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J签证费用。2014; (87): 51209.
2014年5月7日在线发布。 数字对象标识：10.3791/51209
预防性维修识别码：项目经理4173806
PMID：24837791

评估基因毒性应激后小鼠发育脑内神经干和祖细胞的细胞周期进展

奥利维尔·艾蒂安,1,2,三,4 阿曼丁·贝利,1,2,三,4 特尔马·罗克,1,2,三,4 Chantal Desmaze公司,1,2,三,4和弗朗索瓦·D·布桑1,2,三,4
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

大脑皮层的神经元是在大脑发育过程中由不同类型的神经干和祖细胞（NSPC）生成的，它们在胚胎大脑的侧脑室中形成假复层上皮。基因毒性应激，如电离辐射，对发育中的大脑具有高度有害影响，这与NSPC的高度敏感性有关。有关细胞和分子机制的阐明取决于这些特定类型细胞的DNA损伤反应的特征，这需要一种准确的方法来确定NSPC在受损组织细胞周期中的进展。这里展示了一种方法，该方法基于对怀孕小鼠连续腹腔注射EdU和BrdU，并在胚胎脑冠状切片中进一步检测这两种胸腺嘧啶类似物。EdU和BrdU均在S期并入复制细胞的DNA中，并通过两种不同的技术（分别为叠氮化物或特定抗体）进行检测，这有助于它们的同时检测。然后根据每个NSPC核与端脑背侧标准区域中心室边缘的距离来确定每个NSPC核的EdU和BrdU染色。因此，这种双重标记技术可以区分通过细胞周期进展的细胞和那些激活细胞周期检查点导致细胞周期停滞以应对DNA损伤的细胞。

给出了一个实验实例，其中辐照前注入EdU，辐照后立即注入BrdU，并在辐照后4小时内进行分析。该方案提供了对NSPC急性DNA损伤反应的准确分析，分析了NSPC在受到辐射的细胞周期阶段的功能。这种方法很容易转座到许多其他系统，以确定特定治疗对活组织中细胞周期进展的影响。

关键词：神经科学，第87期，英国教育大学，子宫内辐射、神经干和祖细胞、细胞周期、胚胎皮层、免疫染色、细胞周期检查点、凋亡、基因毒性应激、胚胎小鼠大脑

下载视频文件。（27M，mp4）

介绍

在胚胎脑发育期间，大脑皮层的投射神经元在脑室区生成，脑室区是一种假复层上皮，由排列在侧脑室的不同类型的神经干和祖细胞（NSPC）组成。在NSPC中，作为神经干细胞的放射状胶质细胞（RGC）进行动力间核迁移（INM）：它们在心室表面进行有丝分裂，在心室区基底界（VZ）进行S期1,2,3它们可以对称分裂产生两个RGC，也可以不对称分裂产生一个RGC和一个神经元或中间祖细胞（IPC）4,5.IPC迁移到上覆的增殖层，称为室下区（SVZ），在最后一次对称分裂后，它们生成两个不成熟的投射神经元6-8与RGC相反，IPC不进行INM（在9). 新产生的神经元沿着径向纤维径向迁移，穿过中间区（IZ），到达皮层板（CP）的最终目的地10,8所有这些活动的完美时机对于大脑皮层的正确发育至关重要。例如，神经祖细胞群体从增殖到分化的转变受G1期持续时间的控制11,12G1期延长与细胞分化相关。

基因毒性应激，如电离辐射，严重损害大脑发育（参见13). 我们和其他人已经证明，NSPC极易发生辐射诱导的凋亡14,15,16电离辐射导致DNA双链断裂，这是对增殖细胞最严重的损伤。循环细胞中DNA损伤反应（DDR）的一个重要组成部分是在G1/S或G2/M转换或S期（S内检查点）激活细胞周期检查点17-21它们阻止细胞周期的进展，为DNA损伤修复或消除过度损伤的细胞提供时间。因此，细胞死亡和延迟的细胞周期进展可能会改变大脑发育，以应对电离辐射暴露22-24因此，开发一种方法来评估受照射小鼠胚胎脑中NSPC细胞周期检查点的激活是很有意思的。

通过掺入胸腺嘧啶类似物5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU），常规跟踪细胞周期的进展。BrdU在细胞周期的S期合并，此时DNA正在复制。使用针对BrdU的抗体可以检测到BrdU脉冲期间处于S期的细胞。

