EGFR在肝细胞癌形成过程中对肝巨噬细胞有促瘤作用

实质细胞中缺乏EGFR的小鼠肝癌的形成

考虑到HCC的复杂性和不同细胞类型的参与，我们在肝细胞和胆管细胞中缺乏EGFR的小鼠中诱导HCC(表皮生长因子受体^上下;阿尔芬克雷=表皮生长因子受体^Δhep)²⁵(补充图1a). 肿瘤和非肿瘤组织中的免疫组织化学和蛋白质印迹分析证实了实质细胞中EGFR的缺失(图1f，g). 在表皮生长因子受体^Δhep在非实质细胞中检测到EGFR(图1f)，其中阿尔芬克雷没有表达，这解释了Southern杂交中未重组的flox等位基因(补充图1b). 与表皮生长因子受体^ΔMx老鼠，表皮生长因子受体^Δhep小鼠发生的HCC明显大于同窝对照小鼠(图1h，i). 这一结果出乎意料，因为EGFR被认为促进肿瘤生长。增殖表皮生长因子受体^Δhep肿瘤增加，与在表皮生长因子受体^ΔMx肿瘤(图1j). 然而，与表皮生长因子受体^ΔMx,表皮生长因子受体^Δhep肿瘤细胞凋亡增加(图1j)表明EGFR保护肝细胞免受DEN诱导的凋亡。

为了更详细地研究这一点，我们监测了注射DEN后不同时间点的肝脏损伤。急性肝毒性标志物血清天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶水平在表皮生长因子受体^ΔMx和表皮生长因子受体^Δhep肝脏与对照组比较(补充图1e、f). 此外，注射DEN后，受损区域也显著增加(图1 k,补充图1d)在肝小叶III区检测到较高水平的裂解半胱天冬酶3，在该区域DEN主要代谢²⁸(图1l,补充图1g). 为了研究这种肝细胞损伤是否是细胞自主性的，我们用DEN刺激分离的肝细胞，并对坏死标记物高迁移率组蛋白B1（HMGB1）进行免疫荧光染色²⁹，显示出强烈的坏死反应，特别是在EGFR缺乏的肝细胞中(补充图1h). 在TNFα/放线菌酮治疗后，它们对细胞凋亡也更敏感(补充图一). 因此，凋亡和坏死是DEN诱导的肝损伤增加的原因表皮生长因子受体^ΔMx和表皮生长因子受体^Δhep这表明EGFR在肝细胞中具有重要的死亡保护功能。

在中毒性肝损伤期间，IL-1和IL-6等促炎细胞因子激活炎症修复过程¹¹对注射DEN后分离的肝细胞进行qRT-PCR分析，发现IL-1β表达在表皮生长因子受体^ΔMx和表皮生长因子受体^Δhep小鼠，而IL-1α表达较低且无变化(图1m). 相反，当在DEN治疗后测量总肝脏中IL-1α/β水平时，我们观察到IL-1α高于IL-1β的表达(图1n)，这证实了之前的结果¹¹总之，这些结果表明，IL-1α主要由非实质细胞释放，可能是枯否细胞/肝巨噬细胞，而不是由受损的肝细胞释放。IL-1β表达增加也见于表皮生长因子受体^ΔMx和表皮生长因子受体^Δhep肿瘤(图1o). 此外，当EGFR-deficient肝细胞被治疗时，观察到IL-1β释放增加在体外使用DEN或TNFα(补充图2a、b). 因此，通过EGFR信号进行的肝保护可防止肝癌中肝细胞的持续死亡和IL-1β的释放。

在两者中表皮生长因子受体^ΔMx和表皮生长因子受体^Δhep小鼠，EGFR保护细胞免受DEN诱导的损伤，但EGFR在促进HCC形成方面仍起相反的作用，这说明了其在肿瘤发生中的复杂作用。排除EGFR缺失的时间（妊娠晚期表皮生长因子受体^Δhep小鼠与7周龄小鼠的比较表皮生长因子受体^ΔMx小鼠）是导致两种模型HCC发展差异的原因，我们在出生后不久就删除了EGFR表皮生长因子受体^{飞行/飞行};Mx克里老鼠(表皮生长因子受体^ΔMx*) (补充图1a,2厘米). 类似表皮生长因子受体^ΔMx老鼠，也表皮生长因子受体^ΔMx*与窝友对照组相比，小鼠的肿瘤明显较少且较小(补充图2d，e)，表明EGFR缺失的细胞类型是HCC发展差异的原因表皮生长因子受体^ΔMx和表皮生长因子受体^Δhep老鼠。

