Increased Degranulation of Natural Killer Cells during Acute HCV Correlates with the Magnitude of Virus-specific T cell Responses

Sandy Pelletier; Christian Drouin; Nathalie Bédard; Salim I. Khakoo; Julie Bruneau; Naglaa H. Shoukry

doi:10.1016/j.jhep.2010.05.013

肝素杂志。作者手稿；PMC 2014年9月29日发布。

以最终编辑形式发布为：

肝素杂志。2010年11月；53(5): 805–816.

2010年7月17日在线发布。数字对象标识：2016年10月10日/j.jhep.2010.05.013

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PMID：20688412

急性HCV期间自然杀伤细胞脱颗粒增加与病毒特异性T细胞反应的程度相关

桑迪制粒机,^1,^三克里斯蒂安·杜鲁因,^1,^三纳塔莉·贝达德,¹ 萨利姆·卡库,² 朱莉·布鲁诺,^1,⁴和纳格拉·舒克里^1,⁵

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关联数据

补充资料: 补充数据：补充图S1。CD107a和IFN-γ的代表性流式细胞术染色。用CD107a表面染色法测定脱颗粒，用细胞内IFN-γ测定细胞因子的产生。将PBMC与（底行）K562靶细胞或不与（顶行）K562靶细胞共同孵育。CD107a型⁺和干扰素-γ⁺在两个NK细胞亚群CD56上选通细胞^明亮的CD16型⁻（左栏）和CD56^昏暗的CD16型^+/洛（右栏）。
补充图S2。总CD107a表达和总IFN-γ产生。用CD107a表面染色法测量HCV慢性演变患者（•）、HCV自发消退（Δ）、暴露未感染者（■）和健康献血者（○）的脱颗粒情况。PBMC与K562靶细胞共孵育或不与K563靶细胞共培养。从靶细胞的表达中减去CD107a的背景表达。A） CD107a的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和B）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。C） IFN-γ的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和D）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。HCV感染的急性期以阴影区表示。平均值由水平条表示*p<0.05**p＜0.01***p<0.001。双向方差分析（重复测量）或单向方差分析（与健康供者比较）。
补充图S3。抑制受体的代表性流式细胞术染色。检测了五种抑制性受体（NKG2A、CD161、KIR2DL1/S1、KIR2DL2/L3/S2和KIR3DL1）体外受精在两种NK细胞亚群中：CD56^明亮的CD16型⁻（顶行）和CD56^昏暗的CD16型^+/洛（最下面一行）。
补充图S4。活化标记物和活化受体的代表性流式细胞术染色。检测了一个激活标记（CD69）和三个激活受体（NKp44、NKp30和NKG2D）体外受精在两种NK细胞亚群中：CD56^明亮的CD16型⁻（顶行）和CD56^昏暗的CD16型^+/洛（最下面一行）。
补充图S5。CD107a总表达和IFN-γ总产生与HCV特异性T细胞反应无关。如图所示，在HCV慢性演变和HCV急性期自发消退的患者中测定NK细胞脱颗粒和IFN-γ的产生图S2在这些患者中，大约1个月后，使用ELISPOT分析法，通过IFN-γ分泌对跨越整个HCV多聚蛋白的重叠HCV肽的反应来确定HCV特异性T细胞反应的大小。A）丙型肝炎病毒特异性T细胞反应与CD107a频率的相关性⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁺NK细胞，B）CD107a的频率⁺CD56上的门控细胞^昏暗的CD16型⁻NK细胞，C）IFN-γ的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁺NK细胞，D）IFN-γ的频率⁺CD56上的门控细胞^昏暗的CD16型⁻NK细胞。用Spearman检验确定相关性。
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摘要

背景/目标

自然杀伤（NK）细胞通过杀死受感染的细胞并产生抑制病毒复制的细胞因子，提供对病毒感染的早期防御。NK细胞也与树突状细胞（DC）相互作用，这种相互作用调节先天性和适应性免疫。遗传研究表明，NK细胞活性是HCV感染结果的决定因素，但尚未建立功能相关性。我们假设急性HCV感染期间NK细胞活性的增加与病毒的自发清除有关。

方法

我们使用多参数流式细胞术纵向监测HCV暴露后静脉吸毒人群中NK细胞的表型和活性。研究了三组：急性HCV慢性演变组（n=13）；急性消退型HCV（n=11）；和接触未感染者（n=10）。我们检测了几种NK细胞激活和抑制受体的表达、刺激后IFN-γ的产生和CD107a脱颗粒，以及NK细胞反应相对于T细胞反应的动力学。

结果

我们观察到，HCV自发清除后，NK细胞上抑制性NKG2A受体的表达降低。此外，我们观察到，无论感染结果如何，急性HCV期间NK细胞脱颗粒增加。NK细胞峰值反应先于或与T细胞峰值反应一致。此外，NK细胞脱颗粒与HCV特异性T细胞的数量相关。

结论

我们的结果表明，无论感染结果如何，NK细胞在急性HCV期间都被激活，并且可能通过诱导和启动T细胞反应发挥间接作用。

关键词：先天免疫、病毒性肝炎、细胞毒性、细胞因子

介绍

大多数接触丙型肝炎病毒（HCV）的人会出现持续感染和慢性肝病[1]. 急性丙型肝炎的特点是，尽管病毒复制活跃，但适应性T细胞反应的出现明显延迟。这表明先天免疫无法抑制病毒复制，并为启动对病毒自发清除至关重要的有效适应性免疫提供必要信号[2,三]. 自然杀伤（NK）细胞是先天性免疫反应最重要的效应细胞群。根据CD56和CD16的差异表达可以区分两种NK细胞亚群：免疫调节性CD3⁻CD56型^明亮的CD16型⁻和溶细胞CD3⁻CD56型^昏暗的CD16型⁺[4]. NK细胞通过杀死受感染的细胞并产生细胞因子来提供抵御病毒感染的早期防线，细胞因子可以直接抑制病毒复制并触发适应性免疫反应。NK细胞使用抑制和激活受体作为控制其活性的手段。NK细胞与树突状细胞（DC）相互作用，这种相互作用导致先天性和适应性免疫反应的调节[5,6]. 树突状细胞可以通过与NK细胞表面的NKp30结合并分泌大量细胞因子（如IL-12）来激活NK细胞[7]. 反过来，NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α，诱导DC成熟并触发适应性免疫反应[8]. 此外，NK细胞还可以杀死未成熟的DC，并抑制其启动或耐受适应性T细胞反应的能力[5,9].

