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免疫。作者手稿；PMC 2014年9月24日发布。
以最终编辑形式发布为：
免疫。2013年8月22日；39(2): 357–371.
2013年8月15日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.immuni.2013.07.018
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EMSID:EMS60355系列
PMID：23954132

白细胞介素-33依赖性固有淋巴细胞介导肝纤维化

Tamar Mchedlidze公司,1 马克西米利安·瓦尔德纳,1 斯特芬·佐普夫,1 詹妮弗·沃克,5 安德鲁·兰金,2 马库斯·舒克曼,三 大卫·沃林格,4 安德鲁·麦肯齐,5 马库斯·诺伊拉斯,1 斯特凡·普弗兰兹,2和斯特凡·维茨1
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补充资料

总结

肝纤维化是慢性肝病的后果，因此是死亡和发病的主要原因。临床证据和动物研究表明，由于慢性肝细胞应激的免疫反应，局部组织稳态受到干扰。不明确的应激相关炎症网络被认为介导细胞外基质成分的逐渐积累，最终导致纤维化和肝衰竭。在这里，我们已经报道了白细胞介素33（IL-33）的肝脏表达对于严重的肝纤维化是必需的，也是足够的体内我们已经证明IL-33的促纤维化作用与肝脏固有淋巴细胞（ILC2）的激活和扩张有关。我们确定ILC2-derived IL-13是IL-33依赖性病理组织重塑和纤维化的关键下游细胞因子，它通过转录因子STAT6和肝星状细胞活化通过II型IL-4受体依赖性信号发挥作用。我们的数据揭示了与肝纤维化相关的关键免疫网络，并支持为治疗目的调节IL-33生物活性的概念。

介绍

肝纤维化是慢性肝病的广泛后果，包括感染相关的肝纤维化（如丙型肝炎病毒感染、血吸虫病）、代谢型纤维化（如脂肪性肝炎）和胆道型纤维化（例如原发性硬化性胆管炎），是死亡和发病的主要原因。它是持续肝细胞应激的慢性炎症反应的结果，最终导致病理组织重塑和细胞外基质（ECM）蛋白沉积增加(巴特勒和布伦纳，2005年). 晚期进行性肝纤维化的特征是肝脏结构发生根本性变化，这容易导致器官衰竭和肝细胞癌。

肝星状细胞（HSC）被视为纤维化期间ECM成分的主要细胞来源。在肝损伤过程中，支持静止HSC向成纤维肌成纤维细胞转化分化的损伤相关免疫过程对纤维化特别重要(弗里德曼，2010). 与肝损伤和纤维化相关的炎症反应是一个涉及免疫细胞亚群在肝内蓄积的动态过程。这些细胞被肝细胞产生的特定类型的趋化因子和细胞因子吸引并在肝脏中激活。趋化因子和细胞因子如TGF-β、IL-6、PDGF和IL-1与HSC功能有关在体外和体内(Seki等人，2009年;Wasmuth等人，2010年;Weiler-Normann等人，2007年). 然而，肝纤维化的许多早期事件，包括浸润性致病性免疫细胞亚群和支持局部炎症和HSC活化的关键分子介质的确切性质仍不明确(弗里德曼，2008).

最近，白细胞介素-33（IL-33），一种与IL-1相关的细胞因子，被认为与动物模型中的炎症状态有关(Haraldsen等人，2009年;Schmitz等人，2005年;Xu等人，2008). 此外，IL-33被认为在皮肤和肺部具有促纤维化特性(Rankin等人，2010年;Yanaba等人，2011年). IL-33可能通过尚不明确的途径从细胞中主动分泌，但据报道，坏死细胞的被动释放是细胞外IL-33丰富的主要机制体内(Cayrol和Girard，2009年;Luthi等人，2009年). 因此，IL-33可能被认为是一种损伤相关分子模式（DAMP），它有助于组织损伤反应和炎症反应(帕尔默和加贝，2011年). 细胞外IL-33的细胞因子样活性通过由普遍存在的IL-1R相关蛋白（aka IL-1R3）和更选择性表达的IL-33受体（aka ST2，IL-1R4）组成的异体细胞表面受体介导(Chackerian等人，2007年;Palmer等人，2008年). 最近，表达ST2并通过产生T helper-2（T helper-2T小时2） 细胞相关细胞因子IL-4、IL-5和IL-13已被描述(Moro等人，2010年;Neill等人，2010年;Price等人，2010年;Saenz等人，2010年b). 此外，这些细胞（ILC2）已被证明是体内IL-9的来源(Wilhelm等人，2011年)转录因子RORα和GATA3的内在表达被证明对ILC2群体中至少一部分的产生很重要(Wong等人，2012年,Hoyler等人，2013年). 在小鼠和人类中，ILC2主要存在于与屏障表面相关的淋巴组织中，并且ILC2和ILC2衍生的细胞因子在宿主保护免受蠕虫和病毒感染方面发挥着关键作用(Chang等人，2011年;Mjosberg等人，2011年;Monticelli等人，2011年).

