癌症研究。作者手稿；PMC 2015年9月1日提供。
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美国国立卫生研究院：NIHMS610200
Hsp70-Bag3相互作用调节癌相关信号网络
,1,2,* ,2,* ,1 ,三 ,4 ,5 ,6 ,6 ,6 ,6 ,2 ,7 ,7 ,7 ,7 ,8和2
T.A.科尔文
1美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院医学系，邮编02118
2美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系，邮编02118
V.L.加拜
2美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系，邮编02118
J.龚
1美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院医学系，邮编02118
S.K.考尔德伍德
三美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院Beth Israel女执事医学中心分子和细胞放射肿瘤学
H.李
4美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所分子药理学和实验治疗学系个体化医学中心，55905
S.古姆鲁鲁
5美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院微生物系，邮编02118
O.N Matchuk公司
6俄罗斯奥宾斯克医学放射研究中心，249036
S.G斯米尔诺娃
6俄罗斯奥宾斯克医学放射研究中心，249036
N.V奥尔洛娃
6俄罗斯奥宾斯克医学放射研究中心，249036
I.扎穆拉埃娃
6俄罗斯奥宾斯克医学放射研究中心，249036
M.加西亚-马尔科斯
2美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系，邮编02118
X.李
7加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经变性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158，美国
Z.T.扬
7加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经变性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158，美国
J.N.劳赫
7美国加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学药物化学系和神经退行性疾病研究所，94158
杰斯特威基（J.E.Gestwicki）
7加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经变性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158，美国
S.Takayama公司
8美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院病理学系，邮编02118
M.Y.谢尔曼
2波士顿大学医学院生物化学系，波士顿，MA 02118，美国
1美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院医学系，邮编02118
2美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院生物化学系，邮编02118
三美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院Beth Israel女执事医学中心分子和细胞放射肿瘤学
4美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所分子药理学和实验治疗学系个体化医学中心，55905
5美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院微生物系，邮编02118
6俄罗斯奥宾斯克医学放射研究中心，249036
7加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经变性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158，美国
8美国马萨诸塞州波士顿市波士顿大学医学院病理学系，邮编02118
*作者贡献均等
- 补充资料
1
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2
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三。
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7
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摘要
Bag3是热休克蛋白Hsp70的核苷酸交换因子，与细胞信号传导有关。这里我们报道Bag3与Src的SH3结构域相互作用，从而介导Hsp70对Src信号传导的影响。通过几种互补方法，我们确定Hsp70-Bag3模块是癌细胞信号传导的广泛作用调节器，包括通过调节转录因子NF-kB、FoxM1和Hif1α、翻译调节器HuR、细胞周期调节器p21和survivin的活性。我们还发现了一种破坏Hsp70-Bag3相互作用的小分子抑制剂YM-1。YM-1反映了Hsp70缺失对这些信号通路的影响，体内注射该药物足以抑制小鼠肿瘤生长。总的来说，我们的结果将Bag3定义为Hsp70调制信号的关键因子，并提供了一个临床前证据，即Hsp70-Bag3复合物可能提供一个诱人的抗癌靶点。
介绍
主要的热休克蛋白Hsp70（HspA1A）也与癌症有关。Hsp70是一种应激诱导的分子伴侣，参与保护蛋白质组免受聚集，促进受损多肽的折叠和降解(1,2). 这种蛋白的水平在多种癌症中高度升高，并与肿瘤分级、转移、化疗抵抗以及随后的不良预后相关，表明Hsp70在癌症中起着特殊作用(三,4). 重要的是，虽然Hsp70对癌细胞的生存至关重要，但它对非转化细胞的生存能力却是不可或缺的(5). 因此，Hsp70基因敲除小鼠是健康的(6)Hsp70的失活只在受到应激的挑战后才表现出严重的问题(6,7)或急性炎症(8).
