癌症研究。作者手稿；PMC 2014年9月22日发布。
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血小板衍生生长因子D在前列腺癌进展中的潜在致癌活性
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卡罗琳·乌斯塔奇
1密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所病理学系
马库斯·陶布
1密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所病理学系
小牛顿·J·赫斯特。
1密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所病理学系
苏尼塔·巴加特
2密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所泌尿系
丹尼尔·邦菲尔
1密歇根州底特律韦恩州立大学医学院Barbara Ann Karmanos癌症研究所病理学系
2密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所泌尿系
迈克尔·谢尔
1密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所病理学系
2密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所泌尿系
露西娅·舒格
1密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所病理学系
Hyeong-Rhe Choi Kim先生
1密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所病理学系
1密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院Barbara Ann Karmanos癌症研究所病理学系
2密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院芭芭拉·安·卡马诺斯癌症研究所泌尿系
请求重印：Hyeong-Rhe Choi Kim，韦恩州立大学医学院病理学系，密歇根州底特律东坎菲尔德540号，邮编：48201。电话：（313）577-2407/0193；传真：（313）577-0057；ude.enyaw.dem@mikcrh 摘要
血小板衍生生长因子（PDGF）蛋白是细胞增殖/转化的有力刺激物，在细胞间通讯中起着重要作用。二十多年来，PDGFs被认为是作为三种二聚体多肽存在的（同型二聚体AA和BB以及异二聚体AB）。然而，最近在表达序列标签数据库的BLAST搜索中发现了PDGF C和D链。PDGF CC和DD二聚体具有独特的两区结构，带有NH2-末端CUB（补充子成分C1r/C1s、Uegf和Bmp1）域和COOH末端PDGF/血管内皮生长因子域。尽管分泌的PDGF AA、BB和AB很容易激活其细胞表面受体，但有研究表明，PDGF CC和DD的PDGF/血管内皮生长因子域需要去除CUB域的胞外蛋白水解酶才能激活PDGF受体。在本研究中，我们检测了潜在PDGF D转化为其活性形式的过程以及PDGF D-表达对前列腺癌进展的影响。我们发现LNCaP细胞将潜伏的PDGF DD自动激活到活性PDGF结构域，这可以诱导PDGF的磷酸化β-PDGF受体并以自分泌方式刺激LNCaP细胞增殖。此外，LNCaP-PDGF D条件培养基诱导前列腺成纤维细胞系1532-FTX迁移，表明LNCaP处理的PDGF DD也以旁分泌方式激活。在严重联合免疫缺陷小鼠模型中，PDGF DD的表达加快了前列腺癌生长的早期开始，并显著增强了前列腺癌细胞与周围基质细胞的相互作用。这表明PDGF DD在前列腺癌的发展和/或进展中具有潜在致癌活性。
简介
原发性前列腺癌生长缓慢，通常不会发展为临床相关疾病(1). 前列腺癌死亡的主要原因是转移，这是一个复杂的过程，涉及癌细胞通过基质成分侵入并在远处器官定植(2,三). 虽然肿瘤细胞和周围间充质细胞之间的旁分泌信号在肿瘤进展中起着关键作用，但这些相互作用的分子机制尚不清楚。
血小板衍生生长因子（PDGF）蛋白家族是细胞增殖、趋化性和转化的有力刺激因子，已知其在正常发育的细胞间通讯以及发病过程中发挥重要作用（参考文献综述）。4和5). PDGF亚型通过激活两种结构相关的细胞表面受体酪氨酸激酶发挥其生物学功能[α-PDGF受体（PDGFR）和β-PDGFR公司(4,6)]. 免疫组织化学分析显示，约80%的前列腺肿瘤组织在原发和转移部位都表达PDGFRs(7). 有趣的是，β-当内皮细胞暴露于表达PDGF的前列腺肿瘤细胞时，PDGFR染色在内皮细胞中更为显著(8)提示PDGF信号在前列腺癌旁分泌进展中的意义。在小鼠模型中，PDGFR抑制剂STI571（Gleevec）与紫杉醇联合使用可显著降低前列腺癌骨转移(8).
二十多年来，PDGFs被认为以三种二聚体多肽的形式存在（同型二聚体PDGF AA和BB以及异型二聚物PDGF AB）。PDGF A链可以激活α-仅PDGFR，而PDGF B链激活两者α-和β-PDGFR公司(4,6). 然而，最近在国家生物技术信息中心的表达序列标签数据库的BLAST搜索中发现了PDGF C和D链(9——11). PDGF C和D链具有独特的双域结构，带有NH2-末端CUB（补充子成分C1r/C1s、Uegf和Bmp1）域和COOH末端PDGF/血管内皮生长因子域。尽管分泌的PDGF AA、BB和AB可以很容易地激活其细胞表面受体，但有人认为，需要去除CUB结构域的胞外蛋白水解作用才能优先激活PDGF CC和DD二聚体的生长因子结构域αα-PDGFR和ββ-分别为PDGFR(9——11).