在这里，我们已经确定IL-33是肝纤维化的关键介质体内我们的数据表明，IL-33是在应对慢性肝细胞应激时释放的，细胞外IL-33通过ST2依赖性信号，导致ILC2在肝脏中的积聚和激活。激活的肝脏ILC2产生IL-13，进而以IL-4Rα和STAT6转录因子依赖的方式触发HSC的激活和转分化。这些发现表征了与肝纤维化相关的分子和细胞网络，并强调了IL-33在原纤维化级联反应顶点的作用。此外，揭示了ILC2在组织损伤反应中的致病能力。最后，我们的结果验证了IL-33依赖网络在肝脏炎症和纤维化中的治疗性调节的想法。

结果

肝纤维化时IL-33表达升高，IL-33足以驱动ECM在肝脏中过度沉积

以前的研究表明IL-33在Th2细胞相关炎症和皮肤和肺纤维化中的作用(帕尔默和加贝，2011年;Rankin等人，2010年). 为了解决其与人类纤维化肝病发展的关系，我们评估了肝硬化患者队列中IL-33的血清浓度。与对照组相比，患者的血清IL-33水平显著升高(图1A). 在肝纤维化的啮齿动物模型中，通过反复使用肝毒性化学物质来模拟慢性肝细胞应激。因此，我们接下来评估了IL-33在小鼠中的表达，在小鼠中，通过重复给药硫代乙酰胺（TAA）或四氯化碳（CCL）在两个独立的模型中实验性诱导肝纤维化4). 在接受这两种化学物质治疗的小鼠中，IL-33的血清浓度显著升高(图1B)免疫组化染色显示肝脏IL-33蛋白表达增加(图1C). 此外，在慢性血吸虫病小鼠模型中，肝脏IL-33蛋白表达强烈增加，慢性血吸虫病是一种易感染的小鼠和人类严重肝脏炎症和纤维化的疾病(图1C). 此外，TAA和CCl提高了肝脏中IL-33 mRNA的表达4治疗（未显示）。CCL的其他组织中未发现IL-33的差异表达4或TAA受试小鼠表明，在这些模型中，增加的血清IL-33不太可能来源于非肝细胞（未显示）。

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IL-33在肝纤维化中上调

（A）通过ELISA测定健康对照组或肝硬化患者的血清IL-33（n=11/组；***p<0001）。（B）对照小鼠或TAA或CCL小鼠的血清IL-33蛋白浓度4诱导肝纤维化。（n=5/组；**p<0.01；**p<0.001）。（C）CCL肝脏切片的代表性图像4、TAA、，曼索尼用免疫组织化学方法对感染和对照组小鼠进行IL-33染色。标尺50μm。（D）将2,5μg mcIL-33表达或控制载体（模拟）HD注射到小鼠体内。4周后对小鼠进行分析。肝脏切片用HE染色以检测IL-33蛋白，或用天狼星红染色以显示胶原。（E）通过ELISA测定mcIL-33处理小鼠（***p<0001）的IL-33血清浓度。比例尺100μm（IL-33染色）或200μm（HE和天狼星红）。（F）通过羟脯氨酸测定对指示小鼠的总肝胶原进行量化（n=9-10/组：***p<0.001）。（G）通过qPCR定量肝总RNA中选定纤维化相关基因的mRNA。（n=9-10/组；***p<0.001；*p<0.05）。数据代表了至少两个具有类似结果的不同实验。（H）感染~30的CD1小鼠曼索尼感染后第3周对尾蚴进行HD注射mcIL-33。3周后处死小鼠，测定器官重量。通过羟脯氨酸定量测定肝胶原含量。（n=5/组；**p<0.01；*p<0.05）。数据代表了具有相似结果的两个不同实验。

为了确定肝细胞释放IL-33是否足以诱导纤维化，我们构建了一种载体，编码由肝脏特异性调节元件控制的分泌型IL-33（mcIL-33），并利用流体动力输送（HD）技术，以维持肝纤维化体内IL-33对肝细胞的转导作用(Liu等人，1999年) (补充图1A). 我们的数据证实，IL-33在注射IL-33载体但未注射对照载体的小鼠肝细胞中过度表达(图1D). 同样，在血清中检测到IL-33蛋白(图1E). 其他研究表明，rIL-33可以诱导IL-13的系统表达体内(Rankin等人，2010年;Schmitz等人，2005年). 在我们的研究中，在用于HD的IL-33剂量下，没有检测到血清IL-13（未显示），这表明观察到了IL-33的肝脏特异性效应，而不是全身效应。

HD四周后，注射IL-33载体但未注射对照载体的动物表现出过度的免疫细胞浸润和肝胶原增加，苏木精和伊红（H&E）和天狼星红染色分别证明了这一点(图1D). 通过对采集的肝组织进行定量羟脯氨酸测定，证实了肝胶原蛋白总量的显著增加(图1F). IL-33治疗也能诱导纤维生成标记物的基因表达行动1,倾倒1、和第1a1列(图1G). 向IL-33R（ST2）缺陷小鼠注射相同剂量的IL-33载体后，未观察到肝胶原增加，证实ST2是IL-33介导的肝纤维化所必需的(补充图1B).

此外，曼索尼mcIL-33介导的肝IL-33过度表达导致依赖性肝损伤显著增加(图1H)而这些经过治疗的小鼠由于严重疾病而过早死亡（未显示）。

进一步分析IL-33通路在肝纤维化中的功能作用体内，我们在小鼠肝脏中表达了生物活性IL-33。通过Cre重组酶介导的EGFP-Stop盒（EGFPSTOPflox公司伊利33老鼠；补充图1C). 我们在eGFP中诱导了肝脏IL-33的表达STOPflox公司伊利33Cre表达质粒的HD小鼠(补充图1D). 4周后对这些小鼠的肝脏进行的检查显示，肝脏IL-33的表达导致了胶原蛋白的深度沉积和纤维化(补充图1D).

