RasGRP3的C-Src磷酸化介导的表皮生长因子受体对磷脂酶C-ɛ的Rap2B依赖性刺激

通过逆转录酶PCR检测RasGRPs。

分别用QIAamp DNA迷你试剂盒和RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）从HEK-293细胞中制备基因组DNA和总细胞RNA。用寡核苷酸（dT）进行反转录₁₅)引物和SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）。随后，使用塔克PCR Master Mix试剂盒（Qiagen），含有2μl cDNA和引物对，每个引物对包含RasGRP1（正向引物，5′-AACTAACACCTTCAAAGCCACCAGTAG-3′；反向引物，5′-TCCTGAGAATGTATCCATCGGTC-3′）、GRP2（正向引物，5′-GAGCGGCAGTGACTCAGCGGAAC-3′；反向引物，5′-AAGGGGAGATGAACCGCTCCAGGAC-3′）的一个单一内含子，和RasGRP3（正向，5′-GTGGAGCAATTGTCACAAAACAGTG-3′；反向，5′-GCCTGTAACCAGTGTGTGGCTCTG-3′）。无模板DNA PCR作为阴性对照，2μl基因组DNA PCR作为阳性对照。相应基因组扩增子的大小分别为1004、416和515 bp，RasGRP1、GRP2和RasGRP3的扩增转录本的大小分别是153、212和206 bp。序列信息来自GenBank数据库（登录号编号_010194,033903、和022184).

PLC活性和[Ca的测量²⁺]_我.

为了测量PLC活性，HEK-293细胞在血清中饥饿36小时，并在37°C的温度下孵育指定的时间段，加入或不加入100 ng EGF/ml，然后注射IP_三质量测定(32). 细胞内游离钙²⁺浓度（[Ca²⁺]_我)在具有荧光Ca的细胞悬浮液中测定²⁺日立荧光光谱仪中的指示染料Fura-2(7). 为了研究梭状芽孢杆菌毒素的影响，在不使用或使用毒素的情况下，将细胞在指定浓度下处理24小时，然后进行IP_三和[Ca²⁺]_我测量值。

激活Rap2B。

在转染野生型Rap2B的缺血清HEK-293细胞中测定Rap2B的激活，并在37°C下刺激指定的时间段，无EGF或有EGF，然后用谷胱甘肽从细胞裂解液中提取激活的Rap2PS公司-转移酶（GST）标记的RalGDS-RBD（Ral-鸟嘌呤核苷酸离解刺激物的Rap-binding结构域）与谷胱甘肽Sepharose珠结合，并用抗Rap2抗体进行免疫印迹，如前所述(32). 用ImageQuant软件（分子动力学）对谱带进行密度分析。

共焦激光扫描显微镜。

用相应图例中所示的表达质粒组合转染细胞，并在用0.1 mg聚乳酸预处理的盖玻片上生长-d日-赖氨酸/ml(9). 用含有13.6 mM NaCl、4 mM KCl和12 mM NaHCO的Moscona冲洗缺乏血清的细胞_三，10毫微米d日-葡萄糖，0.36 mM NaH₂人事军官₄和0.18 mM KH₂人事军官₄（pH 7.4），并在37°C下无EGF或有EGF培养5分钟。此后，将细胞固定，并在室温下用乙醇-丙酮（1/1）渗透10分钟，然后在Moscona中进行两次洗涤。用Moscona牛血清白蛋白（BSA）（Moscona补充0.5%BSA）孵育细胞15分钟，可阻断非特异性结合。将细胞冲洗干净，并在室温下用抗c抗体孵育1小时-myc公司抗体。然后，用Moscona-BSA冲洗细胞三次，并用荧光结合二级抗体（Alexa-488；稀释度，1:200）在黑暗中培养1小时。二级抗体在黑暗中用Moscona-BSA洗净，细胞标本安装在添加了90%甘油和1.0%甘油的Moscona中第页-苯二胺。使用Zeiss LSM 510 Axiovert 100M共聚焦激光扫描显微镜系统（Plan neofluor 40×/1.3油物镜，488至633nm激发）进行共聚焦免疫荧光成像。共焦激光显微镜图像由ImageProPlus软件（4.5版；Media Cybernatics）和高斯滤波模块处理(1).