为了将这些观察结果应用到治疗中，一些小组已经探索了癌细胞对Hsp70上瘾的机制。在肿瘤发生的过程中，细胞必须逃避凋亡(9)，无吻(10)以及肿瘤微环境的恶劣条件(11). 尽管Hsp70水平升高具有较强的抗凋亡活性(12,13)目前尚不清楚这种功能对其在癌症中的作用是否重要。
与细胞凋亡不同，Hsp70抑制细胞衰老的发现与癌症有着明确的联系。衰老被定义为与形态和基因表达的各种细胞变化相关的不可逆细胞生长停滞(14,15). 某些致癌基因可能会触发衰老，即致癌诱导衰老（OIS），从而提供抗癌保护。我们已经证明，Hsp70的缺失会激活由致癌基因Her2、PIK3CA和RAS转化的细胞的衰老，但对正常细胞的影响很小(16,17). 因此，Hsp70基因敲除小鼠在Her2癌基因表达后不会发生乳腺癌(5). 因此，Hsp70可能对转化细胞从OIS中逃逸至关重要，这一特性决定了其在肿瘤发生中的作用。
Hsp70的这些特性表明它可以用作药物靶点。已经有几次尝试开发用于癌症治疗的Hsp70抑制剂，包括底物结合抑制剂，例如适体(18)或吡氟菊酯μ(19–22)，或与ATP酶域相互作用的化合物，如VER155008(23)，MAL3–101(24)和YK-5(25). 然而，这些抑制剂的开发尚未达到临床试验阶段。
为了使抑制剂的发展适应癌症，应该确定Hsp70对肿瘤发展影响的具体机制。为了寻找这些机制，我们将重点放在核苷酸交换因子Bag3上。该蛋白包含Bag结构域，该结构域与Hsp70蛋白ATP酶结构域中的基序结合(26)以及PxxP和WW域(26)，可能将其连接到信号蛋白的SH3结构域和PPxY基序(27,28). Bag3与大细胞自噬和攻击性形成有关(29–31). 在这两个过程中，Bag3被提议将Hsp70与蛋白质聚集体的复合物连接到自噬和攻击机制。虽然尚不清楚Bag3如何与后者相互作用，但在自噬过程中，Bag3利用其WW域与自噬空泡SYNPO2的组织者之一相互作用(30). 除了在招募Hsp70结合的货物方面的功能外，还证明Bag3可以通过其PxxP基序与信号因子相互作用（例如与PLCγ）(32)或WW结构域（例如，具有Hippo通路LATS1和AMOT1的成分）(30). 自从Bag3与癌细胞运动和侵袭有关以来(33–35)，这些效应可能是由Bag3对信号通路的调节引起的。有趣的是，在之前的研究中，Bag3对信号传导的影响与Hsp70对这些途径的影响无关。在这里，我们假设Bag3可以作为一种支架，具有整合Hsp70水平和多种癌症信号通路的潜力，从而介导Hsp70对癌症的影响。
材料和方法
细胞培养
MCF10A、HEK293、MCF-7、HCT116、B16-F10和HeLa来自ATCC，收到后最初冷冻储存。ATCC使用短串联重复分析鉴定其细胞系。在实验期间，细胞被复苏并传代不到6个月。表达PIK3CA或Her2的MCF10A细胞如前所述(5,16,17). MCF10A细胞在添加有5%马血清、氢化可的松（500 ng/ml）、胰岛素（10µg/ml）、霍乱毒素（100 ng/ml）和表皮生长因子（20 ng/ml。HEK293T细胞保存在补充10%热灭活胎牛血清（FBS）的DMEM中。B16-F10、MCF7和HeLa细胞在添加10%FBS的Dulbecco改良Eagle’s培养基中培养。HCT116细胞在添加10%FBS的McCoy’s 5A培养基中进行培养。所有培养物均含有1%青霉素/链霉素。
小鼠和异种移植物
对于异种移植物，500000个MCF7细胞与Matrigel以1:1的比例混合，并将100万个细胞注射到6周龄雌性NCR裸鼠（Taconic）的皮下。对于B16-F10黑色素瘤同种异体移植，在6周龄C57BL6雌性小鼠的后腿皮下注射200000个细胞。每隔一天用卡尺监测肿瘤生长，并根据公式计算L（左）×W公司2×π/6，其中L（左）是长度和W公司是宽度。