IL-33缺乏改善实验性纤维化体内

接下来我们研究了IL-33缺乏是否影响肝纤维化的发展体内; 纤维化是在伊利33−/−重复给CCL的小鼠和WT同窝小鼠4。4周后伊利33−/−如天狼星红染色和羟脯氨酸定量所示，小鼠表现出过量胶原沉积的显著减少(图2A)而总的肝胶原在未受挑战的伊利33−/−小鼠与对照组的比较（未显示）。与改善的纤维化表型一致倾倒1，与人类和小鼠HSC活化和纤维化相关的基因(Benyon等人，1996年;Jin等人，2011年)在以下患者的肝脏中观察到伊利33−/−老鼠(图2B). 此外，采用实验性结扎胆总管（BDL）的胆道纤维化模型。再次，肝组织的组织学评估和总胶原蛋白定量显示伊利33−/−小鼠与对照组的比较(图2C). 使用BDL染毒16天的小鼠的肝脏RNA，基于qPCR-量化纤维化相关基因表达，进一步证实了纤维化的减轻。金额第1a1列,第3a1列和倾倒1在伊利33−/−老鼠(图2D). 为了评估IL-33生物活性的调节是否影响血吸虫病患者的肝脏病理，我们接下来用可溶性ST2（sST2）构建物（一种天然存在的IL-33诱饵受体）治疗感染3周后的小鼠。与对照组相比，接受sST2给药的小鼠发生的肝脏疾病显著减少(图2E)表明IL-33在寄生虫诱导的肝病中具有促炎和/或促纤维化功能。

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IL-33缺乏改善实验性纤维化体内

伊利33−/−或C57BL/6对照小鼠（n=5/组）接受CCL治疗4持续4周。（A）用天狼星红对肝脏进行染色以测定胶原纤维沉积，并测定肝脏中的羟脯氨酸含量（*p<0.01）。（B） 倾倒1CCL肝总RNA中的mRNA4用qPCR对处理过的小鼠或对照组进行量化（**p<0.01）。（C、D） 伊利33−/−或C57BL/6对照组接受了BDL手术。16d后处死小鼠并分析肝脏：（C）切片用天狼星红染色，并量化肝脏中的羟脯氨酸含量（*p<0.05），（D）用qrtPCR定量BDL小鼠或对照组肝脏总RNA中选定的纤维素酶相关基因的mRNA。（E）CD1小鼠感染~30曼索尼尾蚴病。3周后，HD向小鼠注射可溶性ST2受体的肝脏特异表达构建物。4周后处死小鼠。用天狼星红染色和羟脯氨酸定量法测定小鼠肝脏胶原沉积。每张幻灯片在10个低功率场中对肉芽肿进行计数。（n=5/组；***p<0.001；*p<0.05）。比例尺200μm。

（F、G、H） 伊利33−/−向小鼠注射5μg肝脏特异性表达构建的全长IL-33（aa 1-260）。（F）IL-33特异性免疫染色显示肝细胞核IL-33表达。（G）治疗7天后小鼠肝脏的分析（H）HD小鼠接受1,8 ml/kg CCL治疗后7天4或350 mg/kg TAA。3d后用ELISA法测定血清IL-33浓度。（***p<0.001）数据代表了至少两个具有相似结果的不同实验。比例尺200μm或50μm（IL-33染色）。

一些报告将IL-33描述为细胞内蛋白，只有在受损细胞被动释放后，IL-33才会展现其依赖于ST2的细胞因子活性(帕尔默和加贝，2011年). 然而，目前对细胞内IL-33是否存在显著的功能作用尚不清楚。因此，一种可能的解释是，我们的结果减少了肝纤维化伊利33−/−小鼠认为细胞内IL-33具有促纤维化特性。为了解决这个问题，将编码IL-33细胞内表达版本的载体（包括核定位信号）传递给伊利33−/−小鼠通过HD。IHC染色显示肝脏IL-33蛋白表达明显(图2F)，在这些动物的血清中未检测到IL-33（未显示），组织学也未观察到肝脏病理(图2G). 然而，当这些动物接受CCL治疗时4，血清中可检测到IL-33(图2H)肝纤维化（未显示）。

为了获得有关该模型中肝纤维化进展的分子网络的进一步信息，我们接下来通过qPCR生成了IL-33依赖性纤维化小鼠肝脏中细胞因子、趋化因子、促纤维化基因和纤维溶解基因的mRNA表达谱。因此，确定了许多差异调节基因(补充表1)当通过Ingenuity Pathway Analysis进行相关性和生物学意义分析时，很明显与肝纤维化和HSC活化相关的基因表达网络有关(补充图2).

IL-13依赖性II型IL-4受体信号转导介导IL-33依赖性纤维化

我们的下一个目标是更详细地定义IL-33依赖性纤维化肝病所需的途径。因为IL-13 mRNA在IL-33诱导的纤维化和IL-33治疗的小鼠肝脏中增加最为显著曼索尼受感染的小鼠(补充图3A、B)，我们治疗了第13页−/−小鼠和WT与mcIL-33同窝，4周后检查肝脏。天狼星红染色和肝胶原定量显示IL-33治疗的肝纤维化第13页−/−与对照组相比，小鼠的肝纤维化程度降低，表明IL-13在该模型中具有关键的促肝纤维化作用(图3A). IL-13通过由IL-4Rα和IL-13Rα1组成的II型IL-4受体介导生物功能(Wills Karp和Finkelman，2008年). 为了测试II型IL-4R信号是否参与IL-33依赖性纤维化，我们将mcIL-33注射到Il4R型α−/−老鼠。如天狼星红染色和羟脯氨酸测定所示，Il4R型α−/−与对照组相比，小鼠的纤维化程度显著降低Il4R型α+/+老鼠(图3B). 此外，IL-13构建物的HD，但不是T的构建物小时2-相关细胞因子IL-5和IL-9(补充图4A)，明显诱导了WT小鼠肝脏中的ECM沉积。相反，Il4R型α−/−小鼠对IL-13依赖性纤维化不敏感(补充图4A). 肝硬化患者肝切片染色显示，IL-4Rα和IL-13Rα1在疾病区域均显著上调，提示小鼠的这些机制性发现可能与人类肝病的发病机制有关(图3C).

