与其激活的对应物KIR2DS1和KIR 2DS2区分开来；因此，测定了KIR2DL1和KIR2DS1以及KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS2的联合表达。这是在CD56上执行的^昏暗的仅NK细胞，如CD56^明亮的NK细胞不表达KIR。此外，由于NK细胞的培养依赖于抑制性KIR的同源HLA配体的存在，我们还确定了HCV感染者的HLA-C型(表1). 即使针对同源HLA-C配体的存在进行校正，自限感染和慢性进化个体之间的KIR表达也没有发现显著差异(图2D). 此外，经IL-12或IL-15刺激后，NK细胞表面这些受体的表达没有改变（数据未显示）。

急性丙型肝炎病毒感染时NK细胞产生IFN-γ增加

为了进一步研究NK细胞在急性HCV感染期间的行为，我们评估了总CD56和CD56的能力^明亮的IL-12刺激后NK细胞产生IFN-γ(图3A). 与对照组相比，急性HCV自限感染（8.1%±7.8）和慢性演变（9.98%±8.3）患者的NK细胞产生IFN-γ的比例更高（分别为3.28%±2.29；p=0.026和p=0.0033）(图3B). 慢性演变感染患者与对照组的差异更大，尽管慢性和自我限制演变中IFN-γ的产生在统计学上没有差异。与此趋势一致，CD56的比例^明亮的与对照组（15.4%±8.0%；p=0.033）相比，慢性进展性感染（27.0%±19.6%）的NK细胞产生IFN-γ的水平显著升高，但自限性感染（14.9±12.7%）的NK-细胞生成IFN-γ水平无明显升高(图3B和C). 慢性病程患者CD56的IFN-γ分泌有下降趋势^明亮的NK细胞在感染的随访阶段，但通过重复测量方差分析，这没有达到统计学意义(图3C).

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图3

NK细胞增加IFN-γ的产生

PBMC在加入或不加入IL-12的情况下培养过夜。然后用单克隆抗体对细胞进行染色，以检测IFN-γ并鉴定NK细胞（CD56⁺CD3（CD3）⁻).面板A：含或不含IL-12过夜培养后IFN-γ产生细胞的代表性流式细胞仪斑点图。B组：干扰素-γ百分比⁺总NK（上部图）和IFN-γ⁺CD56型^明亮的IL-12中的NK细胞（低图）在感染急性期的不同患者群体中刺激PBMC（8个自限，14个慢性演变，17个对照）。面板C：慢性肝炎患者HCV感染随访期NK细胞总数和CD56上IFN-γ的产生^明亮的NK细胞。

由于KIR2DL3与HCV感染的自发消退有关，我们通过分析IFN-γ的产生来确定急性HCV感染中NK细胞亚群是否被优先激活(图4). 抑制性KIR、KIR2DL1、KIR2DL2、KIRIDL3和KIR3DL1对于确定NK细胞成熟和产生IFN-γ的能力很重要¹⁴因此，为了避免共表达KIR的混淆变量，我们选择仅表达KIR2DL1/S1或KIR2DL2/L3/S2的NK细胞(图4A). 与对照组相比，表达HLA-C组2特异性KIR2DL1/S1和HLA-C第1组特异性KIR2DL2/3/S2的NK细胞亚群在具有自我限制和慢性进化的急性感染患者中均显示IFN-γ分泌细胞的比例增加（IFN-γ泌泌KIR2DL1/S1 NK细胞：自我限制，12.2%±13.63；慢性，11.32%±12.11与对照组相比：分别为2.1±1.83，p=0.01和p<0.01；分泌IFN-γ的KIR2DL2/3/S2 NK细胞：自限，15.6%±19.3；慢性，与对照组相比为10.36%±9.45，分别为3±4.7，p=0.01和p<0.01）(图4B). 慢性肝炎患者与自限性肝炎患者的NK细胞产生IFN-γ的情况无显著差异。