化合物和抗体
MG132购自Biomol（Farmingdale，NY），嘌呤霉素购自Sigma。YM-1由Gestwicki博士开发和提供。使用了以下抗体：抗Hsp70来自Stressgen，抗Bag3来自Takayama博士的礼物，抗p21和抗Hif1α来自BD PharMingen，抗-β-肌动蛋白，抗Src，抗p-Src（Tyr416），p-NFkB（Ser536），抗IκBα，对帕罗西汀（Tyr118），p-p130Cas（Tyr165，Tyr249，Tyr410），p130Cas来自Cell Signaling，抗FoxM1，抗HuR，抗生存素和抗Src来自圣克鲁斯。
结果
Bag3介导Hsp70对Src活性的影响
为了揭示Bag3在癌症中的作用及其与Hsp70的关系，我们试图确定可与Bag3的PxxP基序相互作用的SH3域信号因子。因此，我们使用融合到GST的各种蛋白质的一系列重组SH3结构域进行了下拉实验。使用缺乏SH3结构域的GST-CD40作为阴性对照。含有体外翻译S的裂解液35-将标记的Bag3传递到携带各种SH3-GST融合蛋白的珠上，并检测到结合的Bag3。在下拉实验中，Bag3与PLCγ、Src、c-Abl、c-Grap、Nck、Crk、RasGAP、n-Grab2和c-Grab2的SH3域相互作用(). 这些蛋白质是癌症相关通路的组成部分，突出了Bag3作为癌症信号主调节器的潜力。尽管这些信号蛋白中的任何一种都可能有助于癌症的发展，但为了探索Bag3如何调节信号，我们选择Src作为模型。
Bag3与Src相互作用，这种相互作用受Hsp70调节（a） Bag3与各种蛋白质的SH3结构域的相互作用，见结果。（b） 左幅：Bag3与全长Src在293T细胞中共免疫沉淀。该细胞系中Src丰度相对较低，导致IP和FLAG标记Bag3的Src过度表达。转染24小时后收集细胞并进行裂解。阴性对照组仅包括GFP（对照组）或Src（-FL-Bag3）。中间车道FL-Bag3表达FLAG-tagged Bag3和Src。IP使用FLAG抗体进行，印迹处理为trueblot二级抗体。右侧面板：HeLa细胞中全长Src与FLAG标记的Bag3共免疫沉淀。细胞转染FL-Bag3或GFP（对照），并使用FLAG抗体进行免疫沉淀。还显示了与Hsp70的关联（上部带用箭头表示）；下带是IgG重链。（c） 本研究中使用的Bag3结构示意图，包括野生型（FL）、Bag域缺失（ΔB）、Bag-域点突变（R480A）和PxxP域缺失（△PxxP）。所有构造都包含N端子FLAG标记。结构域包括Bag结构域（Hsp70结合域）、PxxP基序、M结构域（小热休克蛋白结合域）和WW结构域。（d） 用FLAG-tagged Bag3构建物共免疫沉淀Hsp70。用GFP（对照）或指示的Bag3构建物转染HeLa细胞，并用抗FLAG抗体进行免疫沉淀。Hsp70是箭头指示的上带。Hsp70 IP印迹的大的下带是IgG重链。（e） 带有Src SH3域的Bag3构造的GST下拉。用指示的构建物转染HeLa细胞，24小时后，制备细胞裂解物，并用纯化的GST-SH3结构域（来自Src）与琼脂糖珠或GST珠单独结合培养4小时。通过抗FLAG抗体免疫印迹分析与Src SH3结构域相关的Bag3。
首先，我们确认全长Src蛋白与细胞内的Bag3相互作用。在293T细胞中，FLAG标记的Bag3与Src共表达，用抗FLAG抗体沉淀，用抗Src抗体在印迹上探测Src。（左面板）显示Src与Bag3有效关联。在HeLa细胞中进行了类似的实验，以检测Bag3与内源性Src的关联(，右侧面板）。