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IL-33介导的纤维化和HSC活化需要IL-13依赖的II型IL-4受体信号

HD将IL-33表达构建物注入（A） 第13页−/−老鼠，（B） Il4R型α−/−鼠标或Balb/c控件。4周后处死小鼠，通过天狼星红染色或羟脯氨酸测定分析肝脏中的胶原沉积（n=10只小鼠/组；***p<0.001；**p<0.01）。比例尺200μm。（C）健康对照组或肝硬化患者肝组织切片的代表性图片，用免疫组织化学方法染色IL-4Rα或IL-13Rα（D）Western-Blot检测全肝裂解物中激活的STAT6（顶部面板）或IL-13刺激的HSC（下部面板）。（E）刺激HSC在体外用rIL-13治疗4d。使用WST-1分析评估细胞生长。对照组：单独培养基（***p<0001；*p<0.05）。（F）HSC培养48h，加入或不加入30ng/ml IL-13。用ELISA定量上清液中的趋化因子。数据代表了至少两个不同的实验。

IL-13依赖的II型IL-4R信号通路介导HSC活化

我们观察到IL-13是IL-33促纤维化功能的主要效应物，这促使我们进一步研究IL-13在肝纤维化中的生物学作用。IL-13对免疫细胞和非造血细胞的作用已被描述(Koyasu和Moro，2011年). 因此，我们通过产生嵌合物来评估造血细胞或非造血细胞中的IL-4Rα信号是否需要用于纤维生成，在嵌合物中，IL-4Rβ缺陷或野生型骨髓被转移到接受用氯膦酸钠脂质体预处理以耗尽枯否细胞的受体小鼠中。然而，IL-33在两种嵌合菌株中诱导了相似程度的肝纤维化(补充图4B). 由于HSC被认为是纤维化过程中主要的ECM产生细胞，我们分析了IL-33依赖性IL-13的产生是否直接调节这些非免疫细胞。我们分离出HSC，发现它们为功能性II型IL-4R、IL-4Rα和IL-13Rα1的两个组分产生mRNA。此外，流式细胞术显示IL-13Rα1的表面表达(补充图4C). Western-Blot分析显示注射mcIL-33后肝裂解物的STAT6磷酸化增加体内(图3D 顶部面板）此外，纯化原代HSC，用IL-13刺激体外通过STAT6磷酸化反应，STAT6是IL-4和IL-13依赖性细胞反应的关键转录因子(Hebenstreit等人，2006年) (图3D 下部面板）。此外，用IL-13刺激HSC可增加其增殖在体外(图3E)并诱导肝纤维化前基因mRNA的IL-13依赖性增加(补充图4D)和趋化因子(图3F). 总的来说，这些数据表明IL-33通过IL-13调节HSC功能。

肝纤维化小鼠肝脏ILC2增加

不同的细胞类型被描述为IL-13对IL-33刺激的可能来源(Besnard等人，2011年;Kroeger等人，2009年;Stolarski等人，2010年). 为了确定该系统中哪些细胞是IL-33依赖性IL-13的主要产生者，我们首先通过产生嵌合体来评估免疫细胞或肝细胞是否是IL-37的关键靶细胞，在嵌合体中，ST2缺陷或野生型BM细胞被转移到野生型受体中(图4A). 有趣的是，mcIL-33治疗在两种菌株中诱导了不同的反应：虽然用野生型BM重建的小鼠发生了严重的纤维化疾病，但BM衍生细胞中IL-33信号缺陷的嵌合体没有显示肝脏病理或胶原过多(图4B、C).

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天然免疫细胞促进IL-33依赖性纤维化

（A） Il1rl1号机组−/−或Il1rl1号机组+/+将骨髓细胞静脉注射到照射过的C57BL/6受体小鼠中。8周后，小鼠通过HD注射接受mcIL-33。（B）治疗四周后，小鼠肝脏出现典型的天狼星红色染色。（C）肝胶原蛋白含量通过羟脯氨酸定量测定（n=5/组；**p<0.01）。（D、E、F）将IL-33表达结构HD注射到C57BL/6或抹布1−/−老鼠。（D）治疗4周或8周后，小鼠肝脏出现天狼星红染色。（E）通过羟脯氨酸定量测定肝脏中的总胶原蛋白（N=5-6只小鼠/组；*p<0.05）。（F）在mcIL-33治疗4周后，用qPCR定量小鼠肝纤维化相关基因的mRNA（N=5/组；**p<0.01；*p<0.05）。数据代表了至少两个具有类似结果的不同实验。比例尺200μm。

为了进一步表征这些IL-33应答造血细胞的作用，我们测定了淋巴细胞在肝纤维化进展中的作用。抹布1−/−接受mcIL-33治疗的小鼠在HD后4周出现明显的肝脏病理学改变(图4D). 事实上，天狼星红染色和羟脯氨酸测定表明，与对照组相比，这些小鼠的纤维化程度更明显(图4D、4E). 相反，抹布1−/−气相色谱−/−除了B细胞和T细胞外，缺乏γc依赖性淋巴细胞（例如NK细胞和ILC）的小鼠对IL-33介导的肝纤维化具有抵抗力（数据未显示）。接下来，我们进行了qPCR分析，以比较mcIL-33治疗后肝脏中几个纤维素瘤相关基因的表达抹布1−/−和WT小鼠。事实上，与我们上面描述的数据一致小时2细胞相关细胞因子，尤其是IL-13，在Rag1−/−老鼠。相反，抗纤维化细胞因子干扰素-γ的含量在抹布1−/−老鼠(图4F).