Kupffer细胞/肝巨噬细胞中EGFR的表达促进肝癌的发展

我们假设表皮生长因子受体^Δhep和表皮生长因子受体^ΔMx小鼠是由非实质细胞中的EGFR功能引起的。因此，我们对非实质性细胞标记物进行了免疫组化，并观察到F4/80阳性细胞增加了4倍，可能是Kupffer细胞或浸润性巨噬细胞表皮生长因子受体^Δhep肿瘤(图2a、b). 血清CCL2显著上调，CCL2是一种已知的吸引F4/80阳性细胞的趋化因子表皮生长因子受体^Δhep，但不在表皮生长因子受体^ΔMx肿瘤(图2a、b). 为了测试表达EGFR-的肝巨噬细胞是否有助于增加肝癌的形成表皮生长因子受体^Δhep老鼠，我们雇佣了LysM-Cre公司转基因小鼠表皮生长因子受体^Δhep/Δmac（表皮生长因子受体^{飞行/飞行};阿尔芬克雷;LysM-Cre公司)肝细胞和枯否细胞/巨噬细胞中均缺乏EGFR的小鼠(图2c). 类似表皮生长因子受体^ΔMx,表皮生长因子受体^Δhep/Δmac与对照组和表皮生长因子受体^Δhep老鼠(图2d，e). 因此，肝癌的形成增加表皮生长因子受体^Δhep小鼠是由表达EGFR的库普弗细胞/浸润巨噬细胞数量增加引起的。最后，为了测试EGFR表达的巨噬细胞是否对HCC的形成负责，我们仅在巨噬细胞中诱导缺乏EGFR的小鼠肝癌(表皮生长因子受体^{飞行/飞行};LysM-Cre=表皮生长因子受体^Δmac). 类似表皮生长因子受体^ΔMx和表皮生长因子受体^Δhep/Δmac老鼠，表皮生长因子受体^Δmac与相应的对照组相比，小鼠显示出明显更小的肿瘤(图2d，e). 因此，我们的研究结果揭示了EGFR在HCC形成过程中对Kupffer细胞/肝巨噬细胞的肿瘤促进作用。

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图2

Kupffer细胞/肝巨噬细胞中EGFR的表达促进肝癌的发展

(a、 b条)F4/80的数量⁺小鼠肿瘤细胞（左，表皮生长因子受体^{飞行/飞行}：n=66（4只小鼠），表皮生长因子受体^Δhep：n=54（4只小鼠），表皮生长因子受体^{飞行/飞行}：n=37（3只小鼠），表皮生长因子受体^ΔMx：n=36 HPF（4只小鼠）和HCC小鼠CCL2血清水平（右，表皮生长因子受体^{飞行/飞行}：n=4，表皮生长因子受体^Δhep：n=7，表皮生长因子受体^{飞行/飞行}：n=4和表皮生长因子受体^ΔMx：n=6只小鼠）。(c（c）)代表性PCR显示对照组（f/Δ）和表皮生长因子受体^Δhep/Δmac老鼠。flox=未删除（1.1kb），Δ=删除EGFR（0.5kb）。(d日)肿瘤发生63周后，显示基因型（底部，比例尺：1mm）切片的代表性肝脏（顶部，比例栏：1cm）和H&E染色。虚线表示肿瘤结节。注：肿瘤表皮生长因子受体^{飞行/飞行}老鼠比大图2c，d因为27周后由于小鼠遗传背景的改变，对肿瘤进行了分析。(e（电子）)肝脏肿瘤肿块表皮生长因子受体^{飞行/飞行}（n=10），表皮生长因子受体^Δhep（n=5），表皮生长因子受体^Δhep/Δmac（n=5）和表皮生长因子受体^Δmac（n＝4）只小鼠。数据(a、 b条)表示平均值±标准误差数据(e（电子）)代表平均值±标准差t吨-独立样本和不相等方差的检验用于评估统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，**p<0001）。原始数据见补充表1和未截留的凝胶补充图6.