虽然PDGF A和B介导的导致特定细胞过程的信号转导途径已被广泛研究，但对新家族成员PDGF C和D的功能知之甚少。在卵巢、肺、肾和胶质瘤衍生细胞系以及临床肿瘤样本中发现PDGF D的表达增加，提示PDGF D表达增加与人类癌症之间存在相关性(12,13). 因为β-PDGFR被认为对前列腺癌的进展至关重要，而PDGF D是前列腺癌的特异性配体β-PDGFR，我们检测了PDGF D表达对前列腺癌细胞生长的影响及其与基质细胞的相互作用。而之前的研究表明，潜在PDGF DD的活性形式需要血清中的蛋白酶(9,10)在本研究中，我们发现人类前列腺癌LNCaP在无血清条件下将潜在PDGF DD转化为活性形式，从而促进LNCaP的生长。此外，LNCaP细胞产生的PDGF DD可诱导前列腺成纤维细胞系TFX-1532的细胞运动，表明PDGF DD的旁分泌信号在癌细胞和间充质细胞之间的相互作用。我们还发现，在严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠模型中，PDGF DD的表达大大增强了前列腺癌细胞与周围基质层的相互作用，证明了PDGF D在人类前列腺癌进展中的潜在致癌活性。
材料和方法
重组PDGF D蛋白的制备
采用两步逆转录-PCR方法将PDGF D克隆到痘苗表达载体中。使用Trizol试剂从前列腺细胞系DU145中分离的总RNA用于使用SuperScript RTII（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行cDNA合成反应。将所得cDNA用于第一次PCR反应，得到2107-bp的产物，其中包含PDGF D的1113-bp开放阅读框（正向，5′-gga-gcgacgctcctctcta-3′；反向，5′-ttttccagt-tacgtcgatg-3′）。该PCR产物被凝胶纯化，并用作第二个PCR反应的模板，该反应旨在添加限制性内切酶位点Afl公司III和Bcl公司分别位于PDGF D开放阅读框的5′端和3′端，以及在PDGF D-蛋白的羧基端添加6×HIS表位标签（正向，5′-cacatgtcgcgctcattt-3；反向，5′-Cacatctgat-caaatatggtgatggtgattcgaggtgtcttga-3′；6×HIS标签是下划线的). 将得到的1150-bp产物用Afl公司III和Bcl公司I、 并插入Nco公司我/巴姆痘苗病毒表达载体pTF7-ECM1的HI位点（韦恩州立大学R.Fridman博士赠送的礼物）。pTF7-ECM1包含T7启动子上游的Nco公司我/巴姆HI克隆位点；因此，插入基因的转录需要T7聚合酶的存在，该聚合酶由重组痘苗病毒感染细胞提供。DNA测序证实了编码PDGF D：HIS融合蛋白的帧内序列的保真度（Elim Bioparmaceutics，Inc.，加利福尼亚州旧金山）。该质粒被称为pTF7-PDGF D:HIS，并根据已建立的痘苗病毒协议用于生产重组全长PDGF D(14). 简而言之，BS-C-1（绿猴肾）细胞首先感染表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3。感染30分钟后，用PBS冲洗细胞，然后使用效应试剂（Qiagen）转染质粒pTF7-PDGF D:HIS。插入pTF7质粒的PDGF D的表达依赖于表达T7 RNA聚合酶基因的vTF7-3对细胞的感染。细胞宿主机器然后转录感兴趣的基因。在痘苗病毒和PDGF D共同感染/转染48小时后，收集无血清条件培养基（CM），并在2000×克在随后的PDGF D加工实验中使用合成的含有CM的重组全长PDGF D。
哺乳动物PDGF D表达载体的构建
将PDGF D插入哺乳动物表达载体pcDNA三，pTF7 PDGF D:HIS（如前一段所述）用作与引物（正向，5′-ctgtgcttaagatgcaccggctc-3′；反向，5′-catgctgatcaaaatggtgatggtgatgatgtgatgtgatcgcgtgtgtca-3′）进行PCR反应的模板，以添加Afl公司II站点位于5′端，并恢复Bcl公司我站在PDGF D的3′端：HIS开放阅读框。随后将1150-bp PCR产物用Afl公司II和Bcl公司I并插入Afl公司二、，巴姆哺乳动物表达载体pcDNA3.1（+）（Invitrogen）的HI位点。这个质粒被称为pcDNA三-PDGF D:HIS，用于建立稳定的转染细胞系LNCaP-PDGF D。
细胞培养
将人前列腺癌LNCaP细胞及其转染株培养在5%湿化CO中2含有RPMI 1640的培养箱，补充有5%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100 mg/ml链霉素（加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）。培养基和培养箱条件与人前列腺成纤维细胞系1532-FTX相同，只是培养基中添加了10%胎牛血清。
PDGF D高表达人前列腺癌LNCaP细胞系的建立
pcDNA转染LNCaP细胞三-PDGF D:HIS和pcDNA三使用350选择空向量μRPMI 1640中的基因素（G418）与10%胎牛血清混合在一起，分别称为LNCaP-PDGF D和LNCaP-neo。通过逆转录聚合酶链式反应证实PDGF D的过表达如下：使用Trizol试剂（Invitrogen）从细胞中提取总RNA。一个μg来自每个细胞系的总RNA用于使用Superscript RTII（Invitrogen）合成cDNA。结果cDNA作为PCR反应的模板，使用Taq聚合酶（Promega，Valencia，CA）和以下引物：正向，5′-gaacagctacccagaacc-3′；反向为5′-cttgttccaccatcgtc-3′。这些引物扩增出一个192-bp的产物，该产物代表PDGF D蛋白的CUB编码区的一部分。该引物对不允许区分内源性和外源性表达的PDGF D。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达被用作阳性对照，引物对5′-atcaccttccagcga-3′（正向）和5′-gccagtagcttccga-3’（反向）。
PDGF D生长域的定制抗体（Ab）
使用合成肽（N′-RKSKVDLDRLNDDAKRYS-C′）在兔子体内培育PDGF D抗体，合成肽代表PDGF D生长因子结构域的一部分（氨基酸254–272）。合成的抗体经过亲和纯化（佐米德生物医学公司，加利福尼亚州南旧金山），被称为抗PDGF D/GD抗体。
PDGF D介导的旁分泌激活β-PDGFR和细胞外信号调节蛋白激酶（ERKs）