用荧光叠氮化物检测新型胸腺嘧啶类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。检测EdU和BrdU的不同方法没有交叉反应25，能够同时检测两种胸苷类似物，这对研究细胞周期进展很有用。通常细胞首先用EdU脉冲，然后用BrdU脉冲，两次合并之间的时间持续几个小时25,26在含有EdU的培养基中添加BrdU会优先将BrdU并入DNA中，排除EdU，同时添加EdU25在介质中加入等摩尔或半等摩尔BrdU只会导致BrdU的掺入27。这简化了双重标签协议，消除了在添加第二个标签之前从培养基中去除第一个标签通常需要的清洗步骤。这对于体内不可能进行清洗步骤的研究，以确定细胞群S期进入或退出的精确时间。

最近，一种使用EdU和BrdU在胚胎小鼠大脑中进行双脉冲标记的方法23,24,22已开发用于分析NSPC的细胞周期进展和INM子宫内辐照。此外，已经证明，在S期，小鼠细胞首先复制常染色质区域，然后复制着丝粒周围的异染色质28,29,30有趣的是，不同染色体的着丝粒周围异染色质聚集在相间细胞核中，形成异染色斑，也称为色心，DAPI染色很容易检测到，称为亮斑。因此，常染色质和染色中心的差异EdU和BrdU染色有助于我们更准确地分析NSPC的S期进展。

这种方法可以证明NSCP中明显缺乏G1/S检查点22-24这很令人惊讶，因为这个检查点被认为是基因组稳定性的关键。基于EdU和BrdU脉冲的不同组合的几种实验设计已用于分析端脑腹侧和背侧的细胞周期进展。在这里，我们给出了一个协议示例，该协议允许在接下来的4小时内研究NSPC的急性DNA损伤子宫内E14.5小鼠胚胎的辐照。

协议

1.动物程序

本协议的设计符合1986年11月24日的欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC），并已获得我们的动物福利机构委员会（CETEA-CEA DSV IdF）的批准。

  1. EdU/BrdU注射与E14.5孕鼠照射(图2A).
    1. 在PBS中制备1 mg/ml的EdU和5 mg/ml的BrdU溶液。用25G的针头向怀孕小鼠腹腔内注射100µl EdU溶液。1.5小时后，以0 Gy或2 Gy（0.6 Gy/min）的剂量照射小鼠（全身照射）。之后，立即用25G的针头将200µl BrdU溶液注射到怀孕小鼠体内。
  2. 胚胎脑冠状切片的制备。
    1. 照射后1小时或4小时，用二氧化碳将怀孕的小鼠安乐死。
    2. 用剪刀将腹腔打开三厘米以上。通过切割子宫角的两端，将两个子宫角与子宫的其余部分分开。将子宫角转移到含有0.6%PBS葡萄糖的培养皿中。用镊子打开子宫角以分离胚胎。用镊子取出每个胚胎的羊膜囊。
    3. 用镊子解剖胚胎头部，并将其浸泡在4°C的4%多聚甲醛（PFA，pH=7.4）O/N中进行固定。
    4. 在4°C的温度下，用PBS冲洗胚胎头部至少一晚。头部可以在PBS中保存几天。
    5. 使用真空渗透处理机如所示表1.也可以在乙醇和二甲苯浴的化学罩下进行封头嵌入，然后在65°C的烤箱中进行石蜡浴。
    6. 用切片机准备5µm厚的冠状切片。
    7. 安装在聚赖氨酸涂层显微镜载玻片上。
    8. 载玻片可以在室温（RT）下保存数月。

