呼吸复合物I对在线粒体缺陷肿瘤细胞中诱导Warburg曲线至关重要

核酸提取

snap冷冻异种移植物和培养细胞（7×10）的DNA⁵)使用GenElute™哺乳动物基因组DNA Miniprep试剂盒（意大利米兰Sigma-Aldrich）提取。RNeasy Plus Mini试剂盒（意大利米兰齐根）用于从snap冷冻异种移植物中提取RNA。使用TRIzol试剂（意大利米兰Invitrogen）并按照制造商的说明获得细胞株RNA。

MT-ND1号异体结构

野生型月-日1从乳头状甲状腺癌TPC1细胞的cDNA中克隆[22]并插入p3XFLAG-CMV™-14表达载体（Sigma-Aldrich，Milan，Italy）。这个MT-ND1号序列与mtDNA修订的剑桥参考序列（rCRS）相同[GenBank:NC_012920.1]。为了不影响蛋白质折叠，FLAG表位被排除在转基因框架之外。舵手10[GenBank:U09466]3^′-和5^′-根据Bonnet克隆了UTR等. [23]. 第5个^′-来自核编码线粒体蛋白COX10的UTR被克隆到nND1号机组针对靶向线粒体外膜的mRNA，以及线粒体靶向序列（N末端MTS）。第三个^′-UTR来自COX10型已插入的下游nND1号机组以确保mRNA的稳定性。站点定向在体外根据制造商的说明，使用QuikChange Lightning Multi-Site-Directed mutagenesis Kit（Strategene，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA）进行诱变。可根据要求提供为此目的设计的寡核苷酸。

细胞转染、MT-ND1同种异体表达的选择和评估

按照制造商的方案，使用Lipofectamine 2000转染试剂（意大利米兰Invitrogen），用p3XFLAG-CMV™-14空载体和nND1同种异体构建物转染细胞。用400μg/mL G418（意大利米兰英维特罗根）进行筛选，获得稳定的克隆，并在不添加葡萄糖的DMEM中培养耐药克隆，再添加5 mM半乳糖、5 mM丙酮酸钠和10%FBS，以消除假阳性克隆。采用实时定量PCR（qRT-PCR）检测同种异体ND1的表达。从OS-93和OS-93中提取总RNA^ND1号机组利用转录因子第一链cDNA合成试剂盒（Roche Diagnostics，Monza，Italy），使用随机六聚体引物，将克隆和1μg用于逆转录。Primer和TaqMan®探针序列是使用Primer3软件设计的[24]使用IDT OligoAnalyzer工具排除了3′分子内/分子间的相似性[25]. 序列可根据要求提供。同种异体nND1 PCR产物跨越了COX10型MTS和5^′-nND1号机组为了排除任何内源性转录物，对质粒DNA中存在但未翻译的pCMV水平进行归一化，以排除质粒DNA污染。人类ACTB基因[GenBank:M28424]被用作参考基因。使用LightCycler®480 Probes Master进行PCR反应，并在LightCyscler®480实时PCR系统（意大利蒙扎罗氏诊断公司）中运行，条件如下：95°C，5分钟；95°C，15秒和60°C，45秒的45次循环。使用含有同种异体构建物的纯化p3XFLAG-CMV™-14连续稀释制备的标准曲线进行绝对定量。

线粒体DNA测序与低异质性检测

如前所述执行整个mtDNA重测序[26]为了验证除m.3571insC外，异种移植物没有累积突变。根据之前针对复杂序列环境（如均聚物）中突变的优化方案，使用荧光PCR（F-PCR）和变性高效液相色谱（DHPLC）测定m.3571insC的突变负荷[27]. 每次分析一式三份。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

在洋地黄碱（50μg/mL）存在下，通过亚细胞分离获得富含线粒体的部分[28]. 如前所述，从30 mg异种移植物中制备总裂解物[15]. 用10%SDS-PAGE分离线粒体蛋白（40μg）或总异种移植物和细胞裂解物（80μg[15].