两项观察结果强调了NK细胞在HCV感染早期的潜在作用。首先，HCV表面糖蛋白E2可以在NK细胞表面结合CD81，抑制细胞毒性和IFN-γ的产生[10,11]，但是Yoon等最近证明，将来自健康捐赠者的NK细胞暴露在体外产生的HCV病毒中不会影响其功能[12]. 其次，编码抑制性NK细胞受体杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）2DL3及其人类白细胞抗原C组1（HLA-C1）配体的基因直接影响这些基因纯合子个体HCV感染的解决[13,14]. 这些观察结果表明，在HCV早期抑制NK功能可能有助于病毒的持久性。

几个小组已经研究了慢性HCV感染期间的NK细胞，但结果在NK细胞频率、细胞毒性、细胞因子产生和受体表达方面存在冲突[15-20]. 这可能反映了控制NK细胞的激活和抑制信号的复杂性。只有一项研究比较了慢性丙型肝炎患者与单一来源爆发的自发性解毒剂的NK细胞功能[15]. 他们证明CD56的频率^昏暗的慢性丙型肝炎患者的NK细胞亚群减少，NK细胞表达NKG2A/C/E受体的频率较高[15]但在急性丙型肝炎期间，NK细胞的活性及其与感染结局的相关性尚未研究，而在急性HCV期间，NK细胞的作用最为显著。

在这项研究中，我们使用多参数流式细胞术纵向监测了一组独特的静脉吸毒者（IDU）中NK细胞的表型和功能变化，这些吸毒者在急性HCV感染之前和期间具有HCV感染的高风险，并发展到自发消退或病毒持续存在。此外，我们监测了一组HCV暴露但未感染者的NK细胞活性。我们证明，无论感染结果如何，急性HCV期间NK细胞脱颗粒增加。我们还观察到自然病毒清除后NK细胞上NKG2A表达下降，以及慢性感染中CD161表达下降。最后，我们发现NK细胞反应峰值先于T细胞反应，NK细胞脱颗粒与HCV特异性T细胞反应的大小相关，表明NK细胞在启动适应性免疫反应中起间接作用。

患者和方法

研究对象和临床随访

本研究共纳入34名HCV暴露者和10名正常献血者。在参与蒙特利尔急性肝细胞癌队列研究（HEPCO）的高危注射吸毒者中招募HCV急性感染者[21]蒙特利尔大学医院中心圣卢克医院的美沙酮治疗和肝病诊所。本研究由机构伦理委员会批准（第SL05.014号和第SL05.025号议定书），并根据《赫尔辛基宣言》进行。所有参与者在注册时签署知情同意书。急性HCV感染（n=24）被定义为在过去6个月内之前的阴性检测后检测到HCV RNA和/或HCV抗体阳性，或HCV RNA阳性伴随HCV抗体阴性检测。最后一次静脉注射和第一次病毒感染时间点之间的平均随访间隔为12周（范围：1-25周），估计感染时间定义为最后一次注射和第一个病毒感染时间点通过的中位数。感染持续时间定义为估计感染时间后的时间（以周为单位）。自发病毒消退（n=11）或持续感染（n=13）被定义为入学后12周HCV RNA的缺失或存在。这一分类是因为加拿大最近的指南建议，如果所有HCV急性感染患者在第12周前仍为HCV阳性，则应接受干扰素治疗[22]. 纳入本研究的所有患者要么不合格，要么拒绝接受干扰素治疗。无论是在第12周还是第24周，他们的急性或慢性分类都没有改变。暴露的未感染者（n=10）是指那些承认与HCV感染者共用针头或注射材料，但仍为HCV RNA和HCV抗体阴性的注射吸毒者。在本研究中，对每名患者的三个时间点进行了分析，这三个时间点将代表HCV感染的三个阶段：感染前基线、急性HCV和随访。基线被定义为HCV感染前的时间或暴露于未感染者的报告共用针头的时间（范围：−1至−22周；平均−10周）。8名慢性病患者、5名自发性解析器患者和5名未感染者的基线样本可用。急性HCV定义为HCV感染者估计感染时间后12周（范围：6-17周）和未感染者共用针头后4周（范围为0-12周）。随访时间点定义为HCV感染者估计感染后52周（范围：34至62周）或未感染者共用针头后36周（范围为20至56周）。所有患者的人类免疫缺陷病毒（HIV）和乙型肝炎病毒（HBV）检测均为阴性。

HCV RNA检测和量化

使用自动化COBAS AmpliPrep/COBAS Amplicor HCV测试2.0版（灵敏度，50 IU/ml）（罗氏分子系统公司，新泽西州布兰奇堡）进行HCV RNA定性测试。HCV基因分型使用NS5B区域的标准测序进行，并由魁北克省圣普利克实验室（加拿大QC的Ste-Anne-de-Bellevue）进行，作为患者临床随访的一部分。如前所述，使用内部定量实时逆转录PCR测定法进行额外的HCV RNA定量[23].