LNCaP-PDGF D和LNCaP-neo细胞在无血清培养基中培养48小时。收集CM并以2000 rpm离心5分钟以清除细胞碎片。用从LNCaP-PDGF D或LNCaP-neo细胞中收集的CM处理血清饥饿的NIH3T3细胞10或60分钟，并在免疫沉淀分析裂解缓冲液中进行裂解【0.5%脱氧胆酸钠、1%NP40、50 mM Tris（pH 7.6）、2 mM EGTA、2 mM-EDTA、150 mM NaCl、2 mM.钒酸钠、1 mM苯甲基磺酰氟、10μg/ml leupeptin和10μg/ml抑肽酶]。以12000×克用BCA蛋白质测定试剂盒（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德）测定蛋白质浓度。裂解液（250μg） 用于与抗-β-PDGFR抗体[Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）或癌基因研究产品（加州圣地亚哥）]和蛋白质G-琼脂糖珠（皮尔斯生物技术）。免疫沉淀用免疫沉淀分析缓冲液洗涤五次，并通过还原SDS-PAGE进行溶解。酪氨酸磷酸化β-使用抗磷酸酪氨酸抗体（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY）通过免疫印迹检测PDGFR。免疫沉淀总水平β-PDGFR用免疫沉淀用的相同抗体检测。确定ERK1/2、50的总水平和激活水平μ通过还原SDS-PAGE溶解每个样品中的g裂解物，并根据制造商的说明（马萨诸塞州贝弗利Cell Signaling Technologies）使用抗pERK1/2或抗ERK1/2抗体进行免疫印迹。
scid/scid小鼠的肿瘤生长
LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D细胞生长到80-90%的融合处，通过胰蛋白酶/EDTA消化获取，并用PBS洗涤两次。细胞在无血清RPMI 1640中重新悬浮，并通过台盼蓝排除法计数活细胞。将100万个细胞皮下注射到5周龄雄性纯合子c.B.-17 scid/scid小鼠（纽约州日耳曼镇塔科尼农场）。在为期2周的实验中，每只动物注射1×106左侧的细胞。肿瘤尺寸太小，无法用卡尺可靠测量；因此，在2周后处死动物，解剖发育中的肿瘤。在为期5周的实验中，六只动物接受了两次1×10的皮下注射6每周用卡尺通过二维测量（mm）评估细胞/注射、每侧一次注射和肿瘤生长。肿瘤体积由以下公式估算一×b条2/2，其中一是最长的尺寸，并且b条是宽度。使用GraphPad Instat Version 3 for Windows（GraphPad-Software，San Diego，CA）程序对肿瘤体积（平均值和SE）进行统计分析。根据NIH制定的实验动物护理和使用指南对小鼠进行饲养。
伤口迁移分析
细胞在6孔板中的完全培养基中生长至90%的汇合处，并用丝裂霉素C（25μg/ml）持续30分钟，然后使用2mm宽的塑料吸管尖端制作损伤线。用PBS冲洗后，让细胞在适当的培养基中迁移，并在指定的时间点拍摄照片（×40）以评估细胞运动。
细胞迁移分析
所有细胞迁移分析均使用带有聚碳酸酯过滤器（康宁Costar，Cambridge，MA）、涂有I型胶原蛋白（Sigma，St.Louis，MO）的20周Transwell装置。为了确定1532-FTX细胞在CM存在下的迁移，在微孔的下部填充600个μl合适的培养基，5×104将细胞放置在Transwell的上部并孵育12 h。为了确定LNCaP-neo或LNCaP-PDGF D在1532-FTX细胞存在下的迁移，1532-FTX细胞在24孔板中生长到90%的汇合处，然后将培养基更换为无血清培养基。LNCaP-neo或LNCaP-PDGF D细胞（5×104)然后放置在Transwell装置中，并放置在井底部无血清培养基中含有1532-FTX细胞的井中。细胞共培养48小时。按照以下方式制备所有检测的过滤器：用甲醇固定细胞，用苏木精染色10分钟，然后短暂地进行伊红染色。用棉签擦拭，以机械方式去除过滤器上表面的细胞。用显微镜在×400处测定移向滤池下侧的细胞总数。
组织学
在使用异氟烷的麻醉下，通过颈椎脱位注射细胞5周后处死小鼠。将肿瘤和周围的小鼠组织解剖并固定在10%的福尔马林缓冲液中，包埋在石蜡中，切片并用H&E染色进行组织学分析。
结果
人前列腺癌LNCaP将PDGF D转化为活性生长因子域
为了检测PDGF D表达对人前列腺癌细胞生长和致瘤性的影响，按照“材料和方法”中的描述建立了LNCaP-PDGF D-和LNCaP-neo细胞系。通过逆转录-PCR分析证实了PDGF D在LNCaP-PDGF-D中的过表达()以及使用抗PDGF D/GD抗体进行免疫印迹分析(). 以前的研究表明，当PDGF D表达载体转染到人类胚胎肾（HEK 293）细胞时，在无血清条件下，HEK 292细胞只分泌全长PDGF D-蛋白；HEK 293分泌的前PDGF D被血清中未知蛋白酶加工成活性生长因子二聚体(10). 然而，令人惊讶的是，在没有血清的情况下，对从LNCaP-PDGF D细胞中收集的分泌蛋白进行免疫印迹分析，结果显示两种蛋白的原形成(M（M）第页50000）和处理过的表单(M（M）第页20000和15000），大小与报告的生长因子单体相似(9,10)在还原条件下使用抗PDGF D/GD抗体检测到().
血小板衍生生长因子（PDGF）D在LNCaP中的过度表达和处理。A中，亲代LNCaP中PDGF D的RNA水平(车道1)，LNCaP-neo(2号车道)和LNCaP-PDGF D(3号车道)使用扩增内源性和外源性PDGF D的引物（见“材料和方法”）通过逆转录-PCR对细胞进行检测。包括无模板的阴性对照(4号车道).B、，LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D细胞在完全培养基中生长至100%融合，用PBS洗涤一次，然后在无血清培养基中培养48h。收集所得条件培养基，并在还原条件下使用SDS-PAGE分解蛋白质。用抗PDGF D/GD抗体免疫印迹法检测条件培养液中的PDGF D。FL-M中，全长PDGF D原蛋白单体；GD-M、，PDGF D生长因子域单体。
上述结果表明，在人前列腺癌LNCaP细胞中表达的蛋白酶可以将pro-PDGF D蛋白加工成生长因子结构域，而不依赖于血清。为了检测LNCaP细胞产生的蛋白酶对PDGF D的处理，使用“材料和方法”中所述的痘苗哺乳动物细胞表达系统生成rPDGF D-蛋白。当BS-C-1细胞与痘苗病毒和pTF7-PDGF D:HIS共同感染/转染后，在无血清培养基中培养时（参见“材料与方法”)，只检测到前PDGF D蛋白，以二聚体形式迁移M（M）第页在非还原条件下为~90000，作为单体M（M）第页还原条件下约50000(，左侧面板). 与以前的报告一致(9,10)，pro-PDGF D蛋白在血清中被加工到生长域，作为二聚体迁移M（M）第页约35000种，作为单体物种M（M）第页20000和15000(，右侧面板). 利用rPDGF D，我们检测了pro-PDGF D是否能被分泌蛋白酶或LNCaP细胞产生的细胞表面/细胞周蛋白酶加工。然而，从LNCaP细胞收集的CM含有很少的能够处理rPDGF D的蛋白水解酶(，右侧面板)，rPDGF D与LNCaP neo细胞的孵育导致rPDGF D的切割，这表明细胞表面或细胞周蛋白酶可能负责将前PDGF D加工成生长因子结构域(，左侧面板). 人们注意到，rPDGF D被加工成几个具有M（M）第页约25000由LNCaP-neo细胞产生的蛋白酶产生，而两个主要单体物种M（M）第页从LNCaP-PDGF D细胞收集的CM中通常检测到20000和15000个(). 接下来，我们检查了rPDGF D是否更有效地被加工成M（M）第页与LNCaP neo细胞相比，LNCaP-PDGF D细胞中存在20000和15000个单体。如所示，而rPDGF D主要处理为M（M）第页与LNCaP-neo细胞孵育4小时后，25000个片段被更有效地加工成生长因子域(M（M）第页25000、20000和15000）。这表明负责PDGF D处理的蛋白酶表达或其激活，通过LNCaP-PDGF D细胞中PDGF D-信号的组成性激活而上调。