2.EdU/BrdU染色

  1. 去石蜡化和抗原揭开
    1. 将载玻片浸泡在3次甲苯浴中5分钟，以使石蜡包埋的脑切片脱蜡。
    2. 在乙醇浓度降低的每种溶液的2个浴中再水化3分钟，如下所示：乙醇100%、乙醇95%、乙醇70%和H中5分钟2O.载玻片可在去离子水中保存数小时。
    3. 将切片在柠檬酸盐溶液（10 mM，pH 6）中煮沸10分钟，然后在去离子水中孵育5分钟。
  2. EdU染色
    1. 根据制造商的协议执行EdU检测。用0.5%triton X-100在PBS中渗透细胞10分钟。
    2. 通过在去离子水中稀释10X溶液，制备1X EdU缓冲添加剂。该溶液应在同一天新鲜制作并使用。
    3. 制备EdU反应鸡尾酒，包括EdU Alexa Fluor 488叠氮化物。按照中列出的顺序添加配料很重要表2否则，反应将不会以最佳方式进行。在制备后15分钟内使用EdU反应鸡尾酒。
    4. 取出渗透缓冲液（步骤2.1.1），然后用PBS冲洗两次。
    5. 添加150µl EdU反应鸡尾酒，放一张盖玻片，在室温下黑暗中孵育30分钟。
    6. 取出EdU反应鸡尾酒，然后用PBS清洗一次。
  3. BrdU染色
    1. 用7.5%山羊血清和7.5%胎牛血清在PBS中制备饱和缓冲液。在脑片上添加150µl饱和缓冲液，放一张盖玻片，并在RT下孵育1小时，以阻止非特异性抗体结合。
    2. 拆下盖玻片。在饱和缓冲液中添加150µl稀释为1/300的小鼠抗BrdU一级抗体，放置盖玻片并在4°C下培养O/N。
    3. 取下盖玻片，然后在PBS中清洗3次。
    4. 在饱和缓冲液中加入150µl稀释至1/400的山羊抗鼠Alexa594二级抗体，放置盖玻片，并在室温下孵育1小时。
    5. 取下盖玻片，然后在PBS中清洗一次。
    6. 核染色：在PBS中以1µg/ml的速度添加150µl 4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），放置盖玻片并在室温下培养2分钟。
    7. 在安装介质中安装滑块。

3.分析

  1. 在带有20X物镜或共焦显微镜的荧光显微镜下检查大脑切片，并在三个通道（488 nm、594 nm和UV）中采集图像作为分离文件。
  2. 使用Photoshop软件堆叠图像。
  3. 分析大脑背内侧壁标准部分的脑切片。该扇区的中-横向尺寸为100µm，并使用叠加在图像上的网格将其分为18个（或更多）高度为10µm的箱子(图1)如前所述31.
    1. 对齐网格，例如第一个箱子位于心室表面，其长轴平行于心室边界。然后对每个料仓中标记的EdU、BrdU和/或固缩核（对应凋亡核）进行编号。对位于两个料仓边界上的一个核进行编号，该料仓中包含其较大部分，或者当该核在两个料斗中占据相等的面积时，将其编号在下料仓中。
  4. 统计分析。

分析每个胚胎至少两个皮质切片。对来自不同窝的至少3个胚胎进行重复实验。结果应为平均值±平均值标准误差（SEM）。使用Graphpad Prism进行统计分析，使用双向方差分析和Bonferroni多重比较事后检验。

具有代表性的结果

在中描述的实验中图2，EdU在照射前1.5小时给药，BrdU在照射后立即给药。然后，根据EdU或BrdU的掺入情况，在照射后1小时或4小时制备的皮质切片中区分出四种类型的细胞(图2A和2B型). 重要的是，EdU和BrdU掺入均未改变辐射诱导的凋亡水平（数据未显示）。此外，染色方法仅允许检测S期DNA复制过程中合并的EDU和BrdU，但不具备检测与修复相关的DNA合成的敏感性，即使在辐照后。事实上，i）照射后1小时（PI），皮层板细胞（位于G0期有丝分裂后神经元）中未观察到EdU或BrdU染色，ii）与未照射的大脑相比，照射后1 h，EdU（+）和/或BrdU（+）的数量没有增加。

EdU（+）BrdU（+

EdU（+）BrdU（+）核对应于0小时PI前后处于S期的NSPC。因此，在S相中对其进行辐照。如所示图3B和3C公司它们的常染色质是EdU（+），也可以是BrdU（+）。根据牺牲时S相的完成情况，它们的色心为BrdU（+）或BrdU（-）。图2B显示在1小时PI时，EdU（+）BrdU（+(即已知NSPC执行S阶段的箱子4至1031它们的分布和数量不受辐照的影响。这表明此时辐射并没有诱导DNA合成的完全阻滞。

与G2期基底核至顶端核的迁移一致，在未照射的大脑中，在4小时PI时，NSPC的大多数EdU（+）BrdU（+(图2C). 这在2Gy照射的大脑中没有发生，其中细胞核仍位于S相区，其中许多是凋亡的。总之，这些数据表明，在S期照射的NSPC激活了S内检查点，与延迟INM和细胞死亡相关。