最近，一些报告描述了对IL-25和/或IL-33刺激产生反应的固有淋巴细胞群（核细胞、天然辅助细胞、固有辅助细胞、ILC2），能够产生大量IL-13，并且对宿主对感染的反应很重要(Moro等人，2010年;Neill等人，2010年;Price等人，2010年;Saenz等人，2010年b). 我们的观察表明，IL-33诱导的肝纤维化独立于适应性免疫细胞，并且在很大程度上依赖于IL-13，但不依赖于嗜碱性粒细胞和肥大细胞的存在(补充图5A、5B)促使我们分析ILC2在纤维化肝病中的功能作用。首先，我们治疗了Il4号机组-eGFP（4get）小鼠，通过表达eGFP标记2型活性细胞的报告菌株(Mohrs等人，2001年)用mcIL-33和流式细胞术分析分离肝细胞中eGFP的表达(图5A). 因此，eGFP的数量+Sca-1型+IL-33处理后细胞显著增加。Sca-1在造血祖细胞上表达，先前已显示由ILC2表达(Saenz等人，2010a). 在进一步的实验中，我们能够恢复少量lin−，CD45+以幼年小鼠肝脏中IL-33R、IL-7Rα、CD44、CD90.2、ICOS和Sca-1的表达为特征的细胞，类似ILC2。在mcIL-33治疗小鼠的肝脏中，我们发现这些细胞高度富集(图5B)此外，如细胞内流式细胞术分析所示，这些ILC2产生IL-13(图5C). 最近，转录因子RORα被证明对核细胞的发育至关重要(Wong等人，2012年)与对照组相比，用mcIL-33治疗的小鼠肝脏RORαmRNA表达增加(图5D). 为了确定RORα对肝脏ILC2发育的潜在影响，我们分析了纯化的肝脏ILC2中RORα的表达。定量分析RORαmRNA显示ILC2中RORα丰度高于ROR-γt，后者参与其他ILC谱系（ILC3）的发育程序(图5E). 此外，肝脏中lin的数量−Sca-1型+国际博协+用缺乏RORα的小鼠BM重组的嵌合体小鼠的细胞减少，这表明肝脏ILC2与其他组织中的ILC2在发育上相关(Wong等人，2012年) (图5F). 接下来，我们研究了肝纤维化小鼠ILC2的频率。我们发现林−ST2型+国际博协+CCL小鼠肝脏细胞增多4诱导性纤维化(图5G). 然而，在CCL的肝脏中4治疗Il1rl1号机组−/−小鼠ILC2含量低于WT小鼠(图5H). 此外，肝脏ILC2数量在曼索尼受感染的小鼠(图5I)而sST2治疗阻断IL-33可降低肝脏ILC2和RORαmRNA(图5J). 这些发现表明，IL-33信号通路对慢性肝病期间ILC2的肝脏蓄积至关重要。幼年期肝脏ILC2的数量相似伊利33−/−/4get与伊利33+/+/4get小鼠表明在肝内稳态条件下ILC2存活可能不需要IL-33信号(补充图5C). 因此，在缺乏IL-33和ST2的情况下，IL-25在肝脏的过度表达使肝脏ILC2扩张(补充图5D、5E). 然而，尽管CCL小鼠的肝脏IL-25 mRNA有所增加4或感染性肝纤维化(补充图5F)在这些小鼠的血清中未检测到IL-25蛋白，这表明IL-33而非IL-25是慢性肝病中ILC2扩张的原因。

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IL-33扩大产生IL-13的肝脏常驻2型相关ILC

（A）流式细胞术分析从幼年IL-4/eGFP报告小鼠或用mcIL-33治疗5天后分离的肝免疫细胞群。（N=3-4/组；**p<0.01）（B）注射模拟或mcIL-33的肝免疫细胞群抹布1−/−从lin中分离并耗尽小鼠+（第5页+，B220+，CD11b+，1级+, 7/4+、Ter119+)单元格。流式细胞术检测IL-7Rα和ST2的表达。门控IL-7Rα+/ST2型+进一步分析细胞CD45、Thy1.2、CD44、ICOS和Sca-1的表达。蓝色直方图代表同型对照。lin的数量−IL-7Rα+/ST2型+对照组或注射mcIL-33的肝脏细胞抹布1−/−老鼠。（N=4-8/组；***p<0.001）（C）4get的肝免疫细胞/抹布1−/−用PMA和离子霉素刺激小鼠4h。通过流式细胞术分析Sca-1和ICOS的表面表达和细胞内IL-13的表达（D）从5d对照组或经mcIL-33处理的小鼠中分离出总肝RNA，并用于RORα特异性qPCR分析。（E）分离自纯化肝ILC2的总RNA抹布1−/−用mcIL-33处理5d的小鼠用于RORα和RORγ特异性qPCR（*p<0.05）。（F）基于流式细胞术的lin定量−Sca-1型+国际博协+用来自WT或sg/sg小鼠的BM重组受照小鼠的细胞。（N=2-4/组）（G）lin的流式细胞术分析−，eGFP+、ICOS+CCL治疗4get小鼠4周后的肝细胞4.（H） Il1rl1号机组+/+WT或Il1rl1号机组−/−小鼠用CCL治疗4周4在分离肝免疫细胞并用流式细胞术分析其是否存在lin之前−Sca-1型+国际博协+细胞。数据代表了至少两个不同的实验，每组5只小鼠，结果相似。（一）CD1小鼠感染了约200曼索尼尾蚴或未感染。3周后用流式细胞仪测定小鼠肝脏ILC2数。（J）CD1小鼠感染~30曼索尼尾蚴。4周后，HD注射sST2表达构建物。4周后处死小鼠，测定肝脏ILC2数。肝Rora mRNA用qPCR定量。n=5/组*p<0.05）。