血小板衍生生长因子（PDGF）D在细胞表面/附近进行处理。A中，用痘苗病毒vTF7-3和质粒pTF7-PDGF D:HIS共同感染/转染BS-C-1细胞。共感染/转染后，细胞在无血清培养基或胎牛含血清培养基（如图所示）中生长48小时。从感染细胞中收集条件培养基（CM），并在还原或非还原条件下使用SDS-PAGE进行溶解，如图所述。为了获得条带的最佳分辨率，无血清CM在10%SDS-PAGE凝胶上运行，含胎牛血清CM在14%SDS-PACE凝胶上运行。B、，重组PDGF D(rPDGF D型)与缺乏血清的LNCaP-neo细胞孵育(左侧面板)或用从缺血清LNCaP-neo细胞中收集的条件培养基培养48小时(右侧面板)在37°C下持续4或24小时。对照实验包括在不存在rPDGF D的情况下(车道1在两个面板中）。所有样品在还原条件下在SDS-PAGE凝胶上分离，并使用抗PDGF D/GD抗体通过免疫印迹分析。C、，在缺乏或存在rPDGF D的情况下培养血清饥饿的LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D细胞4小时，然后从细胞中收集培养基并在还原条件下在SDS-PAGE凝胶上溶解，并使用抗PDGF D/GD抗体分析免疫印迹。**，加工rPDGF D的中间形式。FL-D、，全长PDGF D原蛋白二聚体；FL-M、，全长PDGF D原蛋白单体；GD-D、，PDGF D生长因子结构域二聚体；GD-M、，PDGF D生长域单体。
为了测试PDGF D的加工形式是否具有生物活性，用从LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D中收集的CM处理血清饥饿的NIH3T3细胞β-PDGFR蛋白用抗β-PDGFR抗体和活性形式通过使用抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹分析检测。作为阳性对照，还用浓度为50 ng/ml的重组PDGF BB蛋白处理血清饥饿的NIH3T3细胞。如,β-用LNCaP-PDGF D CM治疗10或60分钟以及用重组PDGF-BB蛋白治疗10分钟，PDGFR很容易被激活，而用LNCaP CM未检测到明显的激活β-PDGFR的激活，我们还检测了其下游信号分子ERKs的激活。如所示LNCaP-PDGF D CM处理的ERK磷酸化效果与PDGF-BB处理的效果一样，而LNCaP-neo-CM对ERK的磷酸化几乎没有影响。这些结果表明，LNCaP-PDGF D细胞产生的PDGF D的生长因子域可以激活其同源受体，β-PDGFR，转导其下游信号通路。
LNCaP处理的血小板衍生生长因子（PDGF）D具有生物活性。A中，用来自LNCaP-PDGF D的5 ml条件培养基（CM）刺激血清饥饿的NIH3T3细胞(车道3和6)或LNCaP-neo(车道4和7)用5 ml无血清培养基（补充25 ng/ml PDGF BB）刺激缺乏血清的NIH3T3细胞10或60分钟，作为阳性对照(车道1)和无血清培养基刺激的细胞(旧金山)作为阴性对照(车道2和5).β-PDGF受体从250μg裂解物，如“材料和方法”中所述。通过还原SDS-PAGE分解产生的免疫沉淀物，并用指示的抗体（Abs）进行免疫印迹分析。然后去除污渍并用抗-β-PDGF受体抗体测定免疫沉淀效率。B、，50μ用25 ng/ml PDGF BB处理NIH3T3细胞的裂解液g(车道1)，无血清培养基(2号车道)，LNCaP PDGF D CM(3号车道)，或LNCaP-neo CM(4号车道)通过还原SDS-PAGE进行解析，并使用对活性细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2特异的抗体进行免疫印迹分析(pERK1/2型). 为了确定ERK1/2的基本水平，将相同的印迹剥离，并用识别ERK1/2活性和非活性形式的抗体进行免疫印迹。
PDGF D促进LNCaP细胞增殖
要评估在体外PDGF D的有丝分裂活性通过自分泌机制，我们检测了正常生长条件下LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D的生长速率。在培养的前24小时内，LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D均未显著增加其细胞数量。然而，LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D之间的细胞数量在培养基被这些细胞调节48小时后观察到显著差异。而LNCaP-neo细胞几乎是细胞数量的两倍，而LNCaP-PDGF在正常培养基中48小时后细胞数量增加了3-4倍()表明前列腺癌细胞中PDGF D的表达通过自分泌机制具有促生长活性。
血小板衍生生长因子D以自分泌方式促进细胞生长。将细胞（6000个细胞/孔）置于96 well板中，LNCaP-PDGF D（■）和LNCaP-neo的相对细胞数(
)使用{4-[3-（4-碘苯基）-2-（4-硝基苯基）-2测定H（H）-5-四唑啉基]-1-3苯二磺酸盐}（WST）测定（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany）。
PDGF D促进小鼠前列腺肿瘤早期生长并刺激前列腺癌细胞与基质细胞的相互作用
