最佳：四分位的条形码启用排序

摘要

介绍

减数分裂基因定位，俗称四分体分析，是酵母遗传学的核心。简单地说，两个单倍体菌株，每个菌株都含有一个染色体拷贝，交配形成一个杂合子二倍体菌株，每个染色体有两个拷贝，每个亲本一个。饥饿的二倍体细胞会诱导减数分裂（孢子形成），在减数分裂中染色体复制、重排，并分裂为四个单倍体细胞（孢子或分泌物），每个亲本都有新的等位基因组合。一次减数分裂产生的四个孢子可以通过一种称为四分体分离的人工过程分离出来。

常规四分体剥离术^2,3自1937年首次出版以来，变化相对较小⁴，有三个目标。首先，减数分裂细胞（四分体）必须与营养细胞分离。在传统分析中，这是由一位研究人员完成的，他使用显微镜直观地识别琼脂平板上的四分体，使用微操作器设备直观地识别平板上的四分体，并使用微操作仪将四分体移动到平板的无细胞区域。其次，四分体中的四个孢子必须物理分离，以防止孢子间交配。四分体中的孢子由一个子囊、原始二倍体细胞壁的残余部分和一组粒间桥连接在一起⁵在传统的四分体分析中，子囊是通过酶消化去除的，研究人员使用微操作器打破孢子间的桥梁并将孢子分开。最后将单个孢子排列成网格状以保持孢子之间的关系，即一行四个子代中的所有子代都是同一原始四分体的姊妹孢子。一位经验丰富的酵母研究人员可以在大约15分钟内完成10个四分体的分离过程（通常接受的每个杂交的最小数量）。

我们开发了一种新的高通量四分体基因分型方法，我们称之为B类电弧码E类启用S公司排序T型trads（最佳）¹.BEST扩展了高通量遗传学中的现有方法，它能够生成大量的子代并进行基因分型，这些子代被分离、基因分型并作为个体进行维护，从而恢复所有四种减数分裂产物的姊妹孢子关系。这是通过三种主要策略实现的(图1). 首先是引入一种报告结构，该报告结构用GFP标记减数分裂细胞，并允许通过荧光激活细胞分选（FACS）将其分离。第二种是将高度复杂的DNA条形码（由15个随机核苷酸组成的字符串）以一种形式并入四分体的所有四个孢子，并可通过重组子代的DNA测序读取，从而识别同一四分体中的姊妹孢子。第三步是基因分型步骤，BEST与许多基因分型平台兼容，这些平台可以捕获一组基因组标记以及四分体特异性条形码。我们采用限制性位点相关DNA标签测序（RAD-seq）⁶将基因组测序导向特定限制位点的方法¹从而捕获了子代菌株基因组的2-3%以及质粒携带的条形码。四分体关系的恢复以及来自杂交的经验推导的基因分型数据允许准确推断缺失信息，包括低序列覆盖率标记的状态以及不可恢复（因此不可恢复）个体的完整基因型。在这里，我们描述了该方法在最常用的减数分裂作图微生物酵母中的应用酿酒酵母。然而，由于有机特定试剂的微小替代，例如不同的孢子形成特异性蛋白与GFP融合，该方法应该很容易转移到其他微生物，包括减数分裂定位明显更劳动密集或目前难以处理的生物体。

图1。 最佳方法。(A类)pCL2_BC质粒是一个2微米质粒，具有芽孢特异性GFP融合、G418抗性和15 mer随机条形码。质粒库的构建在Ludlow中描述等¹. (B类)一池条形码质粒从杂交转化为二倍体菌株。(C类)然后在选择的基础上培养转化株，并汇集约10000个转化菌落并形成孢子。在减数分裂过程中，四分体的每个孢子都会继承一个条形码质粒的拷贝。(天)四分体通过FACS从未污染的细胞中分离出来，收集在琼脂平板上，在那里消化并破坏，使每个孢子形成菌落。(E类)然后将菌落挑选成96个平板，进行表型分析和基因分型。在基因分型过程中，读取质粒条形码并用于识别每个四分体的四个成员。此图已从Ludlow修改等¹.请单击此处查看此图的放大版本。

协议

4.建立四分位分拣的FACS门

pCL2_BC质粒上减数表达的SPS2-GFP融合允许通过荧光检测孢子形成培养物中的四分体并从培养物中分离出来。以下协议是为FACSAria II开发的。

图2。 FACS闸门。一系列四个顺序的门用来分离四分体。图中所示的闸门(A类)和(B类)有助于减少结块的数量。选择荧光事件时，选通(C类). 中的直方图(天)有两个峰值。左峰的事件主要是四分体（左插图），右峰的事件通常是带有芽的四分体。最后一个门应用于此直方图，以选择主要是四分体（红色条）的事件。这张图是从勒德洛修改过来的，等¹.