ILC2介导肝纤维化

IL-33治疗抹布1−/−小鼠肝脏中ILC2的数量高于WT小鼠（未显示），这与更严重的IL-33依赖性纤维化表型一致(图4D). 为了直接研究ILC2和肝组织重塑之间的可能联系，我们进行了耗竭和ILC2转移实验。ILC2计数可以在抹布1−/−αThy1.2（CD90.2）抗体治疗小鼠(图6A). IL-33给药前ILC2耗竭可显著降低IL-33依赖性肝纤维化(图6B)尽管αThy1.2治疗在mcIL-33给药2周后保护作用减弱(补充图6A). 此外，αThy1.2治疗抹布1−/−老鼠(补充图6B,图6C)和C57BL/6野生型小鼠(图6D)导致CCL显著降低4在第4周通过减少天狼星红染色和羟脯氨酸测定明显的依赖性纤维化。同样，慢性CCL患者ILC2耗竭4依赖性纤维化在抹布1−/−用Thy1.1中的T和B细胞重组小鼠+老鼠(图6E)导致纤维化相关基因表达减少行动1和倾倒1(图6F). 接下来，我们从Il1rl1号机组+/+老鼠进入Il1rl1号机组−/−小鼠，并用mcIL-33治疗这些小鼠。治疗4周后对肝组织的分析表明，ILC2治疗的小鼠（而非对照组）有明显的炎性细胞浸润和胶原沉积。相反，在接受mcIL-33治疗的患者中未观察到此类肝脏改变Il1rl1号机组−/−未接受ILC2的对照小鼠(图7A). 类似地，ILC2传输到Il1rl1号机组−/−模拟慢性肝细胞应激的TAA模型小鼠明显增加了肝纤维化程度(图7B). 此外，在门静脉内转移血吸虫卵形成肝肉芽肿的模型中(补充图7C)卵子引起的肉芽肿的大小Il1rl1号机组−/−当ILC2被过继转移时，小鼠的数量显著增加(图7C).

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ILC2是肝纤维化的重要介质

（A）天真无邪/抹布1−/−每隔一天用200μgαThy.1.2单克隆抗体治疗小鼠6天。林−电子GFP+国际博协+用流式细胞术分析肝脏细胞。（B）4个/抹布1−/−小鼠每3天用200μgαThy.1.2单克隆抗体治疗4周。在第6天，用mcIL-33对小鼠进行HD注射。用天狼星红染色法测定小鼠肝脏中的胶原沉积（n=5/组；**p<0.01）。抹布1−/− （C）或C57BL/6（D）小鼠每3d接受200μgαThy.1.2或对照单克隆抗体治疗4周。从第6天开始，每周两次用0.8 ml/kg CCL治疗小鼠4持续4周。用天狼星红染色法测定小鼠肝脏中的胶原蛋白沉积（n=5/组；**p<0.01）。比例尺=200μm。（E、F） 抹布1−/−小鼠静脉注射4×106提纯的Thy.1.1脾T细胞和B细胞+老鼠。7天后，每3天给小鼠注射200μgαThy.1.2单克隆抗体，持续4周。从第6天开始，每周两次用0.8 ml/kg CCL治疗小鼠4用天狼星红染色法测定小鼠肝脏中的胶原蛋白沉积。比例尺=200μm。肝脏mRNA行动1和倾倒1通过qPCR测定（N=6-7/组；**p<0.01；*p<0.05）。数据代表两个具有类似结果的独立实验。

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ILC2过继转移恢复肝纤维化

（A） Il1rl1号机组−/−小鼠静脉注射2×106分类，WT ILC2或仅盐水。24小时后用mcIL-33处理小鼠。通过天狼星红染色评估肝胶原含量（n=4/组；***p<0001）。（B） Il1rl1号机组−/−小鼠静脉注射2×106ILC2或生理盐水。随后，按照方法所述，用TAA腹腔注射小鼠4周。用天狼星红染色法评估肝胶原含量（n=5/组；p<0.01）。（C） Il1rl1号机组−/−小鼠静脉注射2×106ILC2.24小时后，向小鼠注射5000只新鲜分离的曼索尼卵通过门静脉系统。4周后处死小鼠，并在HE染色的肝切片中分析肉芽肿的形成。（n=3-4/组；p<0001）。（D） 第13页−/−小鼠静脉注射2×106来自WT Balb/c小鼠的ILC2。24小时后，通过HD给小鼠注射mcIL-33。通过天狼星红染色和羟脯氨酸测定法测定肝脏中的胶原沉积。（n=4/组；**p<0.01）。标尺200μm（A、B、D）或50μm（C）。数据代表了至少两个具有类似结果的独立实验。

鉴于此第13页−/−小鼠在很大程度上免受IL-33依赖性纤维化的影响(图3A)ILC2转移Il1rl1号机组−/−用编码中和IL-13Rα2-Fc融合蛋白的载体治疗的小鼠，其IL-33依赖性纤维化程度较低(补充图7A)，我们直接测试ILC2是否通过产生IL-13促进肝组织重塑。通过将野生型ILC2转换为第13页−/−我们证明，即使ILC2是唯一分泌IL-13的细胞类型，也足以介导纤维化(图7D). 相应地，其他ST2+产生IL-13的细胞系如嗜碱性粒细胞和肥大细胞对IL-33介导的疾病不太重要(补充图5 A、B)以及据报道由ILC2产生的其他细胞因子，如IL-9(Wilhelm等人，2011年)对IL-33依赖性纤维化的作用不如IL-13重要(补充图7B). 总之，这些数据表明IL-33依赖性ILC2在促进肝纤维化中起着关键作用。这些实验的结果表明，IL-33对ILC2的肝蓄积至关重要，ILC2通过IL-13依赖机制，对肝纤维化是必需的，也是足够的。

讨论

肝纤维化是慢性肝脏感染（如HBV、HCV或血吸虫病）的结果，也可能是由于持续的代谢或胆道失衡而发生的。无论潜在原因如何，人类和实验动物模型中的肝纤维化与炎症途径的持续激活密切相关。然而，将肝细胞应激与炎症、继而与肝纤维化的发生和发展联系起来的早期分子和细胞网络尚不明确。在这里，我们提出了令人信服的证据，即肝细胞应激时从肝细胞释放的IL-33是肝纤维化的关键介体体内我们发现，肝细胞释放IL-33导致产生IL-13的肝脏ILC2的激活和扩张，并确定了这些细胞在肝组织重塑过程中以前未被认识到的作用。