EdU（+）BrdU（-）核

EdU（+）BrdU（-）细胞核对应于照射前后处于S期的细胞。这些细胞核的嗜铬粒为EdU（+），表明小鼠注射EdU时细胞处于晚期S期(图3A). 由于NSPC的G2/M期在发育中的小鼠大脑中持续2小时，EdU（+）BrdU（-）NSPC在0小时PI时处于G2。始终如一地，在1小时PI时，大多数EdU（+）BrdU（-）核在未受照射的大脑心室附近的第一个箱子中被发现。这是NSPC的INM的结果，在S期之后，其中许多形成了典型的有丝分裂象(图2B). 在1小时PI时，心室表面EdU（+）BrdU（-）核的数量显著减少，在受照射的大脑中未检测到有丝分裂图。这些数据清楚地表明，照射G2的细胞在1小时PI内激活了G2/M检查点。此外，这些细胞核中的大多数EdU（+）BrdU（-）在4小时PI时发生凋亡，表明NSPC在G2期间具有高度放射敏感性(图2C).

EdU（-）BrdU（-

具有EdU（-）BrdU（-(图3E). 中1小时和4小时的比较图2C显示了运动间核迁移，使得G1期1小时时靠近心室的细胞核在4小时时从顶部迁移到底部，而S期的细胞核则朝向心室表面。

如所示图2C许多核在4小时PI时凋亡。在心室表面附近，凋亡的EdU（-）BrdU（-。因此，这些数据表明，在G1期早期和/或有丝分裂后迁移神经元受到辐射后，NSPC发生了辐射诱导的凋亡。相反，在皮质板中没有发现或很少发现凋亡细胞核。这与到达最终目的地的神经元的抗辐射能力是一致的。

EdU（-）BrdU（+）核

EdU（-）BrdU（+）细胞核对应于照射后进入S期的细胞。通常在1小时PI时，它们显示常染色质的扩散BrdU标记，但不显示色心的扩散BrdU标记。因此，当时它们处于早期S阶段(图3D). 在1小时PI时，对照组和受照大脑中EdU（-）BrdU（+）核的数量和S相区的定位相似。因此，在1标准hr PI在小鼠发育期大脑中不受辐射影响(图2B). 有趣的是，对受照大脑中1小时和4小时PI的比较显示EdU（-）BrdU（+）核的数量下降，并且大多数这些核在4小时PI时发生凋亡。这表明，辐射后进入S期的细胞激活了S内检查点，随后发生凋亡(图2C).

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图1.用Dapi染色的E14.5小鼠胚胎大脑半球的脑切片冠状切片分析。EdU和BrdU染色以及核形态在背内侧脑壁的标准扇区中使用划分为18个仓（或更多）的网格进行分析，如本文所述。比例尺：20µm。请单击此处查看此图的放大版本。

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图2.辐照后神经干和祖细胞的细胞周期进展（图来自Roque等。，干细胞，2012).（A）实验设计示意图和1小时和4小时PI（2 Gy）冠状皮质切片中发现的DAPI（蓝色）、EdU（绿色）和BrdU（红色）染色模式。比例尺=20μm。（B、C）未照射对照组（蓝色）EdU（+）BrdU（−）、EdU（＋）BrdU（+）、EdU（−”BrdU“+”或EdU（−）BrdU-”细胞核的数量/bin，在1小时（B）或4小时PI（C）时，照射（2 Gy）皮层的形态正常（红色）或凋亡（固缩，黑色）。在1小时PI（B）时未检测到凋亡细胞核。使用Bonferroni事后检验进行统计分析。缩写：BrdU，5-溴-2′-脱氧尿苷；DAPI，4′-6-二氨基-2-苯基吲哚；乙二胺四乙酸，5-乙炔基-2′脱氧尿苷；IZ，中间带；SVZ，室下区；VZ，心室区。请单击此处查看此图的放大版本。

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图3.常染色质和染色中心的差异EdU和BrdU染色上部面板：EdU（绿色）、BrdU（红色）染色和DNA用DAPI（蓝色）复染的Z堆栈共焦图像允许检测作为亮蓝色病灶的色心。对实验中1小时PI收集的胚胎脑切片进行染色，其中EdU在照射前1.5小时交付，BrdU 0小时PI（仅显示未照射对照）（比例尺：5µm）。请单击此处查看此图的放大版本。