病理条件下激活的Kupffer细胞/肝巨噬细胞中诱导EGFR表达

免疫荧光染色显示EGFR在分离自表皮生长因子受体^{飞行/飞行}肝脏和IL-1β刺激在体外(图3a)Western Blot证实了这一发现(图3c). 正如预期的那样，在分离自表皮生长因子受体^Δmac和表皮生长因子受体^ΔMx老鼠(图3b，c). EGFR水平表皮生长因子受体^ΔhepKupffer细胞与对照细胞相似，而EGFR存在于分离自表皮生长因子受体^Δmac，但不是来自表皮生长因子受体^Δhep和表皮生长因子受体^ΔMx老鼠(图3c). 健康且未经治疗表皮生长因子受体^{飞行/飞行}肝脏中只含有极少数EGFR-阳性Kupffer细胞(图3d，f). 然而，DEN注射后5天，在F4/80阳性细胞中检测到显著的EGFR表达(图3e、f). 有趣的是，DEN治疗后肝细胞中EGFR水平也增加(图3g). 接下来我们研究了EGFR是否在肝癌的枯否细胞/肝巨噬细胞中诱导。连续切片的免疫组织化学表皮生长因子受体^上下和表皮生长因子受体^Δhep/Δmac肿瘤中EGFR和F4/80在肿瘤及癌旁组织中共同表达表皮生长因子受体^上下(图3h，j)，但不是的表皮生长因子受体^Δhep/Δmac老鼠(图3i，k). 这些发现表明，病理条件下激活的枯否细胞/肝巨噬细胞中诱导EGFR表达。

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图3

病理条件下激活的Kupffer细胞/肝巨噬细胞中诱导EGFR表达

(a-b公司)代表性免疫荧光共聚焦图像显示培养的Kupffer细胞/肝巨噬细胞中F4/80和EGFR的联合染色(一)表皮生长因子受体^{飞行/飞行}以及(b条)表皮生长因子受体^ΔmacF4/80染色证实，培养物中含有≥98%的枯否细胞/肝巨噬细胞。比例尺：50μm。(c（c）)典型的Western Blot显示EGFR在分离的肝细胞和Kupffer细胞中的表达表皮生长因子受体^{飞行/飞行},表皮生长因子受体^ΔMx,表皮生长因子受体^Δhep和表皮生长因子受体^Δmac老鼠。(d-e公司)显示F4/80和EGFR在肝切片中表达的典型免疫荧光共聚焦图像(d日)未经处理和(e（电子）)DEN治疗（5天）表皮生长因子受体^{飞行/飞行}老鼠。白色箭头表示EGFR-阳性Kupffer细胞。比例尺：50μm。(f-g（胎龄）)显示EGFR表达水平的平均荧光强度（平均FI）（Alexa 488，绿色）(（f）)肝巨噬细胞(表皮生长因子受体^{飞行/飞行}未治疗：EGFR阴性（n=9），EGFR阳性（n=10）；表皮生长因子受体^{飞行/飞行}DEN后5天：EGFR阴性（n=4），EGFR阳性（n=26）和(克)肝细胞(表皮生长因子受体^{飞行/飞行}未经处理（n=12），表皮生长因子受体^上下DEN后5天（n=13）。染色分析如所示(d日)和(e（电子）). 针对(（f）)和(克). (氢-钾)代表性抗EGFR(h、 我)和防F4/80(j、 k个)对照组连续切片染色(h、 j个)和表皮生长因子受体^Δhep/Δmac(i、 k个)肝癌中EGFR在肿瘤细胞中表达，EGFR和F4/80在枯否细胞/肝巨噬细胞中共同表达表皮生长因子受体^{飞行/飞行}肝细胞癌中无EGFR表达表皮生长因子受体^Δhep/Δmac肿瘤。比例尺：50μm。(a-b、d-e)Nuclei（DAPI，蓝色）、EGFR（Alexa 488，绿色）和F4/80（Alexa594，红色）、merge（右下角）。数据(f-g（胎龄）)代表平均值±标准差t吨-独立样本和不相等方差的检验用于评估统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，**p<0001）。原始数据见补充表1还有未剪下的污点补充图6.