我们证明，血清和肝组织中IL-33蛋白浓度升高与人类肝纤维化状况有关，在不同的肝纤维化小鼠模型中也观察到了这一点，这与最近一项研究一致，该研究报道了IL-33过表达与肝纤维化的关联(Marvie等人，2010年). 重要的是，我们的数据提供了多条证据表明，在应激依赖性细胞损伤的情况下，肝内IL-33的释放与肝纤维化变化有关体内综上所述，这些结果为研究血清IL-33作为慢性肝细胞损伤和纤维化的可能非侵入性诊断生物标志物提供了理论基础；这些生物标记物可能有助于揭示早期炎症和纤维化事件，并可能补充现有的肝纤维化临床标记物。

为了解决IL-33对肝纤维化是否不仅足够，而且是必需的问题，在两种不同的肝纤维化模型中对IL-33缺乏的小鼠进行了挑战：CCL4和BDL。在这两个模型中，与野生型同窝出生的动物相比，IL-33缺乏的动物的胶原沉积显著减少。与胶原蛋白减少类似，IL-33缺乏小鼠ECM相关基因的表达也减少。总之，这些数据支持IL-33有助于严重肝纤维化的概念体内.

转录谱分析表明，IL-13是一种以前被描述为其他器官炎症和纤维化介质的细胞因子，是IL-33介导的肝纤维化过程中最显著上调的基因之一。的确，第13页−/−和Il4R型α−/−小鼠明显免受IL-33介导的疾病的影响，这表明IL-33和IL-13在疾病过程中构成了纤维化轴。我们的研究证实了IL-33-或IL-13-依赖于STAT6的肝脏激活，进一步支持了这一概念体内直接激活HSC的信号传导、增殖和基因表达在体外最近的一份报告表明，IL-13激活大鼠HSC中的STAT6和SMAD家族转录因子。通过这种机制，IL-13绕过了促纤维化转化生长因子-β（TGF-β）信号转导对HSC完全激活的要求(Liu等人，2011年). 与小鼠数据一致，我们已经证明，与对照组相比，人类肝硬化切片中功能性IL-13受体的两个组分IL-4Rα和IL-13Rα的肝蛋白表达升高。这表明人类纤维化肝病对IL-13依赖信号的敏感性增加，并表明小鼠和人类的原纤维化肝网络至少部分功能一致。综上所述，这些发现表明肝脏IL-33/IL-13轴促进HSC活化并触发有效的纤维生成反应。

许多不同的细胞类型被确定为IL-33刺激后产生IL-13的候选细胞(Liew等人，2010年). 虽然其他产生IL-13的细胞类型，如淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞，并没有显著作用，但我们在一系列体内实验一个γc依赖的非T细胞和非B细胞淋巴细胞群，该细胞群是我们系统中强大的IL-13产生者和重要的致病细胞类型。这些细胞依赖于转录因子RORα的表达，并表达ILC2的一组细胞表面受体，ILC2是最近描述的先天淋巴细胞亚群，在宿主防御病毒或寄生虫感染中发挥关键作用(Chang等人，2011年;Kang等人，2012年;Moro等人，2010年;Neill等人，2010年;Price等人，2010年;Saenz等人，2010年b). 通过给Thy1.2注射消耗性单克隆抗体减少ILC2数量与HD注射IL-33和慢性CCL后肝纤维化敏感性降低相关4挑战。此外，将从WT小鼠肝脏纯化的ILC2过继转移到IL-33无反应中Il1rl1号机组−/−在我们采用的不同模型中，小鼠恢复了该菌株对纤维化的敏感性，这表明肝内ILC2在促进IL-33介导的肝纤维化中起着关键作用体内据我们所知，本报告首次描述了ILC2在粘膜表面宿主防御领域之外的作用，并通过IL-33依赖性IL-13的产生确立了ILC2对肝组织重塑网络的作用。需要进一步的研究来阐明IL-33和ILC2在正常肝脏生理中的确切作用，尽管我们的研究结果表明，在正常肝功能的条件下，IL-33可能对肝脏ILC2的存活不是必不可少的。最近，研究人员描述了肝细胞中IL-33的上调以及IL-33/ST2信号在人类急性重症肝炎模型ConA肝炎中的保护作用(Arshad等人，2011年;Volarevic等人，2012年). 尽管在另一项研究中伊利33−/−小鼠对ConA肝炎没有表现出不同的易感性(Oboki等人，2010年)很容易推测IL-33可能在短暂损伤后的组织修复反应中发挥保护作用，而慢性肝细胞应激导致的持续IL-33释放会导致肝脏病理组织重塑，如本文所示。与这一观点一致，IL-33依赖性ILC2在急性流感感染期间促进早期肺组织内稳态(Monticelli等人，2011年)但也介导了严重的气道过度反应和哮喘(Barlow等人，2012年;Bartemes等人，2011年;Chang等人，2011年). 因此，ILC2可能已经进化为在组织损伤反应和宿主防御之间建立直接联系，以及一些定型T小时2-相关基因可能更准确地被视为协调宿主防御和组织重塑的双重作用因子。