由于Bag3是Hsp70的辅因子，我们进一步评估了与Hsp70相互作用的能力如何影响Bag3与Src的SH3结构域的关联。表达Bag3的各种结构体，将细胞裂解物与携带重组Src SH3结构域的珠培养，并通过免疫印迹检测结合的Bag3分子。除了全长Bag3构建体外，我们还测试了PxxP和Bag结构域（分别称为FL、ΔPxxP和ΔB）的缺失，以及R480A突变，该突变削弱了Bag3与Hsp70的结合(39) (). 下拉实验证实了ΔB和R480A结构体不能与Hsp70结合(). 全长Bag3与Src的SH3结构域有效地相互作用，正如预期的那样，PxxP结构域的删除大大降低了结合(). 重要的是，与全长Bag3相比，ΔB和R480A结构体还显示与Src-SH3结构域的结合减少，这些突变的效果与PxxP缺失的效果相当(). 因此，与Hsp70的相互作用似乎对Bag3的PxxP结构域与Src的SH3结构域的结合至关重要。
这些发现表明，Bag3与Src的相互作用需要与Hsp70结合，这表明Bag3可能充当支架，介导Hsp70对包括Src在内的信号通路的影响。根据这一假设，通过其Y416磷酸化判断，Hsp70的敲低导致Src的显著激活(). 此外，Hsp70的缺失增加了下游Src靶点paxillin和p130Cas的磷酸化()，确认Src激活。有趣的是，Bag3的敲除并没有激活Src，但它阻止了Hsp70耗尽后Src的激活(). 因此，（i）Hsp70可以调节Src活性，（ii）该调节需要Bag3。
Hsp70影响细胞中Src激活a） Hsp70缺失以Bag3依赖方式激活Src。MCF7细胞被对照、shHsp70、shBag3或双shHsp70/shBag3逆转录病毒感染，并对激活的Src（p-Y416）进行免疫印迹。p-Src印迹下的值表示与对照组相比的相对磷酸化。将p-Src和总Src水平归一化为β-actin，并报告归一化p-Src/Src的比率。（b） shHsp70和shBag3对下游Src靶点的影响。细胞在裂解前用1mmol/L原钒酸钠处理30分钟。与以类似于p-Src的方式测定的对照相比，p-Paxillin和p-130Cas下的值代表相对磷酸化。（c） 不能结合Hsp70的Bag3突变体的表达导致Src的激活。Bag3构建物或GFP转染HeLa或MCF7细胞。24小时后对细胞进行裂解，并对活化的Src（p-Y416）进行免疫印迹。显示了每个细胞系的两个实验的代表性斑点。
为了进一步研究Hsp70-Bag3模块在Src调节中的作用，我们测试了无法结合Hsp70的Bag3突变体对Src的影响。虽然全长Bag3的过度表达并不影响Src活性，但ΔB或R480A结构的过度表达可显著激活HeLa或MCF7细胞中的内源性Src()，进一步支持该模型。
Hsp70-Bag3模块影响NF-kB
在建立了Hsp70和Bag3可以在直接调节信号因子方面合作的一般机制原理后，我们进一步寻求确定由Hsp70-Bag3模块调节的癌控信号因子谱。我们使用了两个通用标准的组合来进行这种调节：信号因子应该受到（i）Hsp70和Bag3耗竭的影响，以及（ii）ΔB或R480A Bag3结构的过度表达而非正常Bag3的影响。
在这项研究中，我们利用了我们之前的数据，其中我们使用微阵列分析来比较对照组和Hsp70缺失的MCF7细胞中的基因表达(补充表S1)然后是基因集富集分析（GSEA）。基于GSEA的信号通路分析软件由布罗德研究所开发。根据他们的手册，显示错误发现率（FDR）小于0.25的路径非常重要，足以保证验证。我们的分析表明，Hsp70可上调或下调大量通路。例如，蛋白酶体和泛素途径被强烈上调，得分最高（参见补充图S1a). 另一个得分较高的途径是NF-kB()和相关途径，如IL-1R或TNF途径(补充图S1b). 事实上，使用NF-kB控制下的荧光素酶报告子，我们证实了Hsp70缺失细胞中NF-kB活性增加(). 此外，IκB水平降低，而NF-kB p65亚单位的磷酸化升高().