人类HCC中存在EGFR-表达的Kupffer细胞/肝巨噬细胞与预后不良相关

接下来，我们研究了Kupffer细胞/肝巨噬细胞中EGFR的表达是否与人类HCC相关，并分析了129例手术切除的HCC样本中EGFR表达，主要是中国的乙型肝炎（HBV）阳性，在相应的邻近非癌组织中，以及15例“正常”肝脏中的EGFR表达(表1a,​，b）。b条). 由于慢性HBV在欧洲是HCC的一个不太常见的原因，我们额外研究了108名接受肝移植治疗HCC的欧洲HCC患者中EGFR的表达(表1a). 该队列主要由酒精性、非酒精性脂肪性肝炎和丙型肝炎（HCV）诱发的肝硬化(表1b). 两名独立的病理学家使用先前公布的量表对两组患者的EGFR染色进行了检查和盲法评分³⁰.

在中国队列研究中，约73%的正常肝脏在肝细胞中EGFR表达为阴性（0），并且在邻近非癌组织和正常肝脏的肿瘤细胞和肝细胞中，EGFR表达水平（+，++，++）没有差异(表1a,补充图3a). 与正常组织相比，肝癌组织中EGFR（++，++）的高表达更为普遍(表1a,补充图3a)确认了之前的报告²⁰在欧洲队列的肝细胞和肿瘤细胞中观察到类似的EGFR表达结果(表1a). 对于这两个队列，肿瘤细胞中EGFR的表达对患者术后的总体生存期（OS）或无病生存期（DSF）没有显著的预后价值(补充图3b-e,表1a)肝细胞中EGFR的表达与临床病理特征无关。

为了分析肝巨噬细胞中EGFR的表达，我们对邻近组织切片进行EGFR和巨噬细胞标记物CD68染色。在“正常”肝组织中，所有CD68阳性细胞均不表达EGFR(表1a). 相比之下，45%的中国和34%的欧洲样本在从+到+++的肿瘤中含有EGFR-表达CD68阳性细胞(图4a、b,补充图3f,表1a). 癌旁非癌组织中也存在EGFR-表达的巨噬细胞：中国人为12%，欧洲人群为27%。欧洲样本邻近组织中EGFR-阳性巨噬细胞的数量较高，可能反映了这些肝脏中更晚期的肝硬化。新鲜冷冻人肝癌标本中EGFR和CD68共表达的特异性通过共染色得到证实(补充图3g). 肝癌中EGFR-表达的巨噬细胞与中国患者手术切除肿瘤后和欧洲患者肝移植后不良临床结局相关，OS和DFS显著降低(图4c-f). α-甲胎蛋白（AFP）是一种肝癌肿瘤标志物，在有EGFR-阳性巨噬细胞的肝癌患者中显著升高(表1b). 在欧洲队列中，EGFR阳性巨噬细胞与更具侵袭性的肿瘤有关，肝移植后HCC复发的患者的肿瘤中有EGFR阳性巨噬细胞(表1b). 为了分析CD68阳性细胞总数（不考虑EGFR表达）是否对HCC预后有影响，我们将患者样本分为低巨噬细胞计数和高巨噬细胞计数，并将各自患者队列的中位数作为临界值。对于欧洲队列，库普弗细胞/肝巨噬细胞的数量不能单独预测OS和DFS(图4i-j). 然而，巨噬细胞总数与中国患者的OS和DFS呈负相关(图4g-h). 总的来说，这些数据表明肝细胞癌中存在的EGFR-阳性肝巨噬细胞的数量不是肝巨噬细胞的总数，而是对OS和DFS的预测。

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图4

肝癌患者Kupffer细胞中EGFR的表达与预后不良相关

(a-b公司)连续切片上具有代表性的EGFR和CD68染色（棕色）显示人类HCC样本中的Kupffer细胞。比例尺：50μm。(立方英尺)总生存率（OS，c（c）,e（电子）)和无病生存（DFS，d日,（f）)在中国人Kupffer细胞/肝巨噬细胞中有（+，++，++）或无（0）EGFR表达的HCC患者中(c（c）,d日：129名患者（71名EGFR阴性；58名EGFR阳性）和欧洲队列(e、 （f）：108例患者（49例EGFR阴性；59例EGFR阳性）。（g-j）)总生存率（OS，g、 我)和无病生存（DFS，h、 j个)中国肝癌患者肿瘤中Kupffer细胞/肝巨噬细胞数量低或高(g、 小时：129名患者：n=52名低计数患者，n=77名高计数患者）和欧洲队列(i、 j个：108名患者：50名低计数患者，58名高计数患者）。定义高和低的截止值是中间值。对于各自的患者队列，低分为低于或位于第50个百分位的值，高分为高于第50个百分点的值。评分系统：0=阴性染色（0%-10%阳性），1=弱信号（10%-20%阳性），2=中间信号（20%-50%阳性），3=强信号（>50%阳性）³⁰采用对数秩和检验评估统计显著性。