免疫沉淀。

用相应的图形图例中所示的表达质粒转染细胞，并在无血清培养基中的60-mm直径培养皿上生长。在Hank的平衡盐溶液中冲洗细胞，并在37°C下无EGF或有EGF培养5分钟。然后，用含有137 mM NaCl、2.7 mM KCl、6.5 mM NaH的冰镇磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞两次₂人事军官₄，1.5 mM千赫₂人事军官₄，0.9 mM氯化钙₂，0.5 mM氯化镁₂和100μM原钒酸盐（pH 7.2）。同时，抗HA抗体（2μg）或抗c-myc公司将抗体（2μg）与蛋白质A-Sepharose（20μl/反应管）在含有50mM Tris-HCl（pH 7.5）、150mM NaCl、10mM焦磷酸钠、50mM NaF、1mM EGTA、1%Nonidet P-40、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）的免疫沉淀缓冲液中在4°C下轻轻混合1小时。在500μl冰镇免疫沉淀缓冲液中刮取细胞，该缓冲液补充有1 mM原钒酸盐、1 mM苯甲基磺酰氟、10μg亮氨酸蛋白酶/ml和25μg抑肽酶/ml，转移到预冷反应管中，旋转10 s，并在冰上孵育至少10 min。通过离心澄清溶解物，将上清液（1 mg蛋白质/反应管）在4℃下轻轻混合2 h，并用免疫沉淀缓冲液洗涤沉淀四次。沉淀的蛋白质在95°C的Laemmli缓冲液中培养10分钟，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离。用特异性抗体免疫印迹法检测酪氨酸磷酸化和结合Rap2B。

从Sf9细胞中纯化GST标记的RasGRP3。

为了生成RasGRP3杆状病毒构建物，pMT2-HA-RasGRP3（KIAA0846；GenBank登录号AB020653号)被SalI/NotI消化并亚克隆到转移载体pAcGHLT-C（Pharmingen）的限制性位点XhoI和NotI。纯化的转移载体构建物（1.0μg）与0.25μg线性化的杆状金DNA（Pharmingen）用脂质体（Invitrogen）共同转染到Sf9细胞中。通过感染Sf9细胞单层，扩增重组RasGRP3编码杆状病毒，然后纯化斑块并鉴定斑块纯化重组病毒基因组中的异源RasGRP2插入物。感染后1天通过离心法收集RasGRP3杆状病毒感染的Sf9细胞，将其重新悬浮在含有50 mM Tris-HCl（pH7.5）、2 mM EDTA、1 mM二硫苏糖醇、250 mM蔗糖、10μM苯甲基磺酰基氟化物和0.5μg/ml leupeptin的制备缓冲液中，并通过超声溶解。将细胞裂解液与Triton X-100（最终浓度为1%）在4°C下培养30分钟。离心后，将上清液（含有GST-标记的RasGRP3）与谷胱甘肽Sepharose珠轻轻混合，用制备缓冲液洗涤三次，并保存在4°C下。通过SDS-PAGE和抗GST抗体的免疫印迹分析固定化GST标记的RasGRP3。

体外c-Src测定。

GST或GST标记的RasGRP3（2至3μg）在30°C下孵育10分钟，加入或不加入2U重组C-Src。在含有50 mM MgCl的激酶反应缓冲液中进行检测₂，15 mM氯化锰₂，5 mM原钒酸钠（用100 mM HEPES在pH 7.5下缓冲），和[γ-³²P] ATP（0.75 MBq/反应管）或1 mM未标记ATP。通过添加Laemmli缓冲液并在95°C下加热10分钟，停止反应。通过SDS-PAGE分离磷酸化蛋白，并通过考马斯染色和放射自显影或使用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹显示。

免疫印迹分析。

用于检测c-myc公司，PLC-γ1、Rap1A、Rap2A、Rap2B、HA、磷酸酪氨酸和PLC-，通过SDS-PAGE在5%或15%丙烯酰胺凝胶上从细胞裂解物中分离出等量的蛋白质。转移到硝化纤维素膜上并与适当的抗体孵育10小时后，通过增强化学发光观察蛋白质。