上述研究表明，肿瘤细胞衍生PDGF D以自分泌方式促进肿瘤细胞生长。这些影响可能是暂时的在体外或可能导致深刻的差异体内致瘤性和/或与表达PDGFR的基质细胞的相互作用。要检查体内将人前列腺癌中PDGF D表达的影响、LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D细胞皮下注射到雄性SCID小鼠的侧面（1次注射/只动物）。当在注射后2周处死的小鼠中检查肿瘤结节的形成时，五种注射中只有一种是由LNCaP-neo细胞形成的，而五种动物中有五种是由L NCaP-PDGF D细胞形成的（20%）与100%;). 为了进一步检查肿瘤结节的发生及其生长，将LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D细胞皮下注射到另外六只动物的左右侧翼（每只动物注射2次），每周监测肿瘤发生率和大小。5周后，LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D之间的肿瘤发病率差异变得不明显（80%与100%;)，这两个细胞系的平均肿瘤体积相似(). 这些结果表明，与LNCaP-neo肿瘤相比，LNCaP-PDGF D肿瘤的肿瘤结节出现时间缩短了10-14天，但这两种细胞系之间的总体肿瘤发病率和肿瘤体积相似。
与LNCaP-neo肿瘤相比，LNCaP-PDGF D肿瘤的发生加速。A中，1 × 106将细胞注射于雄性重症联合免疫缺陷小鼠的侧腹，检测肿瘤发生率。为了确定2周的发病点，每只小鼠注射一次，每组共5只小鼠（共5次注射/细胞系）。由于肿瘤在2周时无法触及，处死小鼠，解剖皮肤以观察小结节的出现。为了确定5周内的肿瘤发生率，第二组小鼠被给予2次注射/只小鼠，6只小鼠/组（总共12次注射/细胞系）。在第4周和第5周检查可触及的肿瘤。B、，肿瘤生长以平均肿瘤体积表示。误差线表示±SE。
检测肿瘤细胞衍生PDGF D表达对宿主基质细胞反应的影响体内注射后5周采集LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D肿瘤组织，切片并用H&E染色。LNCaP-neo肿瘤的组织学检查显示一个实体瘤块，包被良好并与小鼠间质组织分离(). 相反，LNCaP-PDGF D肿瘤与小鼠基质细胞有密切的相互作用()提示PDGF D在肿瘤细胞和局部间充质细胞之间密切相互作用中发挥作用。在所检查的八个LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D异种移植物的两个不同切片中，所有LNCaP-PDGF D切片，但没有一个LNCa P-neo切片显示与基质细胞的肿瘤相互作用显著增加，这一事件已知对导致转移的癌症进展至关重要。值得一提的是，在组织学检查时，由LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D形成的异种移植物的平均重量具有可比性（1.5与分别为1.3 g），表明PDGF D介导的间质-上皮相互作用与其促生长活性没有直接关联。
与LNCap-neo肿瘤相比，LNCap-PDGF D肿瘤中观察到的肿瘤-基质相互作用增加。注射后5周取出肿瘤，固定、切片并用H&E染色。A中，LNCaP-新肿瘤；B、，LNCaP-PDGF D肿瘤。星号表明肿瘤-基质相互作用。
LNCaP处理的PDGF D以旁分泌方式增强前列腺成纤维细胞的细胞运动并诱导LNCaP以次级旁分泌方式迁移
我们接下来研究PDGF D是否以旁分泌方式刺激前列腺成纤维细胞迁移和/或以自分泌方式促进人类前列腺癌细胞的迁移表型。如所示与从LNCaP-neo收集的CM治疗相比，在存在从LNCaP-PDGF D收集的CM的情况下，人前列腺成纤维细胞1532-FTX的细胞运动显著诱导。为了确保LNCaP-PDGF D CM诱导的1532-FTX迁移不会因细胞增殖率增加而引起，使用丝裂霉素C（S期细胞周期阻断剂）预处理的细胞进行伤口迁移试验(15). 然后，我们使用Transwell室通过迁移分析定量细胞运动。与无血清培养基条件相比，在LNCaP-neo CM存在下观察到1532-FTX细胞迁移的诱导率小于2倍，而在LNCaP-PDGF D CM存在下检测到约10倍的诱导率(). 这些结果表明，PDGF D介导的间质-前列腺癌相互作用涉及周围间质细胞以旁分泌方式迁移。
血小板衍生生长因子（PDGF）D以旁分泌方式诱导人前列腺成纤维细胞的细胞运动。A中，伤口愈合试验。TFX-1532细胞生长到100%融合，然后用丝裂霉素C预处理30分钟以防止细胞增殖。制作损伤细胞系，在LNCaP-neo条件培养基或LNCaP-PDGF D条件培养基中培养细胞。照片是在指定的时间点拍摄的。B、，1532-FTX细胞迁移分析使用Transwell。培养12小时后计数迁移细胞。数据点表示迁移到过滤器底部的单元格的平均总数；实验一式三份，P（P）<0.05，由学生确定t吨测试。
当用Transwell小室试验检测LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D的细胞运动时()以及伤口愈合测定（数据未显示），没有检测到显著差异，这表明PDGF D的表达以自分泌的方式对人类前列腺上皮细胞的运动几乎没有影响。接下来，我们询问在前列腺成纤维细胞存在的情况下，前列腺上皮细胞是否产生PDGF D诱导上皮细胞迁移。为此，在微孔底部存在前列腺1532-FTX成纤维细胞的情况下，通过Transwell小室试验检测LNCaP-neo和LNCaP-PDGF D的细胞迁移。重要的是，与1532-FTX细胞存在时LNCaP-neo的迁移相比，LNCaP-PDGF D的迁移显著诱导(). 综上所述，这些结果表明前列腺癌产生的PDGF D在基质细胞中诱导PDGFR介导的信号转导途径，导致趋化分子的分泌，进而以次级旁分泌方式诱导前列腺细胞运动。
血小板衍生生长因子D在人前列腺成纤维细胞存在时以次级旁分泌方式诱导LNCaP细胞运动。将LNCaP-neo或LNCaP-PDGF D细胞置于Transwell室过滤器顶部，在无血清培养基中无1532-FTX成纤维细胞或有1532-FTX成纤维细胞的情况下培养48小时。数据点表示迁移到过滤器底部的单元格的平均总数；实验一式三份，P（P）<0.05，由学生确定t吨测试。
讨论
当猴肉瘤病毒的癌基因v-sis与PDGF-B同源92%时，PDGF在肿瘤发生中的致病作用被提出(6,16,17). 过去二十年的研究一直明确表明PDGF在包括胶质瘤在内的人类肿瘤中的重要性(18——20)、皮肤纤维肉瘤(21,22)、神经纤维瘤(23)，骨髓单核细胞白血病(24)还有成骨细胞瘤和骨肉瘤(25).体外，v-sis癌基因产物（p28v-sis）或PDGF B在表达其受体的细胞中的过度表达增强了转化，表明肿瘤发生中的自分泌机制(26,27). 除了自分泌机制外，最近的研究揭示了旁分泌PDGF信号在涉及上皮-基质相互作用的致癌过程中的关键作用。使用裸鼠，证明PDGFR激活基质细胞可导致永生人类角质形成细胞的致瘤转化(28). 越来越多的证据表明，基质和上皮之间的异常相互作用对乳腺上皮的肿瘤进展至关重要(29,30)PDGF被认为是关键的调节剂(31——34). PDGF B蛋白和mRNA的表达仅限于乳腺上皮和肿瘤细胞，而在所有检查的乳腺组织的基质细胞群中检测到膜性PDGFR免疫染色(32). PDGFR染色特别局限于乳腺癌上皮周间质，提示乳腺癌细胞对邻近间质组织的旁分泌刺激(32). 与乳腺癌类似，在结直肠癌和小细胞肺癌中也观察到旁分泌机制(35,36).