EGFR-defient Kupffer细胞不能产生IL-6

接下来我们分析了巨噬细胞中EGFR信号促进肿瘤发生的机制。Kupffer细胞对来自受损肝细胞的IL-1产生高水平的IL-6，并通过IL-6R激活刺激代偿性肝细胞增殖^10,11我们发现，注射DEN后，IL-6血清水平在表皮生长因子受体^{飞行/飞行}和表皮生长因子受体^Δhep老鼠，但不在表皮生长因子受体^ΔMx和表皮生长因子受体^Δhep/Δmac巨噬细胞EGFR缺乏的小鼠(图5a). 重要的是，我们还发现，在肿瘤中显示EGFR-阳性Kupffer细胞的中国HCC患者的血浆中IL-6水平显著升高(图5b). 这与HBV感染有关(图5c)表明感染和炎症状态导致Kupffer细胞EGFR上调，从而增加IL-6的产生。对于欧洲队列，患者血浆不可用。因此，在DEN诱导的肝损伤中，Kupffer细胞/肝巨噬细胞中的EGFR需要诱导IL-6的表达。

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图5

EGFR-依赖性IL-6的产生和释放

(一)ELISA显示IL-6血清水平表皮生长因子受体^{飞行/飞行},表皮生长因子受体^Δhep,表皮生长因子受体^ΔMx、和表皮生长因子受体^Δhep/Δmac注射DEN后6、24和48小时，小鼠（每个基因型和时间点3只）体内. (公元前)中国队列中肝癌患者（n=104）的IL-6血浆水平按(b条)肿瘤中存在EGFR-阳性（n=31）或EGFR-阴性（n=73）Kupffer细胞，或另外考虑(c（c）)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性。HBsAg阴性/EGFR阴性（n=37）；HBsAg阴性/EGFR阳性（n=11）；乙肝表面抗原阳性/EGFR阴性（n=36）和乙肝表面抗原阴性/EGFR阳性（n=20）。(d日)与IL-1β孵育24小时后培养的Kupffer细胞向上清液中释放IL-6在体外（n=每个基因型3个库普弗细胞株）。(e（电子）)DEN注射后5天和8天，对所示基因型小鼠肝切片中BrdU阳性细胞的定量（每个基因型和时间点n=3只小鼠的HPF计数总和）。(（f）)qRT-PCR显示IL-1β刺激后Kupffer细胞中肝素结合EGF-样生长因子（HB-EGF）（HB）、TGFα、AR、表调节蛋白（ER）、BTC、ADAM17（也称为TACE）和ADAM12（A12）的表达在体外（n=4个Kupffer细胞株，每个基因型和条件）。两个合并的独立实验。KO，击倒。(克)在IL-1β刺激24小时后，在存在指示抑制剂的情况下，AR释放到培养的Kupffer细胞上清液中。（n=每个基因型3个枯否细胞株，每个n是3个技术重复的平均值）。三个合并的独立实验。(h、 我)培养的Kupffer细胞在培养24小时后释放IL-6(小时)IL-1β（n=3个Kupffer细胞株/基因型，每个n是3个技术重复、三个联合独立实验的平均值）或(我)EGF（n=每个基因型3个Kupffer细胞株，每个n是3个技术重复的平均值，三个合并的独立实验），存在指示的抑制剂。（g-i）抑制剂：JNK=SP600125，p38=SB203580，IKK2=Sc-514，TACE=TAPI-1，EGFR=BIBW2992。数据(a-i公司)代表平均值±标准差t吨-独立样本和不相等方差的检验用于评估统计显著性（*p<0.05，**p<0.01，**p<0001）。原始数据见补充表1.