Hsp70缺失影响多种信号通路（a） Hsp70缺失激活NF-kB通路。GSEA RelA途径富集图。NES-标准化富集分数。FDR-错误发现率。（b） Hsp70对NF-kB的影响取决于Bag3。如图所示，MCF7细胞感染了Rel-A荧光素酶慢病毒报告子，随后感染了shBag3、shHsp70或空载体控制逆转录病毒。测定荧光素酶活性水平并将其归一化为GFP。结果显示为三次试验的平均值和±SEM。Hsp70和Bag3的双重消耗结果是重复实验的平均值和±SEM。（c） 通过免疫印迹分析Hsp70或Bag3缺失对MCF7细胞NF-κB通路成员的影响。P-p65是P-NF-κBp65-Ser536。（d） Hsp70和Bag3对MCF7细胞中癌症相关通路的影响。用DFO（100µmol/L，4h）或MG132（5µmol/L，4h）处理部分细胞。印迹是三次重复实验的代表。（e） shHsp70和shBag3对逆转录病毒感染后第6天HeLa细胞通路的影响。在第7天观察到对p21的影响。印迹是来自三次重复实验的示例。（f） 不能结合Hsp70的Bag3突变体的表达导致survivin、FoxM1和Hur的失活。将Bag3构建物转染到HeLa细胞中，48小时后，对细胞进行裂解和免疫印迹，以获取指示蛋白。印迹是一式三份实验的代表。（g） 如前所述，测定上清液中的VEGF水平(39).
在这里，我们测试了Bag3是否参与Hsp70对NF-kB的调节。因此，使用shRNA去除MCF7细胞中的Bag3，并使用荧光素酶报告物评估NF-kB的活性。与Hsp70不同，Bag3的缺失对NF-kB的活化几乎没有明显影响()磷酸化NF-kB p65亚单位（p-S536）和IκB的水平(). 另一方面，在Bag3缺失的细胞中，Hsp70敲低激活NF-kB的能力显著降低(). 因此，与Src调节一样，Hsp70-Bag3模块对NF-kB调节至关重要。
值得注意的是，之前有报道称Bag3通过控制IKKγ稳定性来调节NF-kB(40)，但我们无法检测到Bag3缺失后IKKγ水平的任何变化(). 另一方面，最近的蛋白质组学研究(41)表明Bag3可以直接与IkB相互作用，这与我们的发现一致，即Hsp70-Bag3模块影响IkB水平().
Hsp70-Bag3模块对其他肿瘤相关信号因子的影响
由于GSEA的无偏见方法仅产生了关于Hsp70-Bag3模块调节的信号网络的有限信息，因此在进一步搜索该模块调节的因素时，我们使用了基于我们先前发现中获得的提示的更具偏见的方法。因此，我们决定测试先前鉴定的Hsp70控制的信号传导因子的调节是否也涉及Bag3。在癌基因诱导衰老和肿瘤发生的研究中，我们报道了Hsp70的缺失会影响控制癌细胞生长的两种重要信号蛋白，即细胞周期抑制剂p21和有丝分裂调节因子survivin(5,17). 为了测试Bag3是否也参与这些因素的控制，我们使用shRNA研究了MCF7中Bag3的缺失是否影响p21和survivin的水平。与Hsp70的敲除一样，Bag3靶向导致survivin水平降低，p21积累(，上部面板）。在HeLa细胞中也观察到Hsp70和Bag3缺失的类似作用()和结直肠癌细胞系HCT116(补充图2)表明这些效应与多种癌症类型有关。Bag3缺失与Hsp70敲除在所有三种细胞系中的作用类似，进一步支持了Hsp70和Bag3是这些途径的共同调节器的观点。根据这一建议，HeLa细胞中ΔB和R480A Bag3突变体而非正常Bag3的过度表达模拟了Hsp70缺失对survivin的影响(). 在这个实验中，我们无法评估Bag3突变体对p21的影响，因为在HeLa细胞中检测不到这种蛋白的水平。
由于p21和survivin都有一个共同的转录调节因子FoxM1，我们测试了Hsp70-Bag3模块是否可以控制这种癌症调节因子。事实上，Hsp70或Bag3的耗竭导致FoxM1的强烈下调(，上部面板）及其独特下游靶点细胞周期抑制剂p27的上调(42). 此外，在正常Bag3和空载体控制条件下，虽然FoxM1的水平没有改变，但ΔB或R480A Bag3突变体导致FoxM2的强烈下调()表明Hsp70-Bag3相互作用在该主要转录因子表达中的重要性。由于FoxM1在OIS、转移和侵袭中发挥多重作用(43)这些发现进一步支持了Hsp70-Bag3模块在肿瘤发生中的广泛作用。