蛋白质印迹

硝化纤维膜与抗电压依赖性阴离子通道（VDAC）抗体（1:1000，BioVision，美国加利福尼亚州山景城）、ND1（1:1000；a.Lombes，Unite de Recherche INSERM 153，Hospital de la Salpetriere，Paris，France）、HIF-1α抗体（1:100，Bethyl Laboratories，Montgomery，TX，USA）、，LDHA（1:1000，Sigma-Aldrich，米兰，意大利）。使用的二级抗体是过氧化物偶联抗鼠或抗兔（1:2000，英国萨福克Jackson ImmunoResearch）。使用柯达分子成像仪（美国纽约州罗切斯特柯达）获得化学发光信号。考马斯染色作为负荷对照。

复合物I凝胶内活性（CI-IGA）测定

如前所述，用n-十二烷基麦芽糖苷（2.5 g/g蛋白质）溶解富含线粒体的组分（样品制备见SDS-PAGE部分）[29]. 蛋白质（100μg）用4%至13%的蓝色天然梯度凝胶（BN-PAGE）分离，并如前所述检测CI-IGA[30].

北美⁺/NADH比率测定

1.5×10的Aliquotes⁶将细胞清洗并重新悬浮在1mL冰镇PBS中，提取NADH和NAD⁺决心。对于NADH分析，用含有50%（v/v）乙醇和35%（w/v）氯化铯的0.5 M氢氧化钾处理细胞悬浮液，立即在冰上冷却，在4°C下离心以去除不溶性物质，并将上清液（100μL）注入C18柱。对于NAD⁺测定时，用1 M高氯酸处理细胞悬液，立即在冰上冷却，并在4°C下离心以去除不溶物。注射前立即用氢氧化钾中和高氯酸并离心。上清液注入C18柱（100μL）。按所述提取并检测吡啶核苷酸[31]在Kinetex反相C18柱（250×4.6 mm，5μm；Phenomenex，Torrance，CA，USA）上，带有配备可变容量注射器的双泵Waters 510系统.NAD在260 nm下的吸光度⁺在340 nm处，NADH由光电二极管阵列检测器监测（Waters 996）。NADH和NAD⁺通过与标准品的保留时间比较确定峰，并通过与标准物的共洗脱进行确认。与标准曲线相比，通过峰面积测量获得定量。

ATP合成测量

如前所述，在等分的洋地黄素通透性细胞中进行由CI和CII驱动的线粒体ATP合成速率，并根据柠檬酸合成酶（CS）活性进行标准化[32]. 简言之，用5 mM苹果酸+5 mM丙酮酸（CI底物）或10 mM琥珀酸（CII底物）+2μg/mL鱼藤酮培养小份（0.1至0.2 mg蛋白质）。在荧光素/荧光素酶存在下，通过添加0.2 mM ADP开始反应，并使用光度计评估化学发光随时间的变化。添加10μM寡霉素后，用内部ATP标准校准化学发光信号。

耗氧率（OCR）

用XF24细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience，Billerica MA，USA）测量粘附细胞中的OCR。细胞接种在XF24细胞培养微孔板中，接种速度为3×10⁴细胞/孔置于含有4.5 g/L葡萄糖的200μL DMEM中，并在37°C和5%CO中培养₂持续24小时。按照之前的报告进行分析[32]. 数据表示为O的pmoles₂每分钟每3×10⁴细胞。

线粒体膜电位测定

电池（3×10⁵)将其播种在直径24mm的圆形玻璃盖玻片上，并生长2天。线粒体膜电位（ΔΨ_米)如前所述，通过四甲基罗丹明甲基醚（TMRM）的积累进行测量[30]. 使用MetaFluor软件（Universal Imaging Corp.，Downington，PA，USA）采集并分析数据。几个线粒体簇被确定为感兴趣的区域，不含细胞的区域被作为背景。每分钟采集一次连续的数字图像和荧光强度。荧光值是通过从每个时间点对应的线粒体感兴趣区域的背景值中减去背景值而获得的，并表示为T0的百分比（100%）。