本研究揭示了PDGF D介导的潜在致癌活性β-PDGFR在人类前列腺癌中的自分泌和旁分泌方式。与我们的假设一致，以前的研究表明大约80%的前列腺肿瘤组织在原发和转移部位都表达PDGFR(7)以及使用Gleevec抑制PDGFR信号在小鼠模型中显著降低前列腺癌骨转移(8). 有趣的是，尽管α-PDGFR及其同源配体PDGF A仅在前列腺上皮内瘤变和腺癌中检测到β-PDGFR（而非其配体PDGF B）在前列腺癌的晚期表达(37,38). 这些前列腺癌细胞表现出典型的β-PDGFR激活，表明除PDGF B外，另一种配体可能在β-前列腺癌进展过程中PDGFR信号转导。最近发现PDGF D是一种特殊的β-PDGFR和我们目前的研究表明PDGF D参与人类前列腺癌的发展和/或进展。
许多研究人员报告了一种更有效的转化信号β-PDGFR比通过α-PDGFR公司(26,39,40). 虽然PDGF AA和BB都是强有丝分裂原，但只有PDGF BB能诱导小鼠成纤维细胞的表型转化。细胞信号传递中的一个基本问题是“两种结构相关的细胞表面受体酪氨酸激酶(α-和β-PDGFR）经常使用重叠的信号通路介导不同的细胞过程？”为了解决这个问题，我们以前建立了NIH3T3克隆，其中α-PDGFR信号被显性负性抑制α-PDGFR或反义结构α-PDGFR公司(41). 我们发现抑制α-PDGFR信号增强PDGF BB介导的表型转化，表明α-PDGFR拮抗β-PDGFR诱导的转化。鉴于两者α-和β-受体有效激活ERK，α-PDGFR，但不是β-PDGFR激活应激活化蛋白激酶-1/c-Jun NH2-末端激酶-1（JNK-1）。使用显性负性JNK-1突变体抑制JNK-1活性可显著增强PDGF BB介导的凤尾鱼非依赖性细胞生长，表明其对α-PDGFR在PDGF诱导的转化中激活JNK-1。这些结果揭示了PDGF信号的一个显著特征：PDGF生长信号的特异性和强度由α-PDGFR介导生长刺激和抑制信号的同时激活。随着新的PDGF配体的发现，PDGFR信号不仅通过PDGF A激活α-PDGFR和PDGF B激活α-和β-PDGFR，也可通过PDGF C激活α-PDGF和PDGF D激活β-PDGFR。最近，研究表明PDGF DD二聚体激活ββ-PDGFR，不是αα-PDGFR，但它可以激活α-PDGFR通过与β-PDGFR公司[αβ-PDGFR公司(9,10)]. 因此，为了更好地理解PDGF信号在人类癌症进展中的作用，与激活所有三种形式PDGFR的PDGF-BB诱导的特征更好的通路相比，揭示PDGF DD诱导的信号转导通路和致癌活性尤为重要(αα,αβ、和ββ).
PDGF D的独特结构，需要对CUB结构域进行蛋白水解裂解，以激活生长因子结构域β-PDGFR在PDGF信号中实现了另一级别的调节。本研究表明，人前列腺癌LNCaP能够将全长PDGF D加工成具有生物活性的PDGF配体，用于β-PDGFR激活，这种处理很可能发生在细胞表面或其附近。这种局部激活使我们推测全长PDGF DD的CUB结构域的可能功能。CUB结构区由约110个氨基酸组成，与补体子成分C1r/C1s、海胆表皮生长因子样蛋白（Uegf）、，和骨形态发生蛋白1（Bmp1；参考文献。42). CUB结构域存在于几种细胞外蛋白中，被认为可以介导蛋白质-蛋白质或蛋白质-碳水化合物的相互作用(43——45). 因此，除了抑制PDGF D与PDGFR结合的活性外，CUB结构域还可能对PDGF D-活性具有独特的调节功能。CUB结构域与未知蛋白的相互作用可能对PDGF D全长蛋白在细胞外和/或细胞周基质中的隔离至关重要，从而调节PDGF D-蛋白的定位。相反，CUB结构域可以通过与细胞表面附近的特定蛋白质相互作用，使PDGF DD与蛋白酶适当结合，从而促进PDGF DD的激活；只有通过这种结合，蛋白酶才能激活PDGF-DD。CUB结构域也可能不仅仅是一个“锚”，但它与共受体样蛋白的相互作用可能会改变PDGFR信号通路。考虑到其与表皮生长因子样蛋白和骨形态发生蛋白1的序列相似性，确定全长PDGF D蛋白水解裂解后的CUB结构域是否具有生物活性也值得研究。与前列腺癌相关，CUB结构域与骨形态发生蛋白（已知在骨生长中起作用的蛋白）的同源性可能与前列腺癌向骨转移有关。这值得进一步研究体内模型。
最近的报道表明PDGF D诱导NIH3T3细胞表型转化在体外还可以促进小鼠的肿瘤形成(12,46). 在这项研究中，我们发现尽管PDGF D促进人类前列腺癌细胞生长在体外，它仅在早期加速肿瘤形成，对整体肿瘤发病率或肿瘤大小几乎没有影响体内然而，PDGF D显著增加了小鼠前列腺癌细胞与宿主基质成分相互作用的能力，这一事件对前列腺癌的进展至关重要。我们的在体外研究表明，PDGF D足以诱导成纤维细胞迁移，但仅PDGF D-不足以诱导上皮细胞迁移。相反，PDGF D诱导来自成纤维细胞的未知信号，然后以二次旁分泌的方式诱导上皮细胞迁移。将我们的结果与最近报道PDGF信号在前列腺癌进展中的重要性的研究结果结合起来β-PDGF在转移中的信号传导，我们认为前列腺癌细胞自动激活PDGF D并以自分泌和旁分泌方式使用其信号传导，导致更恶性的表型。
致谢
拨款支持：NIH/国家癌症研究所拨款CA64139（给H-R.C.Kim）。
我们感谢R.Fridman博士和Pam Osenkowski为痘苗病毒系统提供技术援助。
工具书类
1Sakr WA、Grignon DJ、Crissman JD、Heilbrun LK、Cassin BJ、Pontes JJ、Haas GP。20-69岁之间的高级前列腺上皮内瘤变（HGPIN）和前列腺腺癌：249例尸检研究。在体内。1994;8:439–443.[公共医学][谷歌学者] 2小EJ，Reese DM，新泽西州Vogelzang。激素抵抗型前列腺癌：一种不断发展的护理标准。Semin肿瘤。1999;26（补充17）：61–67。[公共医学][谷歌学者] 3Hugosson J，Aus G.局限性前列腺癌的自然病程：个人观点和已发表论文综述。抗癌研究。1997;17:1441–1448.[公共医学][谷歌学者] 4Rosenkranz S，Kazlauskas A.PDGF受体诱导的不同信号特性和生物反应的证据α和β子类型。生长因子。1999;16：201–216。[公共医学][谷歌学者] 5Yu J，Ustach C，Kim HR.血小板衍生生长因子信号传导与人类癌症。生物化学与分子生物学杂志。2003;36:49–59.[公共医学][谷歌学者] 6多肽生长因子：在正常和异常细胞生长中的作用。