基于我们之前的研究，该研究将应激反应与转化因子HuR联系起来，HuR是癌症发展的另一个主要因素(36,44)，我们还建议Hsp70-Bag3模块可能影响该途径。Hsp70或Bag3的耗竭导致HuR的显著下调(，上部面板）。此外，虽然HuR水平在正常Bag3和空载体控制条件下没有改变，但ΔB或R480A Bag3突变体导致HuR的强烈下调，表明Hsp70和Bag3之间的相互作用对于调节这一主要的癌症调节因子很重要(). 此外，我们考虑了HuR的一个翻译靶点Hif1α是否也下调，Hif1是另一个参与癌症的主要转录因子。由于Hif1α的水平取决于氧气的可用性，对照组，Hsp70耗竭和Bag3耗竭的细胞用缺氧模拟去铁胺（DFO）或蛋白酶体抑制剂MG-132处理，这两种抑制剂都能稳定Hif1α。与对照细胞相比，Hsp70缺失或Bag3缺失的MCF7细胞的Hif1α水平显著降低(，下部面板）。此外，Hsp70缺失强烈降低了主要Hif1下游靶基因VEGF的表达(). 因此，似乎控制癌症发展中多个过程的整个信号网络，包括生长、侵袭和血管生成，涉及HuR、Hif1α和VEGF，受Bag3和Hsp70调节。值得注意的是，只有通过Src，我们才从生化角度确定与Hsp70-Bag3模块的直接联系。与其他途径相比，遗传数据并没有建立直接的相互作用，因此这些相互作用可以由其他因子介导，这些因子可以与Bag3上的WW或PxxP基序结合。
总之，Hsp70-Bag3模块参与调节复杂的通路网络，包括Src、NF-kB、FoxM1、survivin、p21、p27、HuR、Hif1α和最可能的其他通路，所有这些通路都在癌症发展中发挥作用。当单独考虑时，这些途径可能具有促进癌症或抑制癌症的作用。然而，我们知道在乳腺癌模型中，Hsp70的缺失会抑制肿瘤的发生和发展(5)，表明该复杂Hsp70-Bag3控制的信令网络的净结果是致癌的。
小分子对Hsp70-Bag3复合物的破坏模拟了Hsp70缺失对信号传导和癌症的影响
在这里，我们预测阻断Hsp70和Bag3之间的相互作用可以模拟Hsp70的耗竭，并具有抗癌作用。我们重点研究了一种名为YM-1的Hsp70抑制剂(45,46). 为了测试YM-1是否会破坏Hsp70-Bag3相互作用，我们将Hsp70固定在小球上，并使用流式细胞术蛋白相互作用分析（FCPIA）测量其与荧光标记Bag3的结合。YM-1强烈抑制Hsp70和Bag3（IC）之间的相互作用50~5µmol/L；). 这种活性与YM-1在Hsp70中结合保守变构口袋的能力一致，该口袋将伴侣蛋白限制在与Bag3亲和力较弱的ADP结合形式中(45,46). 为了测试YM-1是否能破坏细胞内的Hsp70-Bag3相互作用，从经YM-1或载体对照处理的HeLa细胞中免疫沉淀Hsp70，并对Bag3进行免疫印迹。YM-1几乎完全阻断了细胞内Hsp70与Bag3的结合()这表明YM-1是一种很好的化学探针，可以解决Hsp70-Bag3相互作用在癌症信号传递中的重要性。
YM-1抑制Hsp70-Bag3相互作用并模拟Hsp70缺失对信号传导的影响（a） YM-1通过FCPIA干扰Hsp70-Bag3相互作用。实验一式三份，归一化和合并；误差条代表平均值的标准误差。（b） YM-1（5µmol/L，持续2小时）干扰细胞中的Hsp70-Bag3相互作用。从HeLa细胞裂解物中共免疫沉淀Hsp70和Bag3表明YM-1抑制Hsp70-Bag3复合物的形成。（c） YM-1对MCF7细胞活力的影响。将细胞与指定浓度的YM-1孵育48小时，并通过MTT测定法评估生存能力。（d） YM-1模拟了Hsp70缺失对信号通路的影响。左图：用YM-1（5µmol/L）处理Hela细胞48小时，并通过免疫印迹分析细胞裂解液中信号通路指示成分的水平。上中面板：用YM-1处理的HeLa细胞在裂解前也用DFO（100µmol/L）处理，以观察对Hif1的影响。在DFO（100µmol/L）的存在下用YM-1（10µmol/L）处理中下层MCF7细胞，然后裂解以评估Hif1的水平。右侧面板：经YM-1处理的MCF7细胞（10µmol/L，48 h）