为了进一步研究IL-1是否能以EGFR依赖的方式诱导肝巨噬细胞产生IL-6，我们量化了分离的库普弗细胞/肝巨噬细胞与IL-1β孵育后的IL-6水平在体外IL-1β能够诱导表达EGFR的肝巨噬细胞分泌IL-6(图5d). 用EGFR抑制剂以剂量依赖的方式治疗可以阻止库普弗细胞产生IL-6(补充图4a、b). 炎症细胞因子，如IL-17A、IL-22和IL-23，在表皮生长因子受体^{飞行/飞行},表皮生长因子受体^ΔMx以及我的D88^−/−IL-1β或EGF刺激后的Kupffer细胞(补充图4d). 用Toll-Like Receptor（TLR）激动剂（如PolyIC、Imiquimod和LPS）刺激后，EGFR-表达和缺乏的Kupffer细胞产生的IL-6具有可比性(补充图4c)表明EGFR-deficient Kupffer细胞在IL-6的产生中并没有内在受损。因此，EGFR-defient Kupffer细胞不能产生IL-6来响应IL-1，这表明EGFR-dependent IL-6的产生是IL-1R信号的下游。

由于IL-6刺激代偿性增殖，我们接下来分析了DEN治疗后小鼠的肝细胞增殖(图5e). 在中观察到最强的BrdU掺入表皮生长因子受体^Δhep肝脏可能是因为DEN诱导的损伤很高（因为肝细胞缺乏EGFR），并且EGFR表达的Kupffer细胞/肝巨噬细胞产生IL-6来刺激增殖。相比之下，在表皮生长因子受体^ΔMx和对照肝脏，可能分别是因为EGFR-阴性Kupffer细胞/肝巨噬细胞产生的IL-6受损，以及对照（EGFR-表达）肝细胞中较轻的DEN诱导损伤(图5e). 总之，这些结果表明代偿性增殖增加与IL-6水平增加和HCC形成增加相关。

DEN/PB诱导小鼠肝癌

根据所示方案，在雄性小鼠中通过化学致癌作用诱发肝肿瘤补充图1a。当肝脏肿瘤在表皮生长因子受体^{飞行/飞行},表皮生长因子受体^（f）/+或表皮生长因子受体^+/+Cre+窝友对照小鼠，发生在阿尔普·克雷，约46周Mx-Cre公司大约63周Alfp-Cre；LysMCre公司双转基因背景。小鼠的遗传背景是混合的（C57BL/6×129/Sv×CBA/J），但不同Cre系之间存在差异，从而解释了肿瘤发生的时间差异。对于每个实验，我们都显示表皮生长因子受体^上下作为对照的室友。为了排除Cre介导的影响，我们确认表皮生长因子受体^（f）/+或EGFR^+/+ Alfp-Cre、Mx-Cre、LysM-Cre小鼠出现了与表皮生长因子受体^{飞行/飞行}控制。通过测量循环转氨酶AST/ALT（Reflotron，Roche）和在指定时间点使用H&E染色切片量化坏死区域来确定DEN注射后的肝损伤（100mg/kg体重）。

组织学

肝组织在4%多聚甲醛中固定24小时，脱水，石蜡包埋，切片（5μm）。切片用苏木精和伊红（Sigma）染色，以量化DEN诱导损伤后的坏死，并量化肝脏肿瘤。图像由尼康eclipse 80i显微镜获得，量化由Adobe Photoshop CS4（Adobe）完成。在每个肝脏的两个H&E切片上对肝脏肿瘤进行量化，如前所述，这两个切片之间的距离至少为200μm²⁵.