底部面板显示了冠状脑切片中检测到的5种不同EdU和BrdU染色模式的示例。显示合并图像和单个通道（比例尺：2µm）：

A）带有EdU（+）色心和EdU（＋）或EdU（-）常染色质的细胞核。因此，EdU在着丝粒周围异染色质复制的晚期S期被纳入：细胞在0小时PI处于G2。

B）带EdU（+）常染色质和BrdU（＋）选择中心的细胞核：EdU已在早期S期并入，此时大多数常染色质被复制，而BrdU已并入晚期S期：细胞在0小时PI时处于S期。

C）具有EdU（+）BrdU（+）常染色质和EdU（-）BrdU（-）色心的细胞核。EdU和BrdU已并入S期的第一部分：细胞在0小时PI时处于早期S期。

D）带BrdU（+）常染色质和EdU（-）BrdU（-）色心的细胞核。BrdU已在S阶段开始时加入。0小时PI时细胞处于G1晚期，此后进入S期。

E）带EdU（-）BrdU（-”常染色质和染色中心的细胞核。这些细胞处于G0（未成熟神经元）或G1期，在EdU和BrdU脉冲期间未进入S期。 

解决方案孵化温度压力煽动
1酒精70%30分钟35摄氏度在在
2酒精95%15分钟35摄氏度在在
三酒精95%30分钟35摄氏度在在
4酒精95%45分钟35摄氏度在在
5酒精100%15分钟35摄氏度在在
6酒精100%30分钟35摄氏度在在
7酒精100%1小时35摄氏度在在
8甲苯100%30分钟35摄氏度在在
9甲苯100%45分钟35摄氏度在在
10甲苯100%1小时35摄氏度在在
11石蜡30分钟58摄氏度在在
12石蜡1小时58摄氏度在在
13石蜡1小时58摄氏度在在
14石蜡1.5小时58摄氏度在在

表1.石蜡包埋的真空渗透处理器程序。

1张幻灯片的反应组件
1X EdU反应缓冲液128.64微升
CuSO公司46微升
EdU Alexa氟叠氮化物0.36微升
1X EdU反应缓冲添加剂15微升
总体积 150微升

表2。 EdU反应鸡尾酒。

讨论

本文所述的实验设计基于辐照前1.5小时加入EdU和辐照后立即加入BrdU，从而证明NSPC能够在1小时内激活S和G2/M检查点，但不能激活G1/S检查点标准胎鼠脑内基因毒性应激后hr。我们还进行了其他实验，在照射后的不同时间注射EdU，在小鼠牺牲前1小时注射BrdU，这让我们能够特别评估S期进入的速度。这些实验表明，NSPC在基因毒性应激后不会激活G1/S阻滞体内22,23.

因此，在G1/S检查点，DNA修复和凋亡之间的选择并没有发生，这就对保证这些细胞基因组稳定性的机制的性质提出了疑问。

该协议简单快捷。不同的步骤没有明显的困难。该技术是氯脱氧尿苷（CldU）和碘脱氧尿嘧啶（IdU）的替代品，这两种药物已被证明具有交叉反应32.

可以考虑广泛的应用程序，因为该协议很容易灵活并适用于几个生物学问题。Roque和合作者提出了变更示例23、艾蒂安和合作者22卢梭及其合作者24它还可以与免疫荧光检测相结合，检测一些细胞标记或参与DNA损伤反应的蛋白质。注意，在这种情况下，BrdU和EdU检测都可以使用商业化的不同荧光团进行，以利于其他标记物的免疫检测。

EdU和BrdU体内在NSPC中的掺入也可用于流式细胞术的细胞分选，以进行进一步的生化分析。最后，该方法可用于监测不同类型突变小鼠或其他类型基因毒性应激（电离辐射除外）或任何其他影响细胞周期进展的治疗后NSPC的细胞周期进展。此外，它可以很容易地适应其他复制组织。

披露

作者没有利益冲突。

致谢

根据323267号赠款协议，导致这些结果的研究得到了欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）、法国电力公司（EDF）和法国国家科学研究院（ANR-SEST，Neurorad）的资助。

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文章来自可视化实验杂志：JoVE由以下人员提供MyJoVE公司