流式细胞术抗体和试剂

使用了针对以下分子的直接结合抗体：CD3-太平洋蓝（克隆UCHT1）、CD16-别藻蓝蛋白（APC）-Cy7（克隆3G8）或CD16-APC-H7（克隆3G8）、CD56-藻红蛋白（PE）-Cy8（克隆B159）、CD107a-PE-Cy5（克隆H4A3）、CD158a-异硫氰酸荧光素（FITC）（克隆HP-3E4）、CD58b-FITC（克隆CH-L）、，CD161-PE-Cy5（克隆DX12）、NK1-FITC（克隆DX9）、NKG2D-APC（克隆1D11）、NKp30-Alexa 647（克隆P30-15）和IFN-γ-APC（克隆B27）（均来自BD Biosciences，San Jose，CA，USA）；CD69-PE-Texas Red（ECD）（克隆TP1-55-3）和NKp44-PE（克隆Z231）（均来自法国马赛Beckman Coulter）；NKG2A-PE（克隆号131411）（来自美国明尼阿波利斯研发系统公司）。根据制造商的协议，使用Aqua Live/Dead固定死细胞染色试剂盒（Molecular Probes，Eugene，OR，USA）鉴定活细胞。我们使用了四个表型面板和一个功能面板。“荧光减一”对照染色用于确定染色的背景水平。使用配备蓝色（488 nm）、红色（633 nm）和紫色（405 nm）激光（BD Biosciences）的标准BD LSR II仪器进行多参数流式细胞术，以使用FACSDiva软件（BD bioscience）系统地进行七色染色。使用单一荧光色素和BD CompBeads（BD Biosciences）进行补偿。使用FlowJo软件（Mac 8.6.3版）（Tree Star，Inc.，Ashland，OR）分析数据文件。

NK细胞的多参数表型特征

所有流式细胞术分析均在冷冻保存的样品上进行。表型分析1-2×10⁶外周血单个核细胞（PBMC）在4°C下用表面抗体染色30 min，并在荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（1×磷酸盐缓冲液[PBS]、1%胎牛血清[FBS]、0.02%NaN）中洗涤两次_三)，并固定在FACS Fix缓冲液中（1×PBS，1%甲醛）。

细胞内细胞因子染色（ICS）和CD107a脱颗粒分析

2 × 10⁶在37°C的R-10培养基（RPMI培养基[Invitrogen，Carlsbad，CA，USA]补充10%FBS）中，用抗CD107a抗体和作为阴性对照的培养基或K562白血病靶细胞系（ATCC，Manassas，VA，USA）培养PBMC。在刺激1小时后，添加10μg/ml的布雷费尔丁A（西格玛-阿尔德里奇，St-Louis，MO，USA）和6μg/ml莫能菌素钠盐（西格马-阿尔德里希），培养细胞共6小时。用FACS缓冲液清洗细胞，染色以检测活率和细胞表面抗原，然后使用BD-Cytofix/Cytoperm溶液（BD Bioscience）进行渗透。然后用抗IFN-γ抗体对细胞染色30分钟，在BD-Perm/Wash缓冲液（BD-Biosciences）中洗涤两次，并固定在FACS固定缓冲液中。为了进行分析，细胞在活性CD3上进行门控⁻CD56型^鸟CD16型⁻和CD3⁻CD56型^昏暗的CD16型^+/洛NK细胞(图1A). 在存在或不存在靶细胞系的情况下，将特异性表达百分比计算为背景调节函数。

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图1

CD56频率无变化^昏暗的CD16型⁺HCV感染后的NK细胞

A）流式细胞术检测两种NK细胞亚群的策略：活淋巴细胞CD3⁻CD56型^昏暗的CD16型⁺和CD3⁻CD56型^明亮的CD16型⁻B）CD3的频率⁻CD56型^昏暗的CD16型⁺NK细胞和C）CD3⁻CD56型^明亮的CD16型⁻检测NK细胞体外受精HCV慢性演变患者（•）、HCV自发消退（Δ）、暴露未感染者（■）和健康献血者（○）。HCV感染的急性期以阴影区表示。平均值由水平条表示*p<0.05**p＜0.01***p<0.001。双向方差分析（重复测量）或单向方差分析（与健康供者比较）。

干扰素-γELISPOT

在测量NK细胞反应3周后（12周；范围：估计感染时间后6至17周），测量HCV特异性T细胞反应（范围：0至14周）。96-well聚偏二氟乙烯支撑的微量滴定板（Millipore，Bedford，MA，USA）用35%乙醇（15μl/孔）预湿1分钟，用PBS洗涤，并在4°C下用100μl/井（3μg/ml）抗IFN-γ捕获mAb（BD Biosciences）涂布过夜。用PBS清洗板，并在37°C下用200μl/孔R-10培养基封闭2小时。低温保存的PBMC在37°C水浴中快速解冻，并在R-10培养基中清洗。2 × 10⁵在37°C、5%CO的条件下，在AIM-V-HS培养基（AIMV完全培养基[Invitrogen]、2%人血清AB[Wisent，Saint-Bruno，QC，Canada]）中，用各种肽池以每种肽的最终浓度3μg/ml对PBMCs/well进行两次刺激36小时₂根据患者感染HCV的基因型，用11个肽库刺激患者，这些肽库跨越整个HCV多蛋白，对应HCV基因型1a（H77序列）或基因型3a（K3a/650序列）。感染其他HCV基因型和未感染HCV的患者用对应于HCV基因1a（H77序列）的肽刺激。肽来自生物防御和新兴感染研究资源库（BEI Resources，Manassas，VA，USA）。培养期结束时，用PBS-T（PBS，0.05%吐温-20）清洗平板，然后在室温下用生物素化抗IFN-γ抗体（克隆250 4S.B3）（BD Biosciences）在0.5μg/ml PBS/0.5%BSA中培养2小时。在室温下，用PBS/0.5%BSA中的链霉亲和素-碱性磷酸酶结合物（美国加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）（1:1000）清洗平板并培养1小时。使用碱性磷酸酶结合底物试剂盒（Bio-Read Laboratories）培养斑点5分钟，并停止使用自来水。使用免疫斑点分析仪（Cellular Technology Ltd[CTL]，Shaker Heights，OH，USA）对斑点进行计数。单用培养基培养的PBMC作为阴性对照。阳性对照为：PMA（佛波酯醋酸酯[Sigma-Aldrich]）50 ng/ml–离子霉素（Sigma-Aldrich）1μg/ml和对照肽库CEF（美国马里兰州日耳曼镇NIH艾滋病研究和参考试剂项目）0.5μg/ml。特异性斑点形成细胞（SFC）计算为（测试井中的平均斑点数-介质对照井中的平均斑点数），并归一化为SFC/10⁶PBMC。如果大于50 SFC/10，则回答为阳性⁶PBMC。