免疫组织化学和免疫荧光

Ki67染色、BrdU原位检测、TUNEL和免疫印迹的方案已经过描述^34-37简而言之，对于抗原提取，除非制造商说明书中另有说明，否则使用靶向提取液（Dako）处理石蜡包埋组织，并根据制造商的建议进一步进行免疫组织化学处理。为了分析细胞增殖，向小鼠腹腔注射100μg/g体重的BrdU。使用ABC染色试剂盒（加利福尼亚州伯灵盖姆矢量实验室）对BrdU（Caltag，Burlingame，CA）和Ki67进行染色。原位细胞死亡检测试剂盒（印第安纳波利斯罗氏）用于TUNEL染色。阳性细胞的数量是通过人工计数高功率场的指示数量来确定的。为了进行免疫荧光染色，将肝脏包埋在最佳切割温度化合物（Sakura）中，用于冰冻切片制备（4μm），并根据制造商对每个抗体的建议进行固定。对于免疫组织化学和免疫荧光染色，使用了针对以下抗原的抗体：EGFR（CST#4267；克隆D38B1；1/50）、F4/80（Serotec MCA497R，克隆CI:A3-1；1/100和eBioscience 14-4801；克隆BM8；1/100）、Ki67（Novo Castra NCL-Ki67p；1/1000）、CD68（abcam ab955；克隆KP1；1/200）、HMGB1（CST#3935；1/100，活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（研发系统AF835；2000年1月）。二级抗体购自分子探针和载体实验室。使用Zeiss-LSM 700显微镜拍摄共焦图像，并使用ZEN2010软件进行评估。对于平均荧光强度测量，使用ImageJ分析共焦图像。使用椭球选择工具选择单个F4/80阳性细胞，并使用直方图工具（仅使用绿色通道值）分析EGFR表达的平均荧光强度（Alexa 488）。

Western Blot分析

根据标准方案制备蛋白质裂解物。将溶解的蛋白质重悬于变性蛋白质负载缓冲液中。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜（Millipore）。使用了以下抗体：pEGFR（Tyr1068 CST#3777；克隆D7A5；1/1000；Tyr1173 CST#4407；克隆53A5；1/1000）、EGFR（CST#4267；克隆D38B1；1/500）、pJNK（CST#9255；克隆G9；1/2000）、JNK；1/1000），IKKβ（CST#2370；克隆2C8；1/1000），pNF-κB（CST#3033；克隆93H1；1/1000）、NF-κ子B（CST#3034；1/1000；）、pStat3（CST#9145；克隆D3A7；1/2000）、Stat3（sc-7179；1/100）、肌动蛋白（西格玛A2066；1/1000。

ELISA和MTT检测

在刺激后的指定时间点收集来自库普弗细胞培养物的上清液，并根据制造商的说明使用ELISA试剂盒。ELISA检测IL-6、IL17A、IL22、IL23（eBioscience）、两性调节蛋白（R&D Systems）、CCL2、IL-1β和IL-1α（BD-Biosciences-Pharmigen）。MTT分析（EZ4U，Biomedica）用于量化微孔中存活Kupffer细胞的数量。将细胞因子值标准化为存活的库普弗细胞的数量。

逆转录聚合酶链反应

用TRIzol试剂（Invitrogen）从培养的肝细胞、培养的Kupffer细胞或肝脏和肝肿瘤中分离出总RNA。根据制造商的说明，使用SuperScript第一链合成系统（Invitrogen）进行cDNA合成。根据制造商的说明，使用SYBR Green Mix（Applied Biosystems）进行qRTPCR反应，引物检测：IL-1β-F（GGGCCTCAAAGGAAAGAATC）、IL-1β-R（TACCATTGGGAACTCTCTGCTGC）、IL1α-F（CACCTACCACCAGAGTATTTG）、IL-1α-R（TGTTGCAGCATTACCAAGTG）、，IL-6-R（TTCTCATTTCCACGAGTCCAGAGAGAG）、HB-EGF-F（ACCAGTGAGAATCCCCTAC）、HB-EGF-R（GCCAAGACTGTGTGGTCA）、TGFα-F（TCTGGGTGGTTC）、TGF-α-R（ACAGGTAATGGACAGCCC）、AR-F、BTC-F（GACGAGCAACTCTCCT）、BCT-R（ATCAAGCACCACGAGGAT）、，TACE-F（ACCACTTTGGTGCCTTCGT）、TACE-R（GTCGCAGACTGTAGATCCT）、ADAM12-F（AGACGTGTGACTGTGCAAC）、ADAME12-R。在7500快速实时PCR系统（美国加利福尼亚州应用生物系统公司）上，在以下条件下进行PCR：在50°C下初始培养20 s，95°C培养10 min，然后在40个95°C循环15 s，54°C培养1 min。RNA的相对定量通过ΔΔCt法计算。cDNA缺失作为阴性对照。