软琼脂

在0.33%琼脂糖和0.5%琼脂糖底层中测定锚定非依赖性细胞生长。细胞悬液（2×10⁴细胞）在无或存在1μM二甲基草酰甘氨酸（DMOG）的半固体培养基中培养。7天后，用倒置显微镜（意大利佛罗伦萨尼康仪器公司尼康隔膜）在10倍放大镜下对菌落进行计数。使用柯达分子成像仪（美国纽约州罗切斯特柯达）获得了底片照片和放大倍数。DMOG对HIF-1α稳定性的影响通过western blotting（附加文件1：图S1）。菌落形成能力指数计算为未经处理的OS-93之间的比率^ND1号机组和OS-93细胞，然后用于DMOG处理细胞的归一化。这个t吨-检验用于统计比较。

体内肿瘤生长分析

电池（3×10⁶)悬浮在0.2 mL无菌PBS中，并在4至7周龄的无胸腺Crl:CD-1中皮下注射-福克斯1^{数值/数值}老鼠（裸鼠，从意大利莱科的查尔斯·里弗购买）。实验由博洛尼亚大学机构审查委员会授权，并根据意大利和欧洲指南进行。使用单独标记的处女小鼠（每个实验组10只）。用卡尺评估肿瘤生长；体积计算如下：

其中a=最大肿瘤直径，b=垂直于a的肿瘤直径。

电子显微镜

如前所述，立即收集并处理异种活检[15]. 使用JEM-1011透射电子显微镜（意大利米兰Jeol有限公司）观察样品。

cDNA文库制备及mRNA测序

使用454 GS FLX Titanium平台（Roche Diagnostics，Monza，意大利）进行超深焦磷酸测序。RNA质量通过2100生物分析仪（安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉）进行评估。使用Oligotex mRNA试剂盒（意大利米兰齐根），使用每个样品（5至8μg）的总RNA进行poly（A）mRNA选择。使用随机序列引物将聚（A）富集的RNA样品反转录到cDNA中。根据制造商的说明进行cDNA文库制备和随后的焦磷酸测序（应用200个核苷酸循环）。

RNA-Seq数据分析

获得RNA-seq读取（附加文件2：表S1）由FastQC测试序列质量[33]（附加文件三：图S2）和≥100 bp的基因通过下一代测序映射到hg18/NCBI36注释人类基因组。TRanscriptome配置文件浏览器（NGS-Trex）平台[34]. 允许多重映射以避免来自同源基因的过大截止值（附加文件4; 方法）。如果至少绘制了一个读数，则认为基因已表达。每个基因的原始数字表达读取计数（考虑所有映射的mRNA亚型）用于edgeR的差异表达分析[35]生物导体包装[36]（附加文件4; 方法）。在使用Fisher精确检验进行的统计分析中，仅考虑了所有四个研究样本中至少有一个读取结果的基因。A类P（P）-值≤0.05被用作阈值，以考虑差异表达基因（DE）。生物导体goseq[37]该软件包用于将所有DE基因与基因本体（GO）类别和京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径关联（附加文件4; 方法），而GeneMania服务器[38]通过在多个交互数据库、相关参考文献中进行搜索，用于进行基因网络分析，并仅在每个组中发现的过度表达基因中进行GO类别富集。人工处理HIF-1α通路重建[39-44]来自交互数据库（BioGRID、HPRD、Pathway Commons、GEO数据集）、GeneMania以及HIF-1A型基因输入[45]. 使用R的limma包准备了热图中上调和下调基因的表示[46]，将层次聚类应用于日志₂标准化数字基因表达值（附加文件4; 方法）。如附加文件所示，使用qRT-PCR对RNA-Seq数据进行验证4; 方法。