统计分析

在感染的基线、急性和随访阶段，通过双向方差分析（重复测量）评估HCV慢性演变、自发消退和暴露未感染的患者组之间的比较。使用SigmaStat 3.5 for Windows（Systat Software，Inc.，Chicago，IL，USA）对数据进行分析。通过单因素方差分析评估HCV慢性演变、自发消退、暴露未感染和健康献血者之间的比较。如果数据通过了正态性检验，则采用皮尔逊检验进行相关性评估；如果数据未通过正态性，则采用斯皮尔曼检验进行相关性分析。通过双尾模型评估携带特定KIR和HLA基因的患者组之间的比较t吨对独立样本进行测试，如果超过2组，则进行单因素方差分析。使用GraphPad Prism 5.02 for Windows（GraphPad-Software，San Diego，CA，USA）对数据进行分析。

结果

急性HCV感染与NK细胞脱颗粒增加有关

对34名HCV暴露的注射吸毒者和10名正常健康献血者进行了研究。如材料和方法所述，根据接触HCV后的结果确定了三个患者组：a）患有急性HCV并伴有慢性演变的患者（n=13）；b）急性HCV消退患者（n=11）和丙型肝炎病毒未感染，HCV RNA和抗-HCV抗体仍为阴性（n=10）。患者的人口统计和特征列于表1首先，我们纵向监测了两个NK细胞亚群CD56的频率^昏暗的CD16型⁺和CD56^明亮的CD16型⁻流式细胞术的NK细胞门控策略如所示图1ACD56的频率^昏暗的CD16型⁺与健康献血者相比，所有患者组的NK细胞亚群均减少(图1B)但相对于HCV感染的阶段，各组内的变化不显著。同样，CD56的频率也没有变化^明亮的CD16型⁻任何研究组HCV暴露后的NK细胞亚群(图1C). 接下来，我们研究了HCV暴露后NK细胞的功能能力。我们通过ICS监测IFN-γ的产生和CD107a的表达来监测两个NK细胞亚群的细胞因子产生和细胞毒性潜力，CD107a是一种脱颗粒标记物，可以指示NK细胞的细胞毒性[24]与经典NK细胞靶向K562细胞共培养的反应。代表性染色和门控策略见补充图S1对CD107a和IFN-γ阳性的NK细胞总数，以及CD107a或IFN-γ单阳性或双阳性NK细胞的频率进行了评估。我们没有观察到患者组或时间点之间NK细胞总脱颗粒（%CD107a+）频率的任何变化(图S2). 相反，我们观察到CD56的脱颗粒增加^明亮的CD16型⁻急性丙型肝炎患者慢性亚群及随访与基线比较(图2A). 同样，CD56的脱颗粒也有增加的趋势^昏暗的CD16型⁺相同患者的子集。与未感染者和健康献血者相比，这种增加具有统计学意义(图2B). 此外，我们观察到CD56的脱颗粒增加，具有统计学意义^昏暗的CD16型⁺与基线相比，急性HCV期间自发性解析器中(图2B). 当结果按患者分层时，我们继续观察到大多数HCV慢性演变患者脱颗粒增加(图2C和2D)和自发分辨率(图2E和2F). 总之，这些结果表明，无论感染结果如何，急性HCV感染期间NK细胞脱颗粒增加。

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图2

无论感染结果如何，急性丙型肝炎病毒感染都与NK细胞脱颗粒增加有关

用CD107a表面染色法测量HCV慢性演变患者（•）、HCV自发消退（Δ）、暴露未感染者（■）和健康献血者（○）的脱颗粒情况。PBMC与K562靶细胞共孵育或不与K563靶细胞共培养。从靶细胞的表达中减去CD107a的背景表达。A） CD107a的频率⁺干扰素-γ⁻CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和B）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。C） CD107a频率的纵向变化⁺干扰素-γ⁻丙型肝炎病毒慢性组（•）中每个患者代表的细胞在CD56上门控^明亮的CD16型⁻NK细胞和D）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。对于每个患者，不同的感染时间点用一条线连接起来。E） CD107a频率的纵向变化⁺干扰素-γ⁻CD56门控自发解析器组（Δ）单个患者的细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和F）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。对于每个患者，不同的感染时间点用一条线连接起来。HCV感染的急性期以阴影区表示。平均值由水平条表示*p<0.05**p＜0.01***p<0.001。双向方差分析（重复测量）或单向方差分析（与健康供者比较）。

表1

患者和捐赠者的人口统计和特征。

	n个	性别	年龄	比赛	基因型
		（%百万）	（年中值）	（白种人）	1/2/3
丙型肝炎病毒慢性演变	13	92%	32	11/13	2/0/8
HCV自发消退	11	63%	27	8/11	1/2/4
暴露未感染	10	70%	39	9/10	不适用
健康捐赠者	10	60%	31	7/10	不适用