肝细胞和枯否细胞培养

根据之前公布的方案，在肝脏灌注后分离肝细胞和枯否细胞²⁵简而言之，用含有胶原酶（Gibco）的灌注缓冲液通过门静脉以7ml/min的速度灌注肝脏。所得细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器（BD Falcon Biosciences）。细胞组分通过Percoll梯度分离。细胞直接用于进一步分析或培养如下：将肝细胞涂布在胶原预涂层细胞培养皿上，并在添加10%FCS、2mM谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素（P/S）的HepatoZyme-SFM（Gibco）中培养。用指定量的DEN处理肝细胞24小时，或在放线菌酮（100μg/ml，Sigma）存在下用10ng/ml TNFα（eBioscience）处理肝细胞12小时。将Kupffer细胞接种在RPMI 1640中的无涂层细胞培养皿上（96周板为每孔50000个），加入10%FCS、2mM谷氨酰胺和1%P/S，持续24小时，然后隔夜饥饿（在含有0.5%FCS的培养基中用于细胞因子诱导；在无血清培养基中进行信号传递实验）。在指定的时间段内，用IL-1β（10ng/ml，eBioscience）、EGF（10ngg/ml，Lonza）、polyIC（20μg/ml，GE Healthcare）、Imiquimod（12μg/ml）和LPS（10ng/ml，Invivogen）刺激枯否细胞。无论何时，在使用以下抑制剂刺激之前，Kupffer细胞预先培养5小时（用于细胞因子分泌）或1小时（用于信号传递实验）：BIBW2992（0.005-20μM，Selleck）、Cetuximab（0.01-1μg/ml，Merck）、TAPI-1（10μM，Peptides International）、SP600125（25μM，Calbiochem）、SB203580（10μM，Cell signaling）、，和SC-514（100μM，钙生物化学）。由于可以从一只小鼠中回收的枯否细胞数量非常少，因此从技术上来说，不可能对一批枯否细胞上的所有指示信号分子进行Western Blot分析。通常将来自同一基因型的2个肝脏的Kupffer细胞汇集在一起，以获得约20-30μg的蛋白裂解物，这足以进行1个Western blot。

患者材料和免疫组织化学

根据东部肝胆外科医院伦理委员会和维也纳医科大学批准的既定方案，在知情同意后采集人体样本。中国队列中的129名HCC患者是从2002年1月至2006年6月在东方肝胆外科医院（中国上海）接受治疗性切除的HCC患者中随机抽取的。这些肝癌患者均未接受术前抗癌治疗。正常肝组织取自接受肝血管瘤手术的患者的远端正常肝切片，这些患者没有任何慢性肝病的证据。

欧洲队列中的108名HCC患者是从维也纳医科大学（Medical University of Vienna）为HCC接受原位肝移植的患者中随机抽取的^38,39这些肝癌患者均未接受术前抗癌治疗。所有人类组织（中国和欧洲队列）的免疫组织化学和定量分析（评分）均由同一实验室（中国）按照标准程序以盲法进行。

将载玻片与以下初级抗体孵育：抗EGFR（CST#4267；克隆D38B1；1/50）；抗CD68（巨噬细胞标记物，abcam ab955；克隆KP1；1/200）。欧洲和中国患者队列的肝细胞或Kupffer细胞中EGFR染色由2名独立观察者进行半定量检查，并使用以下评分标准进行盲法评分：0=染色阴性（0%-10%阳性），+=弱信号（10%-20%阳性），++=中间信号（20%-50%阳性）和+++=如前所述的强信号（>50%正）⁴⁰2名病理学家的评分结果与此类病例的评分结果仅存在轻微差异；较低的得分用于生成表1.

我们感谢Latifa Bakiri、Denise P.Barlow、Robert Eferl、Martin Oft和Erwin F.Wagner对手稿的批评性阅读。我们感谢Temenuschka Baykuscheva-Gentscheva和Sarah Bardakji的基因分型，感谢Florian Hucke和Georg Heinze的出色统计支持。这项工作得到了EC计划LSHC-CT-2006-037731（Growthstop）、奥地利科学基金（FWF）资助SFB F3518-B20（给M.S.）和F3517（给M.T.）、FWF-DK W1212和P25925以及奥地利联邦政府的GEN-AU计划“Austromouse”（GZ 200.147/1-VI/1a/2006和820966）的支持。H.W.感谢中国国家自然科学基金会30921006的资助。