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图4

激活KIR⁺急性丙型肝炎病毒感染过程中的NK细胞

面板A：代表性流式细胞仪点图，以说明用于获得特定KIR组NK细胞单一阳性（SP）的门控策略，在本例中为KIR2DL1/S1。在图CD3中⁻CD56型^昏暗的对NK细胞进行门控，并分析KIR2DL2/L3/S2和KIR3DL1阴性的NK细胞KIR2DL1/S1的表达。直方图显示这些KIR2DL1/S1阳性NK细胞产生IFN-γ。面板B：急性肝炎患者和健康对照组急性感染期KIR2DL1/S1或KIR2DL2/3/S2的IFN-γ产生NK细胞单一阳性的百分比。圆圈表示慢性演变感染的患者（n=12），方形表示自我限制感染的个体（n=7），三角形表示对照组（n=17）。

急性HCV感染中NK细胞的细胞毒性增强

通过在NK细胞表面出现溶酶体相关膜蛋白CD107a来研究NK细胞脱颗粒。与健康对照组相比，在急性HCV感染期间观察到NK细胞活性增加的趋势(图5A). 急性HCV患者与对照组相比，表达第1组HLA-C特异性KIR2DL2/3的NK细胞差异显著（44.2%±13.8%对29.9%±14.4%，p=0.01）(图5B). 在急性患者中，KIR2DL2/3 NK细胞的活化程度也高于KIR2DL1阳性NK细胞（44.2%±13.8%对35.0%±20.9%；p=0.005，Wilcoxon配对试验）(图5B). 自限性感染中KIR2DL2/3 NK细胞的脱颗粒似乎大于慢性演变感染中的脱颗粒。尽管这种差异并不显著，但只有自限感染（49.45%±12.25）而非慢性演变感染（40.69±14.06）的KIR2DL2/3 NK细胞比对照组（30.96+13.5；p=0.0053，图5B).

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图5

急性HCV感染时NK细胞脱颗粒和细胞毒性的上调

与K562靶细胞共培养后，在IL-15刺激的NK细胞中，通过CD107a的表面表达评估脱颗粒情况。面板A：脱颗粒CD56的百分比^昏暗的在急性期分析的NK细胞在12名急性HCV感染和慢性演变的患者、8名自我限制性感染的患者和11名健康对照之间进行了比较。各组之间未发现有统计学意义的差异。面板B：急性肝炎患者和健康对照组急性期表达CD107a的KIR2DL1/S1或KIR2DL2/3/S2单一阳性NK细胞百分比。圆圈表示慢性感染者，方形表示自限感染者，三角形表示对照组。Mann-Whitney U检验的比较显示，与健康对照组相比，KIR2DL2/L3/S2单一阳性的NK细胞在CD107上调方面存在显著差异。在整个患者群体中，KIR2DL1/S1单一阳性的NK细胞与KIR2DL2/L3/S2单一阳性者之间也存在统计学差异。面板C：具有同源HLA-C配体的HCV感染者急性期KIR2DL1/S1或KIR2DL2/3/S2 NK细胞上CD107a表达的比较（分别为第2组和第1组）。慢性演变患者用闭合的圆圈表示，而那些患有自限性肝炎的患者用开放的方块表示。不同类型的感染之间没有发现统计上的显著差异。面板D：感染急性期和后续阶段的细胞毒活性按NK细胞数标准化⁵¹K562细胞Cr释放试验。结果显示了急性感染（圆圈和实线）、自限感染（方形和虚线）和14名健康对照（三角形和虚线型）慢性演变个体在不同效应器与靶（E:T）比率下的结果。在急性期评估了14名慢性进化患者和8名自我限制感染患者；每组6例在1至3个月时出现，9例出现慢性进展，7例在3至6个月时自我限制。显示了平均值和标准偏差。面板E：对K562靶细胞的细胞毒性，在感染的急性期和早期随访期，NK细胞数量标准化，E:T比率为20:1。患者和对照组的数量与面板D中所示的相同，在随后的随访时间点分析了另外14名慢性病患者。