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丙型肝炎病毒感染注射吸毒者IFN-γ产生减少

我们检测了总干扰素-γ的频率⁺(补充图S2)，单个CD107a⁻干扰素-γ⁺产生细胞(图3A)和CD107a⁺干扰素-γ⁺双阳性细胞(图3B)K562细胞刺激后，在不同的NK细胞亚群中。我们观察到，与健康献血者相比，所有慢性病患者和自发性解析器中产生IFN-γ的细胞在所有时间点的频率普遍下降(图S2,3A和3B). 暴露的未感染组表现出中等水平的IFN-γ生成。在一次比较中，我们观察到CD107a增加⁻干扰素-γ⁺CD56中未感染受试者的暴露频率^昏暗的CD16型⁺随访阶段NK亚群与慢性病的比较(图3B). 然而，与健康献血者相比，IFN-γ的生成始终呈下降趋势，这表明阿片类药物的使用可能会影响NK细胞的细胞因子生成能力[25,26]. 最后，如所示图3C和3DNK细胞对两种功能均呈阳性的频率（CD107a⁺干扰素-γ⁺)在随访阶段，与健康献血者相比，所有三组患者的死亡率都有所下降。仅在CD56中观察到这种减少^明亮的CD16型⁻NK细胞亚群(图3C). CD107a的频率⁺干扰素-γ⁺CD56内的加班时间保持不变^昏暗的CD16型⁺所有组中的NK细胞，与健康献血者中观察到的频率相当(图3D). 这些数据表明NK细胞功能的分离，其中IFN-γ的产生与脱颗粒不遵循相同的趋势。此外，他们认为阿片类药物的使用可能会影响NK细胞的细胞因子生成能力。

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图3

无论感染结果如何，HCV感染都与IFN-γ降低有关

通过细胞内IFN-γ测定HCV慢性演变患者（•）、HCV自发消退（Δ）、暴露未感染者（■）和健康献血者（○）的细胞因子生成。PBMC与K562靶细胞共孵育或不与K561靶细胞共培养。从靶细胞的表达中减去IFN-γ的背景表达。A） CD107a-IFN-γ的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和B）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。C） CD107a的频率⁺干扰素-γ⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和D）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。HCV感染的急性期以阴影区表示。平均值由水平条表示*p<0.05**p＜0.01***p<0.001。双向方差分析（重复测量）或单向方差分析（与健康供者比较）。

急性丙型肝炎患者NK细胞活化和抑制受体表达的纵向表型分析

为了确定急性HCV期间NK细胞活性的增加是否与其表面活化或抑制受体表达的变化有关，我们监测了活化标记物（CD69）、NK细胞活化受体（NKG2D、NKp30和NKp44）表达的纵向变化以及直接作用于NK细胞上的NK细胞抑制受体（CD161、NKG2A、KIR2DL1/S1、KIR2DL2/L3/S2和KIR3DL1体外受精HCV暴露后。每个标记的代表性染色见补充图S3和S4系列。如所示图4A和4B在研究的所有时间点，我们观察到与健康献血者相比，慢性和自发性解析器NK细胞亚群中激活标记CD69的表达降低。NKG2A的频率分析⁺NK细胞显示CD56降低了这种受体的表达^明亮的CD16型⁻HCV病毒清除后的NK细胞亚群(图4C). 最后，我们观察到CD161的频率降低⁺CD56型^昏暗的CD16型⁺慢性进化患者基线和随访阶段的NK细胞与健康献血者的比较(图4D). 我们观察到NKG2D、NKp30、NKp44、KIR2DL1/S1和KIR2DL2/L3/S2在不同患者组之间或研究的不同HCV感染阶段之间的表达没有显著差异（数据未显示）。这些结果反映了控制NK细胞活性的抑制和激活信号的复杂性。他们认为NKG2A的表达降低可能预示着HCV的自发清除，而CD161的表达降低则可能预示着慢性进化。

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图4

NK细胞表达激活标记物、激活受体和抑制受体

检测NK细胞表型标记的表达体外受精HCV慢性演变患者（•）、HCV自发消退（Δ）、暴露未感染者（■）和健康献血者（○）。A）CD69的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和B）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。C） NKG2A的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻D） CD161的频率⁺CD56上的门控细胞^昏暗的CD16型⁺NK细胞。HCV感染的急性期以阴影区表示。平均值由水平条表示*p<0.05**p＜0.01***p<0.001。双向方差分析（重复测量）或单向方差分析（与健康供者比较）。

NK细胞峰值先于HCV特异性T细胞峰值或与之重叠

为了表征急性HCV期间先天性NK细胞反应相对于适应性T细胞反应的诱导动力学，对12名急性感染患者（6名自发消退者和6名慢性者）的NK细胞和T细胞活性进行了纵向监测。通过CD56脱颗粒测定NK细胞活性^昏暗的CD16型⁺CD56的NK细胞群或IFN-γ产生^明亮的CD16型⁻通过IFN-γ分泌测定NK细胞群和T细胞对跨越免疫显性HCV核心蛋白和NS3蛋白的重叠HCV肽的反应[27-30]使用酶联免疫斑点（ELISPOT）测定。六分之四的自发性解析器（R1至R4患者）的NK细胞峰值反应先于或重叠于T细胞峰值反应(图5A). 在R5患者中，尽管NK细胞活性在测试的最早时间点达到最高，T细胞反应在测试后达到峰值，但由于缺乏早期样本，很难确定NK细胞反应峰值是否未被遗漏。最后，患者R6是我们观察到NK细胞在T细胞峰值反应之后出现峰值反应的唯一自发解析器。对于患有慢性进化的患者(图5B)，6名患者中有2名（C1和C2）在T细胞峰值反应之前出现NK细胞峰值反应，3名患者（C3至C5）出现了相同的反应峰值，1名患者（C6）在T淋巴细胞峰值反应之后出现了NK细胞高峰反应。总之，对于大多数HCV感染者来说，NK细胞反应先于T细胞反应。