最后，我们的研究结果验证了IL-33或IL-33依赖性ILC2反应的治疗调节概念，以治疗涉及慢性肝脏炎症和纤维化的疾病。

实验程序

动物和小鼠模型。C57BL/6，Balb/cJ，抹布1−/−、sg/sg和Il4Rα−/−（Balb/c背景）小鼠取自Jackson实验室。伊尔13−/−老鼠由A.McKenzie提供。4get/eGFP报告人(Mohrs等人，2001年)和Mcpt8Cre(Ohnmacht等人，2010年)小鼠取自D.Voehringer。伊利33−/−最近对老鼠进行了描述(Louten等人，2011年).Il1rl1号机组−/−小鼠最初从Shizuo Akira的实验室获得，并回交至C57BL/6背景10代。实验过程中使用8-12周龄、性别匹配的小鼠。慢性CCL48次腹腔注射CCL诱导依赖性肝纤维化4（默克公司），在矿物油（西格玛）中的浓度为0.8 ml/kg。为了诱发硫代乙酰胺（TAA）诱导的毒性纤维化，每周三次腹腔注射200 mg/kg的TAA（Sigma），持续四周。在一些实验中，胆汁淤积依赖性纤维化是在氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下通过手术结扎胆总管诱导的。假手术小鼠在不结扎的情况下接受剖腹手术。用于分析术后肝脏IL-33的表达血吸虫感染瑞士韦伯斯特小鼠被~176-200（高剂量）或~30（低剂量）感染曼索尼尾蚴(布兰克等人，2010年).

用于生成骨髓嵌合体2×107将来自供体小鼠股骨和胫骨的细胞静脉注射到致命照射（10Gy:C57BL/6；7,8Gy:Balb/c）受体小鼠。在一些实验中，给受体静脉注射200μl氯膦酸盐脂质体24小时，以耗尽Kupffer细胞(范·罗伊扬和范·凯斯特伦·亨德里克斯，2003年). 让小鼠恢复8周，然后向尾静脉注射mcIL-33。莱茵兰-法尔兹和米特尔弗兰肯政府批准了动物实验。

肝细胞分离程序

根据制造商说明（Miltenyi Biotec），用gentleMACS设备从实验小鼠中无菌取出肝脏，分离非实质性肝细胞。简单地说，在37°C的温和MACS C试管中，在含有5000 U胶原酶IV（Sigma）和30000 U/ml DNase I（Roche）的Krebs-Ringer溶液中消化肝脏2次，持续30分钟。随后，将细胞通过100μm的过滤网，并通过20g离心4分钟来去除剩余的肝细胞。

为了进一步纯化HSC，将悬浮在15%（w/v）碘xanol中的非实质性肝细胞颗粒覆盖在含有10%（w/v）碘xano和HBSS的溶液中，并按照前面所述在1400g下离心20分钟(Elsharkawy等人，2010年). 在低密度屏障的界面收集HSC。细胞分离后，立即通过紫外线下的自体荧光激发分析或FACS的自体荧光和CD45的阴性分析来检查分离的HSC的纯度。

为了进一步纯化免疫细胞群，将细胞悬浮在30%Percoll中，下面垫上100%Percoll，并在1400g下离心20分钟。收集、计数并处理界面上的细胞，用于FACS分析或细胞培养。在一些实验中，根据制造商的说明（Miltenyi Biotec），使用谱系细胞去除试剂盒富集ILC2群体。

流式细胞术

用以下荧光标记抗体的组合对来自肝脏的单细胞悬液进行染色（除非另有规定，均来自eBioscience）：别藻蓝蛋白结合的抗CD45（30-F11）、抗Sca-1（D7）、抗Thy1.2（53-2.1）、抗CD44（IM7）、，荧光素硫氰酸共轭抗T1-ST2（DJ8，MD Biosciences，瑞士祖埃里奇）、藻红蛋白共轭抗IL-13Rα1（13MOKA）、抗IL-13（eBio13A）、抗ICOS（7E.17G9）和Brilliant Violet 421-共轭抗IL-7Rα（A7R34）、抗小鼠血统马尾（Biolegend）。样品在LSRFortessa细胞分析仪（BD Biosciences）上进行测量，并使用Flowjo（Treestar）进行分析。

体内ILC2耗尽

使用来自BioXCell的小鼠抗Thy1.2单克隆抗体（克隆30H12）去除ILC2。200μg/只小鼠，每3天腹腔注射一次，如图例所示。

肝脏ILC2的过继转移

4get肝脏单细胞悬液/抹布1−/−使用mcIL-33治疗5天的小鼠，根据制造商的说明（Miltenyi Biotec）富集血统细胞-血统细胞耗竭试剂盒。用针对ICOS的PE结合抗体和针对Sca-1和4get/eGFP的APC结合抗体对细胞进行染色，使用FACSAria II细胞分选仪（Becton Dickinson）收集PE和Sca-1阳性细胞。通过静脉尾静脉注射将分选好的细胞过继转移到受体小鼠。

细胞因子和趋化因子测量

为了测定小鼠和人类IL-33，使用了研发系统的可溶性ST2-ELISA和IL-13特异性双套ELISA试剂盒。根据制造商的说明，使用小鼠流式细胞仪试剂盒（Ebioscience）测量细胞培养上清液和器官裂解液中的趋化因子浓度。

细胞增殖试验

用20 ng/ml rIL-13（德国威斯巴登研发系统公司）刺激分离的HSC 72 h，添加WST-1增殖试剂（Roche）（1:10稀释），然后在37°C培养4小时。在450 nm处测量吸光度。

统计分析

使用Graphpad 5软件（Prism）进行学生t测试或Mann-Whitney测试。使用95%的置信区间，P值<0.05被认为是显著的。

补充材料

Supp信息

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致谢

作者感谢D.Freytag、C.Lindner和A.Taut提供的出色技术援助。我们感谢美因茨大学医学中心病理研究所（PD Dr.Hansen）的帮助，感谢NIAID血吸虫资源中心的材料和技术支持。这项工作得到了DFG合作研究中心（SFB796）（发给T.M.、S.W.和M.F.N.）、ERC启动拨款（PAS_241506发给D.V.）、跨学科临床研究中心（IZKF）和埃朗根大学医学中心ELAN项目（发给S.W）的支持。

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