NK细胞的细胞溶解功能取决于是否存在抑制性KIR的同源配体，这一过程称为“许可”¹⁴和KIR2DL3及其同源的第1组HLA-C配体已被证明与自限性丙型肝炎感染相关^12,13因此，我们根据相应同源HLA-C配体的表达对患者进行分组，分析KIR阳性NK细胞的激活情况。尽管自限感染患者KIR阳性NK细胞中CD107a的表达有增加的趋势，但这在统计学上并不显著(图5C). 当控制同源HLA-C配体的存在时，我们还观察到自限性和慢性感染患者KIR阳性NK细胞上IFN-γ的表达没有显著差异（数据未显示）。

在不同的E:T比率下，通过铬释放试验测试总NK细胞的细胞毒性。虽然急性HCV感染患者的NK细胞通常表现出比对照组NK细胞更高的杀伤效率，但仅在对照组和自限感染急性期（p=0.05）之间，以及在慢性演变患者的对照组和1-3个月随访之间，才发现有统计学意义的差异（p=0.002）(图5D和E). 自限性感染急性期后细胞毒性下降速度快于慢性感染(图5D)因此，与随访期间自我限制感染的患者相比，慢性病程患者的杀灭效率更高，在早期时间点具有统计显著性差异（随访1-3个月；4.6±0.7 vs 2.5±1.3，p=0.0055，E:T比为20:1）(图5E). 通过重复测量方差分析，在随访的不同时间点，两组HCV感染患者之间没有发现显著差异。

为了测试急性HCV感染期间HCV-RNA水平是否会影响NK细胞功能，我们评估了病毒血症与杀伤效率（E:T比率为20:1）之间的可能相关性，或病毒血症与产生IFN-γ的NK细胞百分比之间的可能相关关系（数据未显示）。然而，没有观察到相关性，这表明病毒血症水平并不影响NK细胞维持的固有免疫反应的激活水平。

讨论

人们提出了不同的机制来解释HCV慢性持续感染率高的原因。其中，许多研究表明，下游先天性反应缺陷对适应性免疫的促进作用不足在体外研究表明，HCV基因产物在不同水平上干扰了先天免疫的抗病毒功能^1,2，包括E2蛋白对NK细胞活性的抑制^22,23,31NK应答的这种假定损伤不仅可能直接影响感染的初始控制，还可能通过阻止NK和树突状细胞之间的产生性串扰影响T细胞启动^26,27另一方面，在HCV感染中有利于病毒控制的机制在很大程度上仍不明确。在这种情况下，感染自限结果患者NK细胞上抑制性受体KIR 2DL3的优先表达可能发挥作用^12,13由于KIR 2DL3与其HLA-C配体的亲和力低于其他KIR，因此KIR 2DL介导的NK细胞抑制作用天生较弱；这可能使这些个体的NK细胞更容易被病毒感染激活，从而保护它们免受病毒持续感染^12,13这些机制对NK细胞功能的最终影响体内由于迄今为止尚未进行有关急性HCV感染的研究，目前尚不清楚。