1. 将孢子培养物装载到FACS分拣机上，并设置两个前向散射门和侧向散射门，以排除碎片、结块细胞和每个液滴的多个细胞(图2A和2B型).
2. 应该有一群荧光细胞，当使用SPS2-GFP标准报告结构包括二分体和四分体¹⁰将GFP与FSC进行比较，以包括这些荧光事件(图2C).
3. 根据应变背景，可能需要包括一个额外的门，以去除包括四分体和其他细胞的团块。如有必要，检查荧光事件的FSC直方图，并指定包含FSC较低事件的门(图2D，封闭事件显示为红色）。
4. 通过将~1500个四分体分类到显微镜载玻片上，并使用放大400倍的相差显微镜计算四分体与非四分体的比例，检查门控制度的效率。四分体的百分比可以通过仅计算约200个排序事件来准确估计，但排序~1500减少了在显微镜载玻片上搜索细胞所花费的时间。或者，可以在步骤4.5期间评估四分体与非四分体的比率。
5. 定期检查分拣机是否准确报告事件数量，方法是将25个四分体分拣到显微镜载玻片上，并使用放大400倍的相差显微镜检查液滴中的细胞。液滴中应有25个四分体。重复3-4次以评估FACS仪器的方差。

5.在琼脂平板上分类四分体

图3.在FACS分拣机上放置琼脂平板。为了将四分体分选到放置在标准（圆形）琼脂板中间的一小滴酶解液中，首先将标准（100mm矩形）96孔板放置在细胞分选机的台上，并对分选机编程以将四分体沉积到特定孔中（在这种情况下为D5）。然后，将圆形琼脂平板放在96号平板的顶部并对齐，使酶解酶滴集中在指定的微孔上。

1. 将所需数量的YPD+G418（200µg/ml）板在位于FACS分拣机附近的37°C培养箱中加热至少1.5小时。
2. 分选协议的一个关键特征是能够准确地将FACS分选的四分体定位到含有酶解液池的琼脂平板上的特定位置。为此，在分拣机的自动细胞沉积装置（ACDU）上放置一块“标志性”96摆板。准备一个分拣布局，将25个四分体分拣成96 well格式的一个井。选择靠近盘子中间的一口井，例如D5井。图3图中显示了一个培养皿和一个装载到细胞分选机上的96 well板。每盘25个四分体的菌落分离良好。
3. 从37°C培养箱中取出一堆10个琼脂平板，送到分拣机。
4. 取一块琼脂平板，用移液管将25μl酶解酶溶液（在0.7M山梨醇中1 mg/ml）移到平板中心附近的琼脂上。然后，将平板放在地标性96-well平板上，从步骤5.2开始将酶液滴对准靶孔，例如D5井。
5. 开始分类，将25个四分体放在琼脂平板上酶解液滴的中间。然后，拆下并盖住板。
6. 重复步骤5.4和5.5，直到25个四分体在堆叠中的每个板上被分为酶液滴。
7. 将含有四分体的板叠放回37°C培养箱。
8. 重复步骤5.3至5.7，直到所有板都有四分体。

具有代表性的结果

BEST可以大大提高从四分体中分离孢子的速度。作为该方法可提供的吞吐量的示例，一名研究人员在3小时内用149个琼脂平板进行了FACS分拣和孢子分离（步骤5.1至6.3）¹同等产量（约3725个四分体）需要90小时以上的手动解剖。然而，与许多高通量方法一样，与手动解剖相比，该方法的当前迭代有一些效率损失。这种损失表现为回收的菌落数量减少，与根据人工切割确定的杂交孢子存活率计算的期望值相比（步骤1.4）。假设孢子损失的原因（讨论）随机影响孢子，可以估计有多少个恢复的菌落将是四分体成员，其中1、2、3或4个孢子已被恢复(图4).