免疫组织化学分析

如前所述，对CI（意大利米兰Invitrogen）和HIF-1α（美国马萨诸塞州比勒里卡Upstate Biotech）的NDUFB8亚单位抗体进行免疫组织化学（IHC）分析[47]. 染色切片的半定量分析采用100倍放大的光学显微镜进行。根据阳性细胞百分比（范围0-4）和染色强度（范围0-3），使用改良免疫反应评分（IRS）对NDUFB8细胞质免疫染色进行评估[48,49]. 通过组合这两个值（范围0-12）来获得每个样品的最终染色评价。如前所述，使用计算机化、形态计量学、交互式数字图像分析对HIF-1α核免疫染色阳性细胞的数量进行量化[50]. 标记指数表示为切片中标记的核面积占肿瘤细胞总核面积的百分比。

匹莫哒唑染色

动物在处死前3小时腹腔注射60 mg/kg吡莫硝唑（Hypoxyprobe-1 Plus Kit，HPI，Burlington，MA，USA）。如前所述，对异种移植物进行处理并显示荧光[15].

α-KG和SA测量

代谢物α-KG和SA的测量在体外来源于OST-93和OST-93的细胞系^ND1号机组基本上如前所述[15]. 这个t吨-检验用于统计比较。

复合I-活性异体克隆恢复致瘤潜能

为了解决癌细胞生长是否需要CI功能的问题，CC、OS-93和OS-93^ND1号机组测试了它们的独立生长能力。与模拟克隆相比，异位补充的细胞形成了更大、数量明显更多的菌落（图​（图2A-B）。2A-B）。将细胞注射到裸鼠体内以确定其致瘤潜力体内类似于控制，OS-93^ND1号机组-衍生肿瘤（OST-93^ND1号机组)生长明显大于从OS-93细胞（OST-93）衍生的细胞（图​（图2C），2C） 证明CI功能的恢复体内（图​（图2D）2D） 是肿瘤生长所必需的。我们之前已经证明，在存在准胞质m.3571insC突变的情况下，线粒体形态严重紊乱[15]. 事实上，OST-93肿瘤的电子显微照片显示，线粒体较大，基质清晰，嵴几乎完全消失（图​（图2E）。2E） ●●●●。另一方面，OST-93^ND1号机组CC肿瘤表现为大量线粒体，基质较深，嵴正常（图​（图2E），2E） 表明CI功能的恢复与正常线粒体形态的恢复密切相关。这些发现证实了同种异体ND1表达对线粒体的有益影响体内为了排除这种恢复可能是由于异种移植生长过程中发生的基因逆转所致，我们对来自肿瘤的线粒体DNA进行了重新测序，除m.3571insC外，未检测到其他突变。F-PCR也排除了回复基因型的发生（图​（图2F）2F） 和DHPLC分析（附加文件8：图S6）。总的来说，这些数据清楚地表明CI功能是维持肿瘤生长所必需的体内.

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图2

恢复致瘤潜能需要复合I（CI）功能在体外和体内。(A类)对照软琼脂（CC）、OS-93和OS-93中凤尾鱼非依赖性菌落生长的代表性图像^ND1号机组细胞系。(B类)7天后在软琼脂平板上进行菌落计数；数据为平均值±SD（n=3，^*P（P）<0.05). (C类)注射CC、OS-93和OS-93诱导肿瘤生长^ND1号机组裸鼠细胞系。数据为平均值±平均值标准误差（SEM）（n=3，每次实验接种5-10只动物；^*P（P）<0.05;^*CC和OS-93^第1阶段与OS-93相比）。(D类)CC、OST-93和OST-93肿瘤匀浆中CI-in凝胶活性（IGA）测定^ND1号机组肿瘤。显示了三个代表性实验中的一个。(E类)CC、OST-93和OST-93的代表性电子显微照片^ND1号机组肿瘤。星号表示不同的线粒体形态。(F类)OS-93和OS-93中m.3571insC的荧光PCR分析^ND1号机组细胞系和异种移植物（OST）。所有异种移植物与其相应细胞系保持相同的m.3571insC突变负荷（>90%）。