为了表征急性HCV感染中NK细胞的行为及其对HCV发病机制的贡献，我们分析了CD56的频率、表型和功能特性⁺CD3（CD3）⁻NK细胞及其CD56^昏暗的和CD56^明亮的慢性丙型肝炎患者的纵向亚群。最明显的发现是，急性HCV感染的NK细胞比未感染的健康对照组的NK淋巴细胞功能更活跃。这主要表现在干扰素-γ的高效生产在体外在急性期（在自限性感染中显著）和随访的前3个月（在慢性进展性感染中明显），IL12的刺激和更强的细胞毒性。此外，急性患者的脱颗粒活性往往强于对照组，但只有KIR2DL2/3存在显著差异。在两组感染自限性和慢性演变的急性患者中均可检测到NK细胞功能增强，并且在感染早期（急性期和1至3个月的随访）更为明显。这与NK细胞总数的平行增加无关。然而，当我们分析CD56的表达时^昏暗的和CD56^明亮的子集，CD56^明亮的细胞明显增加，CD56^昏暗的与对照组相比，急性期患者明显减少。因此，在HCV感染的急性期，NK细胞亚群的相对代表性而非绝对NK细胞数发生改变。此外，与自限性感染相比，NK细胞在慢性进化过程中通常更为活跃，并保持活性的时间更长，功能衰退的动力学较慢，这在细胞溶解活性方面更为明显。在横断面研究中CD56的变化^昏暗的和CD56^明亮的以前曾报道过慢性丙型肝炎病毒感染的亚群，我们的数据与未清除感染的患者在感染急性期持续到慢性期所观察到的变化一致^16,21,29.

NK细胞活性受激活和抑制细胞表面受体之间复杂的相互作用调节，这些受体释放的正负信号之间的平衡改变可能导致NK细胞功能改变⁹为了解决这种可能性，我们观察了NKG2D受体的表达，该受体通过结合靶细胞上的应激诱导类I样分子（MICA/B）和ULBP来介导NK细胞激活，以及KIR2DL1和KIR2DL2/3受体的表达³²根据功能数据，活化的NKG2D受体在急性HCV患者CD56上的表达水平高于对照组^昏暗的和CD56^明亮的NK亚群。

相反，不同患者组中抑制性KIR受体的表达没有显著差异。然而，与急性感染期的KIR2DL1/S1阳性NK细胞相比，在KIR2DL2/L3/S2阳性细胞上观察到CD107a的优先表达。KIR2DL3和HLA-C组对慢性HCV感染具有保护作用^12,13这可能是由于KIR2DL1产生的抑制信号比KIR2DL3更强，随后表达KIR2DL1的NK细胞的激活速度较慢³³然而，在我们的研究中，我们仅检测到自限性KIR2DL3阳性NK细胞与慢性演变感染相比脱颗粒活性更高的趋势。鉴于急性HCV感染的无症状性，KIR2DL3与感染解决之间缺乏更强的相关性可能是因为可招募的功能研究患者数量有限。同样，由于难以在规定的时间点获取样本，我们在后续阶段检测细胞毒性试验中各组之间差异的能力有限。部分原因是IVDU人群的行为，这进一步阻碍了对急性HCV感染的准确研究。

总之，我们的研究表明，无论后续结果如何，在感染的急性期，NK细胞激活增加的模型在感染慢性演变的个体中持续时间延长。尽管丙型肝炎病毒有可能通过将NK细胞表面的四spannin CD81分子与其E2蛋白交联来抑制NK细胞功能^22,23在急性HCV感染期间，NK细胞似乎被有效诱导，因为急性患者的IFN-γ生成和细胞毒性比对照组更强。这与Yoon等人的观察结果一致，即细胞培养中产生的感染性HCV颗粒在体外不会损害NK细胞功能，即使使用浓度高于感染者体内的浓度³⁴.

因此，在急性感染中，HCV似乎没有下调NK细胞反应，如果HCV-E2蛋白体内NK细胞抑制活性。然而，在随后发展为慢性病的患者中，NK细胞活性缓慢但渐进性下降的证据并不排除HCV长期持续存在可能最终导致NK细胞抑制的可能性，因为抑制和激活NK细胞受体之间的平衡有利于抑制，正如之前的研究报告所述²⁹NK细胞很少在急性人类病毒感染中进行研究，因此我们无法确定我们的观察结果是否针对HCV。然而，急性丙型肝炎病毒感染期间NK细胞的激活表明，它们在丙型肝炎病毒免疫发病中发挥作用，需要进一步的研究来确定它们对感染结果的具体贡献。

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脚注

参考文献