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图5

NK细胞峰值先于或与HCV特异性T细胞峰值一致

通过CD56脱颗粒测定NK细胞活性^昏暗的CD16型⁺CD107a型⁺干扰素-γ⁻CD56产生的NK细胞群或IFN-γ^明亮的CD16型⁻CD107a型⁻干扰素-γ⁺通过IFN-γ分泌测定NK细胞群和T细胞对跨越免疫显性HCV核心蛋白和NS3蛋白的重叠HCV肽的反应[27-30]使用ELISPOT分析对一组HCV急性感染患者进行纵向测量，这些患者要么是自发消退（n=6，a组），要么是慢性演变（n=5，B组）。血浆HCV病毒载量通过内部实时PCR检测（灵敏度1000 IU/ml）进行测量，并用灰色区域图表示。对于R3-R6患者，HCV-RNA低于我们的检测灵敏度。患者R3和R6在急性HCV诊断时为HCV RNA+（敏感性50 IU/ml），随后为阴性。R4患者从未感染过HCV-RNA+，在16周的间隔时间内，根据之前的抗-HCV抗体检测呈阴性，诊断为急性HCV。患者R5在急性HCV诊断时通过定性PCR检测为HCV RNA+（敏感性50 IU/ml），第一时间点检测为阴性。患者C5在研究的所有时间点通过定性PCR检测HCV RNA+（敏感性50 IU/ml），但样本无法用于病毒载量定量。

NK细胞活性与HCV病毒载量下降无关

如中所述图5A和5BNK细胞活性峰值虽然先于T细胞反应，但并没有引起病毒载量的任何重大变化，特别是在慢性进化患者中(图5B). 为了确定NK细胞活性是否有助于降低HCV血浆病毒载量，通过实时RT-PCR对所有HCV慢性演变和急性期自发消退患者的血浆中HCV RNA病毒载量进行量化。急性HCV期间的最高病毒载量与NK细胞脱颗粒或IFN-γ产生之间没有相关性（数据未显示）。值得注意的是，在大多数自发消退患者中测得的HCV RNA低于可能影响分析的定量水平。需要在HCV感染的早期进行进一步分析以阐明这一点。

NK细胞脱颗粒与HCV特异性T细胞反应的大小呈正相关

NK细胞可以与DC相互作用，这两种细胞类型之间的相互作用调节先天性和适应性免疫反应[6]. 我们试图确定无论感染结果如何，NK细胞活性是否会影响适应性免疫反应的诱导。我们检测了急性HCV期间通过脱颗粒或细胞因子产生测定的NK细胞活性与HCV特异性T细胞反应程度之间的相关性。用IFN-γELISPOT测定T细胞对跨越整个HCV多聚蛋白的重叠HCV肽库的反应。丙型肝炎病毒慢性演变和自发消退患者的结果显示在图6。在暴露的未感染组中，10名患者中只有1名患者的ELISPOT反应高于背景水平，因此未纳入本分析。我们观察到CD107a的频率与⁺干扰素-γ⁻CD56型^昏暗的CD16型⁺NK细胞和丙型肝炎病毒特异性T细胞反应的程度(图6A和6B). 观察到CD107a总量的类似趋势⁺但没有达到统计显著性(图S5). 相反，我们观察到CD107a的频率与⁻干扰素-γ⁺CD56型^明亮的CD16型⁻NK细胞与HCV特异性T细胞反应(图6C和6D). 总干扰素-γ也观察到类似的趋势⁺但没有达到统计显著性(图S5). 最后，CD107a的频率之间没有相关性⁺干扰素-γ⁺NK细胞和ELISPOT数据(图6E和6F). 即使排除了一名T细胞反应约为4000个斑点形成细胞（SFC）/百万PBMC（数据未显示）的异常患者（自发解析器），这些相关性仍保持不变。这些结果证明了两种NK细胞功能之间的二分法，并表明至少在急性HCV期间，NK细胞脱颗粒而非IFN-γ生成是先天性免疫和适应性免疫之间相互作用的更关键参数。

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图6

NK细胞脱颗粒与HCV特异性T细胞适应性免疫反应呈正相关，而IFN-γ与HCV特异性T细胞自适应免疫反应呈负相关

如图所示，在HCV慢性演变和HCV急性期自发消退的患者中测定NK细胞脱颗粒和IFN-γ的产生图2和和3。三在这些患者中，大约1个月后，使用ELISPOT分析法，通过IFN-γ分泌对跨越整个HCV多聚蛋白的重叠HCV肽的反应来确定HCV特异性T细胞反应的大小。A）丙型肝炎病毒特异性T细胞反应与CD107a频率的相关性⁺干扰素-γ⁻CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁺NK细胞，B）CD107a的频率⁺干扰素-γ⁻CD56上的门控细胞^昏暗的CD16型⁻NK细胞，C）CD107a的频率⁻干扰素-γ⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁺NK细胞，D）CD107a的频率⁻干扰素-γ⁺CD56上的门控细胞^昏暗的CD16型⁻NK细胞，E）CD107a的频率⁺干扰素-γ⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁺NK细胞，F）CD107a的频率⁺干扰素-γ⁺CD56上的门控细胞^昏暗的CD16型⁻NK细胞。用Spearman检验确定相关性。

讨论

我们分析了一组独特的自然消退或慢性演变的注射吸毒者在急性HCV感染期间NK细胞表型和功能的纵向演变。此外，我们在一组HCV暴露但未感染的高危注射吸毒者中检测了NK细胞活性。尽管HCV暴露是自我报告的，可能并不完全准确，但这一组是药物使用对NK细胞活性影响的重要对照组。观察到激活和抑制受体的可变表达模式，反映了NK细胞激活所涉及的复杂信号。我们证明，NKG2A表达在病毒自发清除后下调，而CD161在持续性病毒血症中表达降低，这表明它们分别可以预测病毒自发消退或慢性进化。我们已经证明，急性HCV期间NK细胞活性增加，脱颗粒作用增加。此外，我们已经证明，NK细胞活性的峰值先于或与T细胞反应的峰值一致。最后，NK细胞脱颗粒与HCV特异性适应性T细胞反应的大小呈正相关，而IFN-γ产生与HCV特异性适应性T细胞响应的大小呈负相关。