细胞生物学年度收益。1987;三:443–492.[公共医学][谷歌学者] 7Ko YJ、Small EJ、Kabbinavar F、Chachoua A、Taneja S、Reese D、DePaoli A、Hannah A、Balk SP、Bubley GJ。SU101是一种血小板衍生生长因子受体抑制剂，用于激素抵抗型前列腺癌患者的多机构II期研究。临床癌症研究。2001;7:800–805.[公共医学][谷歌学者] 8Uehara H、Kim SJ、Karashima T、Shepherd DL、Fan D、Tsan R、Killion JJ、Logothetis C、Mathew P、Fidler IJ。阻断血小板衍生生长因子受体信号在实验性前列腺癌骨转移小鼠模型中的作用。美国国家癌症研究所（贝塞斯达）2003;95:458–470.[公共医学][谷歌学者] 9Bergsten E、Uutela M、Li X、Pietras K、Ostman A、Heldin CH、Alitalo K、Eriksson U。PDGF-D是PDGF的特异性蛋白酶激活配体β-受体。自然细胞生物学。2001;三:512–516.[公共医学][谷歌学者] 10LaRochelle WJ、Jeffers M、McDonald WF、Chillakuru RA、Giese NA、Lokker NA、Sullivan C、Boldog FL、Yang M、Vernet C、Burgess CE、Fernandes E、Deegler LL、Rittman B、Shimmets J、Shimmet RA、Rothberg JM、Lichenstein HS。PDGF-D，一种新的蛋白酶激活的生长因子。自然细胞生物学。2001;三:517–521.[公共医学][谷歌学者] 11Li X、Ponten A、Aase K、Karlsson L、Abramsson A、Uutela M、Backstrom G、Hellstrom M、Bostrom H、Li H、Soriano P、Betsholtz C、Heldin CH、Alitalo K、Ostman A、Eriksson U。PDGF-C是PDGF的一种新蛋白酶活化配体α-受体。自然细胞生物学。2000;2:302–309.[公共医学][谷歌学者] 12LaRochelle WJ、Jeffers M、Corvalan JR、Jia XC、Feng X、Vanegas S、Vickroy JD、Yang XD、Chen F、Gazit G、Mayotte J、Macaluso J、Rittman B、Wu F、Dhanabal M、Herrmann J、Lichenstein HS。血小板衍生生长因子D：小鼠的致瘤性和人类癌症的异常表达。癌症研究。2002;62:2468–2473.[公共医学][谷歌学者] 13Uutela M、Lauren J、Bergsten E、Li X、Horelli-Kuitunen N、Eriksson U、Alitalo K。人类PDGFC和PDGFC基因的染色体位置、外显子结构和血管表达模式。循环。2001;103:2242–2247.[公共医学][谷歌学者] 14Fuerst T，Earl P，Moss B.使用混合痘苗病毒-T7 RNA聚合酶系统表达靶基因。分子细胞生物学。1987;7:2538–2544. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Jozaki K、Marucha PT、Despins AW、Kreutzer DL。安在体外细胞迁移模型：血管内皮细胞迁移的评价。分析生物化学。1990;190:39–47.[公共医学][谷歌学者] 16Doolittle RF、Hunkappiller MW、Hood LE、Devare SG、Robbins KC、Aaronson SA、Antoniades HN。猿肉瘤病毒onc基因v-sis源自编码血小板衍生生长因子的基因。科学（华盛顿特区）1983;221:275–277.[公共医学][谷歌学者] 17Waterfield MD、Scrace GT、Whittle N、Stroobant P、Johnsson A、Wasterson A、Westermark B、Heldin CH、Huang JS、Deuel TF。血小板衍生生长因子在结构上与猴肉瘤病毒的假定转化蛋白p28sis相关。自然（伦敦）1983;304：35–39。[公共医学][谷歌学者] 18Hermanson M、Funa K、Koopmann J、Maintz D、Waha A、Westermark B、Heldin CH、Wiestler OD、Louis DN、von Deimling A、Nister M。17号染色体杂合性缺失与高血小板衍生生长因子的相关性α受体在人类恶性胶质瘤中的表达。癌症研究。1996;56：164–171。[公共医学][谷歌学者] 19Plate KH、Breier G、Farrell CL、Risau W.血小板衍生生长因子受体-β在人脑胶质瘤的内皮细胞中，在肿瘤发展过程中诱导并在肿瘤进展过程中上调。实验室调查。1992;67:529–534.[公共医学][谷歌学者] 20Westermark B，Heldin CH，Nister M.人类胶质瘤中的血小板衍生生长因子。格利亚。1995;15:257–263.[公共医学][谷歌学者] 21Greco A、Roccato E、Miranda C、Cleris L、Formelli F、Pierotti MA。STI571对COL1A1/PDGFB重排转化的细胞的生长抑制作用。国际癌症杂志。2001;92:354–360.[公共医学][谷歌学者] 22Shimizu A、O'Brien KP、Sjoblom T、Pietras K、Buchdunger E、Collins VP、Heldin CH、Dumanski JP、Ostman A。隆起性皮肤纤维肉瘤相关I型胶原α1/血小板衍生生长因子（PDGF）B链融合基因产生转化蛋白，该蛋白被加工成功能性PDGF-BB。癌症研究。1999;59:3719–3723.[公共医学][谷歌学者] 23Kadono T、Kikuchi K、Nakagawa H、Tamaki K。神经纤维瘤组织中各种生长因子及其受体的表达。皮肤科。2000;201：10-14。