我们接下来讨论ROS的参与，因为它们已被证明对肿瘤生长和转移有积极作用[18,51]. 在没有AA和有AA的情况下测量过氧化氢和超氧化物水平（附加文件4; 方法）、复合物III（CIII）抑制剂和主要的超氧化物诱导剂[17]. 我们之前报道过，由于缺乏两个活性氧产生位点之一，CI-清除细胞可能会产生较少的自由基[14,15]，我们在这里也观察到CC和OS-93以及同种异体OS-93之间的趋势^ND1号机组（附加文件9：图S7A-B），尽管意义不大。此外，在AA治疗后，仅在CC中观察到ROS水平显著增加，而OS-93和OS-93没有增加^ND1号机组细胞。这些发现表明，严重的CI突变可能不允许正常的电子流过复合物和呼吸链的其余部分，即使在存在抑制的CIII的情况下，也无法确保产生自由基所需的最小电子量。在同种异体细胞中，我们未能检测到ROS水平的恢复，这表明完全重新组装的CI数量低于CC细胞，最终我们可以排除ROS在确定同种异体与CI缺乏细胞不同致瘤潜能方面的主要贡献。

全球转录组分析显示HIF-1α调节的同种异体肿瘤Warburg表型

为了剖析依赖CI恢复决定肿瘤生长或停止的分子途径，我们接下来对OST-93和OST-93进行了全局转录组分析^ND1号机组异种移植。我们发现521个DE基因，其中226个在OST-93中上调，296个在OST-93中上调^ND1号机组样品（图​（图3A三A和附加文件2：表S1），折叠变化范围在2.0和13.8之间。OST-93中最重要的GO类别^ND1号机组上调的基因包括翻译装置的激活（附加文件10：表S2）。

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图3

OST-93和OST-93的转录谱^ND1号机组异种移植。(A类)热图显示分析样本中521个差异表达（DE）基因的表达水平。深红色=上调基因；青色=下调基因。（B）Warburg表型的转录谱.热图显示了缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）激活途径中21个DE基因的基因表达谱。基因按对数递减排序₂折叠变化。葡萄糖转运蛋白和糖酵解基因用红色标记。（C）葡萄糖摄取和糖酵解反应。OST-93中过度表达的基因^ND1号机组异种移植物标记为红色。红色圆圈代表葡萄糖分子。（D）对OST-93（n=2）和OST-93的生物复制品进行定量实时PCR验证^ND1号机组在RNA-Seq中发现DE的9/21 HIF-1α应答基因（n=7）(^*P（P）<0.05).

我们之前已经证明，CI缺乏的肿瘤无法通过转录因子HIF-1α的失稳对缺氧作出反应[14,15]. 为了评估HIF-1α应答靶点的参与，我们特别研究了DE基因组中的此类途径。有趣的是，521个基因中有21个是HIF-1α的下游靶点（图​（图3B），三B） ，其中大多数已知在缺氧反应期间过度表达。值得注意的是，HIF-1α反应灵敏国家发改委1,LGALS3型和IGFBP3型，在OST-93中过度表达^ND1号机组肿瘤，是在这里检测到的顶级DE基因之一，错误发现率（FDR）<5%（附加文件2：表S1）。与已知HIF-1α抑制基因靶点的数据一致MCM10型,巴西航空公司1和胎压监测1在OST-93中发现^ND1号机组肿瘤，表明HIF-1α调节通路的整体激活只发生在同种异体移植中（图​（图3B）。三B） ●●●●。在HIF-1α应答基因中，属于糖酵解途径的四个基因簇(PFKP公司,GAPDH公司,PGK1系列和LDHA公司)和两种编码葡萄糖转运蛋白(SLC2A1型,SLC2A3型)在OST-93中显著过度表达^ND1号机组肿瘤（图​（图3B-C）。三B-C）。转录组数据分析表明，与细胞代谢相关的基因没有其他显著差异表达，这表明糖酵解可能是导致CI竞争性癌细胞更高生长能力的主要原因，这表明此类肿瘤中存在Warburg转录谱。转录组数据通过qRT-PCR进行确认和验证（图​（图3D），三D） ，高度相关(R（右）² = 0.91）和RNA-Seq数据（附加文件11：图S8）。