图4.四分体水平下方法效率的模拟。未能成功回收孢子（作为菌落）可能是由于孢子不可见、孢子粘附在玻璃珠上、未能将孢子彼此分离等原因。二项式分布用于计算产生4、3、，2个或1个菌落，基于成功回收的所有孢子的比例。这个图表可以作为最终组装成3或4孢子四分体的菌株数量的粗略指南。随着每盘菌落数的增加，完整四分体的数量也会恢复。

在上述实验中，来自一个孢子活力接近100%的杂交组合的25个四分体（通过手工切割确定）¹在149个琼脂平板上培养。在这个实验中，每个平板上观察到的最大菌落数为80个，表明20个孢子未能形成离散菌落。每个平板的平均菌落数为62个。从含有65个或更多菌落的61个培养皿中采集菌落并测序。在3700株通过测序质量控制的菌株中，72%可以通过计算分为3或4孢子四分体。

讨论

遗传学研究的许多领域，包括复杂性状图谱¹¹研究DNA重组的机制¹²需要极大量的子代和大量的DNA测序。将传统方法的力量与高通量DNA测序能力相结合的技术有可能实现以前难以解决的研究。尽管几种高通量酵母遗传学方法已被有效地应用于特定问题，但每种方法都有局限性，无法满足常规四分体分析的广泛适用性。BEST通过采用高通量方法结合四分体切割和酵母杂交后代的基因分型来解决这些挑战。结合多重RAD-tag测序，BEST提供了一种廉价的方法来收集每个子代菌株的基因型信息，同时通过独特的四分体条形码保存四分体关系。在所有当前使用的高通量方法中，BEST最能概括人工切割酵母杂交所提供的信息。

BEST有两个关键特性。第一种是使用FACS快速分离培养物中未受破坏细胞的四分体（方案步骤5-6）。分离数千个荧光事件（四分体）的能力为BEST带来了最大的吞吐量增益。由于视觉识别罕见事件所需的时间增加，对于孢子形成效率低的杂交组合，这种自动化比手动切割更具优势。第二个关键特征是使用高度复杂的分子条形码（协议步骤2），将其传输到四分体的每个姊妹孢子。由于这些条形码可用于计算重建随机分布在琼脂平板上的孢子之间的四分体关系，因此减少了在有序网格中手动排列细胞的需要。最后，由于分子条形码和芽孢特异性GFP报告基因是物理连接的（在同一质粒上），因此只有保留分子条形码的四分体才能通过FACS排序进行选择。

有两个考虑因素决定了培养物在产孢培养基中培养的时间长度。首先，因为孢子形成特异性报告基因(SPS2-GFP标准)在减数分裂早期表达，仅GFP不能区分完整的4孢子四分体和未完成减数分裂的细胞(即二人组）。虽然额外的FACS门控可能会减少荧光不完全四分体的数量，但减少这些不必要事件的最简单方法是简单地监测孢子培养（步骤3.3），并在新四分体停止形成后继续进行。在我们的实验中，二元排序的频率小于1%。第二，对于一些杂交组合，在RT条件下，在没有搅拌的情况下，在芽孢培养基中花费额外的时间（步骤3.4）显著改善了电镀过程中玻璃珠对四分体的分离（方案步骤6）。事实上，这一步对于打破某些交叉是绝对必要的。

与所有高通量方法一样，BEST比相应的传统方法“噪音更大”。与传统的四分体切割相比，BEST的效率略有下降，这可能是由多种因素综合作用的结果。一个因素是其他活孢子的损失增加，这可能是由于传播过程中粘附在玻璃珠上造成的，或者由于过程中的机械应力导致孢子死亡增加。第二个因素可能是减数分裂过程中简单的质粒丢失。第三个因素可能是混合基因型菌落导致可用菌落的有效减少，在我们的试验杂交中估计约5%的菌落¹这些菌落很可能代表姊妹孢子分离失败。由于快速荧光分选和孢子分离允许收集大量四分体，BEST配备齐全，可以克服这种规模的效率下降。虽然BEST的未来迭代可以提高接近手工切割的效率，但DNA测序能力的当前指数轨迹可能会快速补偿这种可用应变损失水平。无论如何，在BEST可以应用的范围内进行四分体分析的能力将使目前手工方法不可行的研究成为可能。

披露

作者没有什么要透露的。

致谢

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