[公共医学][谷歌学者] 24Golub TR、Barker GF、Lovett M、Gilliland DG。PDGF受体融合βt（5；12）染色体易位的慢性粒单核细胞白血病中一个新的ets样基因tel。单元格。1994;77：307–316。[公共医学][谷歌学者] 25Sulzbacher I、Traxler M、Mosberger I、Lang S、Chott A.血小板衍生生长因子-AA和-α受体表达提示骨肉瘤中存在自分泌和/或旁分泌环。中度病理学。2000;13:632–637.[公共医学][谷歌学者] 26Beckmann MP、Betsholtz C、Heldin CH、Westermark B、Di Marco E、Di Fiore PP、Robbins KC、Aaronson SA。人类PDGF-A和PDGF-B链的生物学特性和转化潜力的比较。科学（华盛顿特区）1988;241:1346–1349.[公共医学][谷歌学者] 27Uhrbom L、Hesselager G、Ostman A、Nister M、Westermark B。血小板衍生生长因子-B诱导的小鼠脑肿瘤细胞对自分泌生长因子刺激的依赖性。国际癌症杂志。2000;85:398–406.[公共医学][谷歌学者] 28Skobe M，Fusenig NE。通过基质细胞激活永生人类角质形成细胞的致瘤转化。美国国家科学院程序。1998年；95:1050–1055. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Moinfar F、Man YG、Arnould L、Bratthauer GL、Ratschek M、Tavassoli FA。乳腺癌基质细胞和上皮细胞的并发和独立遗传改变：对肿瘤发生的影响。癌症研究。2000;60:2562–2566.[公共医学][谷歌学者] 30Zoltowska A.乳腺癌的发病机制。免疫组织化学研究。Arch Immunol Ther Exp（瓦尔兹）1997;45:101–108.[公共医学][谷歌学者] 31Bronzert DA、Pantazis P、Antoniades HN、Kasid A、Davidson N、Dickson RB、Lippman ME。人类乳腺癌细胞系血小板衍生生长因子的合成和分泌。美国国家科学院程序。1987;84:5763–5767. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Coltrera MD，Wang J，Porter PL，Gown AM。血小板衍生生长因子B链和血小板衍生生长因素受体的表达β人乳腺组织和乳腺癌中的亚单位。癌症研究。1995;55：2703–2708。[公共医学][谷歌学者] 33Palman C、Bowen Pope DF、Brooks JJ。血小板衍生生长因子受体(β-亚单位）在软组织肿瘤中的免疫反应。实验室调查。1992;66:108–115.[公共医学][谷歌学者] 34西摩·L，贝兹沃达·WR。血小板衍生生长因子（PDGF）免疫阳性是晚期乳腺癌患者的不良预后因素。乳腺癌研究治疗。1994;32:229–233.[公共医学][谷歌学者] 35Kawai T，Hiroi S，Torikata C.血小板衍生生长因子及其受体在肺癌中的表达。实验室调查。1997;77:431–436.[公共医学][谷歌学者] 36Sundberg C、Branting M、Gerdin B、Rubin K。人类大肠腺癌中肿瘤细胞和结缔组织细胞的相互作用。将血小板衍生生长因子-AB/BB转移至基质细胞。《美国病理学杂志》。1997;151:479–492. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Fudge K、Bostwick DG、Stearns ME。血小板衍生生长因子A和B链以及α和β前列腺上皮内瘤变中的受体。前列腺。1996;29:282–286.[公共医学][谷歌学者] 38Fudge K，Wang CY，Stearns ME。血小板衍生生长因子A和B链以及血小板衍生生长因子的免疫组织化学分析α和β受体在良性前列腺增生和Gleason分级的人前列腺腺癌中的表达。中度病理学。1994;7:549–554.[公共医学][谷歌学者] 39Heldin CH，Westermark B.作用机制和体内血小板衍生生长因子的作用。生理学评论。1999;79:1283–1316.[公共医学][谷歌学者] 40Bejcek BE、Hoffman RM、Lipps D、Li DY、Mitchell CA、Majerus PW、Deuel TF。v-sis癌基因产物而非血小板衍生生长因子（PDGF）A同源二聚体激活PDGFα和β细胞内受体并启动细胞转化。生物化学杂志。1992;267:3289–3293.[公共医学][谷歌学者] 41于杰，德伊尔TF，金HR.血小板衍生生长因子（PDGF）受体-α激活c-Jun NH2-末端激酶-1与拮抗PDGF受体-β-诱导表型转化。生物化学杂志。2000;275:19076–19082.[公共医学][谷歌学者] 42Bork P.补体成分C1r/C1s骨形态发生蛋白1非洲爪蟾发育调节蛋白UVS.2具有共同的重复序列。FEBS信函。1991;282:9–12.[公共医学][谷歌学者] 43Nakamura F、Tanaka M、Takahashi T、Kalb RG、Strittmatter SM。神经毛蛋白-1胞外结构域介导信号蛋白D/III诱导的生长锥塌陷。神经元。1998年；21:1093–1100.[公共医学][谷歌学者] 44Kristiansen M，Kozyraki R，Jacobsen C，Nexo E，Verroust PJ，Moestrup SK。内在因子维生素B的分子解剖12受体cublin公开了对膜结合和配体结合重要的区域。生物化学杂志。1999;274:20540–20544.[公共医学][谷歌学者] 45Thielens NM、Bersch B、Hernandez JF、Arlaud GJ。C1r和C1s相互作用域的结构和功能：C1复合体结构的基石。免疫药理学。1999;42:3–13.[公共医学][谷歌学者] 46Li H，Fredriksson L，Li X，Eriksson U。PDGF-D是一种有效的转化和血管生成生长因子。致癌物。2003;22:1501–1510.[公共医学][谷歌学者] 