与之前研究慢性丙型肝炎期间NK细胞功能的报告类似[15,17,19]，我们证明CD56^昏暗的CD16型⁺与健康献血者相比，无论急性感染结果如何，HCV感染患者的NK细胞明显减少。NK细胞亚群的耗尽可能是由于持续刺激及其分化为活化的CD56所致^明亮的单元格[31]. 虽然最近的研究表明CD56^明亮的NK细胞分化为CD56^昏暗的NK细胞[32,33]. 事实上，我们没有观察到CD56的频率有任何增加^明亮的NK细胞或CD56比例^昏暗的/CD56型^明亮的在研究的任何患者组或阶段（数据未显示）。另一种可能性是CD56的存活率降低^昏暗的尽管一些研究表明肝脏中的NK细胞总数正常，但NK细胞或NK细胞从血液向肝脏迁移增强也可以解释这种损耗[34]甚至减少[35,36]HCV感染期间。

我们证明，在急性HCV期间，NK细胞脱颗粒增加，而与急性HCV的慢性演变或自发消退结果无关。然而，我们观察到，与健康献血者和未感染者相比，慢性患者的NK细胞脱颗粒较多，但所有HCV感染者的NK淋巴细胞产生的IFN-γ较少。这些结果表明，NK细胞在急性HCV感染期间被激活，表明NK细胞脱颗粒和细胞因子生成功能之间存在二分法或分离。事实上，最近的研究表明慢性丙型肝炎患者的NK细胞具有细胞毒性[37,38]这种极化可能是由于HCV感染引起的IFN-α体内刺激所致。

丙型肝炎病毒感染患者NK细胞IFN-γ产生减少可由两种机制解释。首先，HCV表面糖蛋白E2与NK细胞表面的CD81结合，并抑制细胞毒性和IFN-γ的产生[10,11]. 虽然这是一种有趣的可能性，但它不能解释基线期间干扰素-γ产生量低的原因。此外，Yoon的另一项研究等.[12]最近证明，健康献血者的NK细胞暴露于在体外-产生的HCV病毒不会影响其功能。在这个特定的队列中，NK细胞产生低IFN-γ的另一个可能的解释是阿片类药物滥用。据报道，海洛因滥用可降低NK细胞活性[25,26]. 特定的阿片受体在免疫细胞上表达，可以调节其功能。事实上，吗啡及其衍生物与包括淋巴细胞和NK细胞在内的各种免疫细胞类型上表达的mu受体相互作用。多项体外和体内实验表明，它可以抑制细胞因子的产生和淋巴细胞的增殖，并抑制人类、猴子和啮齿动物的NK细胞活性[39-41]. 在我们的HCV暴露注射吸毒者队列中，药物滥用可能是基线期间IFN-γ产生量低的原因。有趣的是，暴露的未感染注射吸毒者表现出IFN-γ的中间水平，在某些情况下高于慢性HCV感染的注射吸毒者，但在其他情况下低于正常献血者，这表明药物可能影响NK细胞活性，但不可能是唯一的因素。

早期激活标志物CD69在慢性进化和自发消退的HCV感染患者的NK细胞上的表达降低，但在暴露的未感染个体上的表达中等。在基线、急性期和随访期观察到这种下降，基本反映了与IFN-γ产生相同的模式。事实上，CD69表达与CD107a呈正相关⁻干扰素-γ⁺和CD107a⁺干扰素-γ⁺但与CD107a呈负相关⁺干扰素-γ⁻（未显示数据）。HCV E2糖蛋白也被证明降低CD25的表达[10]NK细胞上的另一个激活标记进一步支持直接抑制体内HCV病毒颗粒的作用机制。

我们证明了HCV慢性患者中抑制性受体NKG2A的正常表达。这与其他研究相反，这些研究表明，慢性丙型肝炎期间NKG2A在NK细胞上上调[18,42]它与肝脏坏死炎症评分增加有关[43]并增加NK细胞产生的IL-10[44]. 这可能与慢性肝病的发展有关。我们队列中的大多数患者接受了不到一年的随访，与其他研究中超过20年的慢性感染相比，没有发生任何严重的肝病或炎症[15]. 有趣的是，我们还证明NK细胞上NKG2A的表达在病毒自发清除后下调。这可能反映了一种阻止肝脏炎症和免疫抑制性IL-10 NK细胞发育的关闭机制。另外，研究表明，HCV感染的肝细胞表达增强的HLA-E水平，HLA-A2限制性表位HCV核心AA（35-44）稳定HLA-E的表达[18]. 由于NKG2A与HLA-E结合，慢性HCV患者NK细胞NKG2A表达增强导致HLA-E表达肝细胞的细胞溶解减少[18]. 在我们的研究中，自发解析器降低NKG2A的表达可能是这些患者逃避由表达HLA-E的感染肝细胞引起的细胞毒性损伤的机制。我们还发现慢性HCV感染患者中CD161表达NK细胞的频率较低。CD161是另一种抑制性受体，也被HIV慢性感染患者的NK细胞低频表达[24]. 这些结果表明，低CD161表达可能与慢性HCV和其他病毒感染有关。

据报道，编码抑制性NK细胞受体KIR2DL3及其HLA-C1配体的基因直接影响这些基因纯合子个体HCV感染的解决[13]. 由于KIR2DL3和HLA-C1纯合子患者数量有限，因此不可能在这些基因和NK细胞活性增加之间建立具有统计意义的相关性。此外，所研究的异质人群，包括慢性进化或自发消退的HCV感染患者和未感染的暴露人群，也可能影响我们的结果。在更大的HCV感染者群体中研究NK细胞活性对于在未来的研究中阐明这一点至关重要。

在这里，我们描述了急性HCV期间NK和HCV特异性T细胞功能变化的动力学，并证明了对于大多数HCV慢性病和自发性解析器，通过脱颗粒或IFN-γ产生测定的NK细胞峰值反应先于ELISPOT测定的T细胞峰值反应。这些结果表明，在HCV感染早期，NK细胞可能代表主要的细胞耐受效应群体。