接下来，用YM-1处理MCF7和HeLa细胞，并评估信号通路的活性。为了确定合适的剂量，测试了一系列浓度(补充图3). 图例中描述了用于测试信号通路影响的YM-1浓度，但表示在适当的细胞系中观察效果所需的最小剂量。正如预测的那样，YM-1减少了FoxM1和Hif1α途径，同时激活了Src()，进一步支持Hsp70-Bag3相互作用在癌症信号中的作用。作为对该模型的进一步测试，我们检测了小分子抑制剂杨梅素（myricetin）的作用，该抑制剂通过与Hsp40家族共伴侣有关的不同机制抑制Hsp70(47)，并且不会阻碍Bag3与Hsp70的绑定。与YM-1不同，杨梅素对信号通路没有显著影响()，强调了Hsp70-Bag3相互作用的具体作用。
| shHsp70型 | YM-1型 | 杨梅素 |
|---|
| 福克斯M1 | ↓ | ↓ | - |
| 第21页 | ↑ | ↑ | - |
| HuR公司 | ↓ | ↓ | - |
| Hif1型 | ↓ | ↓ | - |
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由于许多Hsp70-Bag3调节的途径影响细胞生长和存活，Hsp70的缺失对癌细胞有害，特别是由于癌基因信号(5)，我们比较了YM-1对非转化的MCF10A人乳腺上皮细胞和用Her2或PIK3CA癌基因转化的MCF1 0A衍生物活性的影响(). 在这里，表达癌基因的细胞比未转化的MCF10A细胞对YM-1更敏感().
YM-1抑制肿瘤生长（a） 癌基因表达细胞比未转化细胞对YM-1更敏感。MTS分析显示YM-1对野生型（对照）或转化MCF10A细胞活力的影响。显示了三次试验的平均值和±SEM。*p<0.05（b）顶面板：YM-1对MCF7异种移植物生长的影响。裸鼠后肢两侧皮下注射基质凝胶中的MCF7细胞。一旦发现肿瘤，随机选择小鼠，每隔一天注射一次生理盐水（对照组：n=7只小鼠）或YM-1（25mg/kg；n=7小鼠），连续三天。曲线图显示了对照肿瘤（12个肿瘤/7只小鼠，用生理盐水治疗；两个肿瘤没有服用）和YM-1治疗的肿瘤（14个瘤/7只鼠，用YM-1处理）随时间的增长。实线是控制肿瘤。虚线经过YM-1处理。误差线指定±SEM。**p＜0.001。底部面板：YM-1对B16-F10黑色素瘤生长的影响。注射黑色素瘤细胞后第7天，随机选择小鼠，每隔一天注射一次生理盐水（对照组：n=7只小鼠）或YM-1（25mg/kg；n=8只小鼠）三次。使用卡尺测量肿瘤并计算体积。图中显示了对照肿瘤和用YM-1治疗的肿瘤随时间的增长情况。实线是控制肿瘤。虚线经过YM-1处理。显示平均值±SEM。***经Student t检验，p<0.01。（c） 最后一次注射后，取上述小鼠的两个对照组和两个YM1治疗的MCF7肿瘤，通过免疫印迹分析其对FoxM1通路的影响。（d） 与（c）相同，但采用免疫组织化学方法进行分析。
测试YM-1的效果体内，我们使用MCF7细胞的异种移植模型，我们之前已经证明，当Hsp70耗尽时，MCF7失去了发展肿瘤的能力(5). 将MCF7细胞皮下移植到裸鼠体内，当肿瘤达到可触及阶段时，向动物腹腔注射25mg/kg YM-1或生理盐水。每二天注射三次，并用卡尺监测肿瘤生长。结果表明，服用YM-1可显著抑制肿瘤生长。在有效剂量下，该药物对动物的健康和活力没有明显影响。事实上，由于肿瘤负担较低，它们比未经治疗的动物更加警觉。该药物对肿瘤生长的抑制与FoxM1的抑制、survivin的下调和p21的诱导密切相关(,补充图S4). 由于在幼稚或YM-1治疗的动物中均未检测到Hif1的水平，因此无法在本实验中评估Hif1α途径。我们还测试了YM-1对B16黑色素瘤细胞移植瘤这一独特肿瘤模型的作用。将B16细胞皮下移植到裸鼠体内，并在移植后第7天（图中显示的第0天（右面板），动物腹腔注射25mg/kg YM-1或生理盐水。每二天注射三次，并用卡尺监测肿瘤生长。如上所示，服用YM-1显著降低肿瘤生长。因此，YM-1在动物中表现出可预测的反应，这与强烈抑制两种不同肿瘤类型的生长有关，正常组织毒性最小。
讨论
在这里，我们研究了Hsp70调控癌症信号的潜在机制。我们特别关注Bag3，它是Bag家族蛋白的成员，在Hsp70核苷酸交换中起作用。先前的报告确定了重点，即Bag3可以通过其PxxP和WW域与信号分子相互作用。换句话说，通过其Bag结构域Bag3可以通过控制ADP/ATP交换来调节Hsp70的伴侣活性，并且通过PxxP和WW基序也可以调节重要信号通路的活性。因此，Bag3可能能够将Hsp70伴侣网络与信号通路网络整合。使用生物化学和遗传方法，我们证明Hsp70在信号调节中的作用是由Bag3介导的。令人惊讶的是，虽然Bag3的耗竭对某些信号通路的影响与Hsp70的耗竭相似（例如在FoxM1或Hif1上），但在其他情况下，Bag3耗竭并不影响信号传导，而是Hsp70效应所必需的（例如在NF-kB或Src上）。因此，在Bag3-Hsp70对信号通路的控制中，每个单独的靶点都可能受到特定的调控机制的影响。虽然还需要更多的工作，但我们认为这些差异可能与信号模块与Bag3交互的特定方式有关。例如，虽然Src的Bag3调节是由PxxP结构域介导的，但与其他途径的相互作用可能是通过WW或M结构域。
我们采用了几种无偏见和有偏见的方法来剖析由Hsp70-Bag3模块调节的癌症相关通路。我们观察到，Hsp70-Bag3控制参与癌症发展的多种信号因子的活性。这些因子的数量相对较大，与Hsp70在癌症中的广泛“中枢”作用一致。我们验证了这些途径的子集，发现Hsp70耗竭下调Hif1和FoxM1，同时上调NF-κB途径。有趣的是，前者的作用可能是抗癌的，而后者可能是致癌的。这些对相同刺激的不同反应并不令人惊讶，因为在其他抗癌治疗中也观察到了类似的现象。例如，辐射会触发抗癌p53途径，也会触发致癌NF-κB和c-Abl(48,49). 在这种情况下，以及在Hsp70缺失的情况下，净效应是抗癌的。
此前，Hsp70敲除被证明通过抑制OIS来阻止Her2阳性肿瘤在小鼠模型中的发展(5)表明Hsp70在肿瘤发展的早期阶段起着重要作用。我们的研究发现，Hsp70-Bag3模块影响调节血管生成和侵袭的途径（例如Hif1或FoxM1），这表明Hsp70可能在癌症发展中发挥更广泛的作用。虽然有报道称Hsp70在低度恶性肿瘤中水平升高(50)奇怪的是，在高级别癌症中，Hsp70的水平进一步升高(三,4)与Hsp70在癌症进展后期（如侵袭）中的独特作用一致。
总的来说，这项工作指出了Hsp70-Bag3复合物在癌症中的关键作用，并表明这对复合物可能是一个有前途的药物靶点。在现有的热休克蛋白70抑制剂中，YM-1是一种独特的探针，因为它能特异性地捕获ADP-结合形式的热休克肽70(45). 这些观察结果表明，YM-1可能会阻断Hsp70-Bag3的相互作用，因为Bag3对结合ADP的Hsp70形式的亲和力较弱，并且通常有利于客户发布（Gestwicki，手稿编制中）。因此，尽管YM-1的已知结合位点距离Hsp70和Bag3之间的接触表面超过20º，但YM-1对Hsp70的变构调节可能会中断NEF结合。因此，YM-1的作用机制在已知的Hsp70抑制剂中是独特的，它可以使癌细胞中的Hsp70-Bag3活性不稳定，从而抑制致癌信号通路。YM-1在细胞和异种移植模型中具有抗癌活性。这些结果证实了Hsp70-Bag3复合物是一个潜在的抗癌靶点。
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