我们证明NK细胞脱颗粒是细胞毒性的替代措施[45]与ELISPOT测量的HCV特异性T细胞反应的大小相关。在急性HCV期间，NK细胞杀死HCV感染的肝细胞可能会降低病毒载量，并允许产生有效的适应性免疫反应。然而，这种可能性是有限的，因为NK细胞活性与病毒载量无关。NK细胞对HCV感染肝细胞的破坏更有可能促进迁移DC对凋亡小体的摄取，并促进抗原转移到淋巴结，启动HCV特异性CD4+和CD8+T细胞。事实上，最近一项对小鼠的研究表明，NK细胞介导的靶细胞杀伤触发抗原特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞介导的体液反应[46]. 除了杀死感染细胞和癌细胞外，NK细胞还可以杀死未成熟的DC[9,47]. 杀死呈现HCV抗原的未成熟DC可能会限制耐受性适应性T细胞反应的发展，并有利于抗病毒T细胞的发展，这一过程称为DC编辑[6].

我们观察到NK细胞IFN-γ的产生与HCV特异性T细胞反应的程度呈负相关。这是一个令人惊讶的结果，因为IFN-γ对诱导DC成熟很重要。然而，在诱导DC成熟方面，NK细胞产生TNF-α的能力强于IFN-γ[8]. NK细胞产生TNF-α与HCV特异性T细胞反应程度之间的相关性需要进一步研究。此外，IFN-γ的作用在肝脏的免疫耐受环境中更为局部，这可能不会增强抗原呈递，并可能被其他几种耐受信号和介质（如IL-10）中和[48,49].

总之，我们认为无论感染结果如何，在急性HCV期间NK细胞都会被激活。这表明NK细胞活性可能与HCV清除无关。然而，NK细胞可能通过增强HCV抗原向淋巴结的转移和诱导T细胞反应发挥间接作用。由于NK-DC的串扰现象得到了很好的描述，我们很容易推测NK细胞可能通过诱导DC成熟或杀死具有耐受性的未成熟DC来编辑呈现HCV抗原的DC，从而有助于产生最佳抗病毒T细胞反应。

补充材料

补充数据

补充图S1。CD107a和IFN-γ的代表性流式细胞术染色。用CD107a表面染色法测定脱颗粒，用细胞内IFN-γ测定细胞因子的产生。将PBMC与（底行）K562靶细胞或不与（顶行）K562靶细胞共同孵育。CD107a型⁺和干扰素-γ⁺在两个NK细胞亚群CD56上选通细胞^明亮的CD16型⁻（左栏）和CD56^昏暗的CD16型^+/洛（右栏）。

补充图S2。总CD107a表达和总IFN-γ产生。用CD107a表面染色法测量HCV慢性演变患者（•）、HCV自发消退（Δ）、暴露未感染者（■）和健康献血者（○）的脱颗粒情况。PBMC与K562靶细胞共孵育或不与K563靶细胞共培养。从靶细胞的表达中减去CD107a的背景表达。A） CD107a的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和B）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。C） IFN-γ的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁻NK细胞和D）CD56^昏暗的CD16型⁺NK细胞。HCV感染的急性期以阴影区表示。平均值由水平条表示*p<0.05**p＜0.01***p<0.001。双向方差分析（重复测量）或单向方差分析（与健康供者比较）。

补充图S3。抑制受体的代表性流式细胞术染色。检测了五种抑制性受体（NKG2A、CD161、KIR2DL1/S1、KIR2DL2/L3/S2和KIR3DL1）体外受精在两种NK细胞亚群中：CD56^明亮的CD16型⁻（顶行）和CD56^昏暗的CD16型^+/洛（最下面一行）。

补充图S4。活化标记物和活化受体的代表性流式细胞术染色。检测了一个激活标记（CD69）和三个激活受体（NKp44、NKp30和NKG2D）体外受精在两种NK细胞亚群中：CD56^明亮的CD16型⁻（顶行）和CD56^昏暗的CD16型^+/洛（最下面一行）。

补充图S5。CD107a总表达和IFN-γ总产生与HCV特异性T细胞反应无关。如图所示，在HCV慢性演变和HCV急性期自发消退的患者中测定NK细胞脱颗粒和IFN-γ的产生图S2在这些患者中，大约1个月后，使用ELISPOT分析法，通过IFN-γ分泌对跨越整个HCV多聚蛋白的重叠HCV肽的反应来确定HCV特异性T细胞反应的大小。A）丙型肝炎病毒特异性T细胞反应与CD107a频率的相关性⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁺NK细胞，B）CD107a的频率⁺CD56上的门控细胞^昏暗的CD16型⁻NK细胞，C）IFN-γ的频率⁺CD56上的门控细胞^明亮的CD16型⁺NK细胞，D）IFN-γ的频率⁺CD56上的门控细胞^昏暗的CD16型⁻NK细胞。用Spearman检验确定相关性。

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致谢

我们感谢Robert Boweau在统计分析方面提供的工具性帮助，以及Hassen Kared对手稿的批判性阅读。本研究得到了达纳基金会、加拿大卫生研究院（CIHR）（MOP-74524）和魁北克圣母医院（FRSQ）艾滋病和传染病网络（Réseau SIDAMI）的资助。S.Pelletier是加拿大国家肝炎研究训练计划博士奖学金的获得者。J.文莱获得FRSQ颁发的高级临床研究奖。N.H.Shoukry获得加拿大传染病基金会和CIHR颁发的联合新研究员奖。

缩写

直流	树突状细胞
ELISPOT公司	酶联免疫斑点试验
乙型肝炎病毒	乙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒	丙型肝炎病毒
艾滋病咨询门诊	人类免疫缺陷病毒
内部控制系统	细胞内细胞因子染色
注射吸毒者	静脉吸毒者
干扰素-γ	γ干扰素
NK公司	自然杀伤细胞
中国人民银行	外周血单个核细胞

脚注

竞争性金融利益：无

工具书类

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