Rap2B参与EGF受体介导的PLC刺激。

PLC活性由Ras和Rho家族的小GTPase控制(10,12,13,15,33,34,38). 为了研究是否以及哪些类型的GTPase参与EGF受体对PLC的刺激，我们首先检测了几种梭状芽孢杆菌毒素对这些小GTPase的灭活作用。用艰难梭菌B毒素，使RhoA、Rac1和Cdc42失活(11)，未改变EGF诱导的IP_三形成和[Ca²⁺]_我增加（图。​（图2A）。2安培). 相反，用艰难梭菌毒素B-1470（已知可灭活Rac、Rap和Ral GTPase）或索氏梭菌致命毒素（还可使Ras失活）(4,30)IP水平大幅降低_三EGF诱导的形成（图。​（图2A，2安培，左侧面板）。这种抑制与EGF诱导的[Ca²⁺]_我上升，这是显著的(P（P）<0.001）从148±25 nM下降(n个=7）至102±17 nM(n个=5）和114±15 nM(n个=4）分别通过毒素B-1470和致命毒素的存在（图。​（图2A，2安培，右侧面板）。PLC和Ca的抑制²⁺毒素发出的信号不是由于PLC底物水平下降(7). 此外，毒素没有改变EGF受体的表达（用EGF受体抗体进行免疫印迹测定）或EGF诱导的有丝分裂原活化蛋白激酶（ERK1和ERK2）磷酸化(36)（未显示数据）。

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图2。

梭状芽孢杆菌毒素和类Ras-like GTPase突变体对EGF诱导的PLC和Ca的影响²⁺信号。（A） HEK-293细胞在不使用（对照）或使用100 pg毒素B/ml、300 pg毒素B-1470/ml或100 ng致死毒素/ml的情况下处理24 h，然后测定IP_三在没有（基础）或存在100 ng EGF/ml（左面板）和EGF诱导的[Ca的情况下形成1分钟²⁺]_我增加（右侧面板）。（B） 用空载体（对照）、S17N-Ras、S17N-Rap1A或S17N-Rap2B（各100μg DNA）转染HEK-293细胞。转染后48小时，IP水平_三在没有（基础）或100 ng EGF/ml（左面板）和EGF-诱导的[Ca²⁺]_我确定了增加（右侧面板）。（C） 用空载体（对照）、G12V-Rap1A、G12V Rap2A或G12V Rap2B（各25μg DNA）转染HEK-293细胞。转染后48小时，IP_三在不使用（Basal）或使用100 ng EGF/ml的情况下测量1分钟的形成。插图：免疫印迹检测用空载体（V）或指示的GTPases转染的细胞裂解液中的GTPase。左侧面板中的数据表示平均值±SEM(n个=3至6）；在右侧面板中，[Ca的叠加轨迹²⁺]_我如图所示。不重要。

然后我们检测了哪种特定的Ras-related GTPase（作为毒素底物）参与EGF受体信号传导。为此，我们研究了各种GTPase突变体对IP的影响_三形成和[Ca²⁺]_我EGF受体增加。在对照细胞中，EGF导致IP快速短暂增加_三，峰值为1至2分钟（图。​（图2B，2B型，左侧面板）。显性负性S17N H-Ras的表达，干扰EGF向磷脂酶D的信号传导(36)或S17N Rap1A没有改变IP的范围或时间进程_三形成。相反，S17N Rap2B的表达强烈降低了EGF诱导的IP_三形成。与它们对知识产权的不同影响相一致_三S17N Rap2B的形成和表达，而不是S17N H-Ras或S17N Rap1A的形成和表示，减少了EGF诱导的[Ca]²⁺]_我从162±25 nM增加到116±14 nM(n个=6至8；P（P）<0.0001）（图。​（图2B，2B型，右侧面板）。此外，组成型活性G12V Rap2B的表达，而不是G12V Rap1A或G12V Rap2A的表达，显著增强了基础IP_三在未刺激细胞中积累（图。​（图2C）。2摄氏度). EGF诱导的IP_三G12V Rap2B的表达并没有进一步增加形成。

最近，Kataoka及其同事报道，EGF以Ras依赖性方式诱导PLC-ɛ移位到COS-7细胞的质膜，而Rap1A诱导PLC--\603]移位到核周区域(10,33). 因此，我们研究了EGF是否改变了PLC-ɛ在HEK-293细胞中的亚细胞分布，以及这种过程是否受Rap2B的控制（明显参与EGF受体对PLC的刺激）。如图所示。​图3A，3A级EGF诱导PLC-ɛ向质膜移位（通过免疫荧光激光共聚焦显微镜对表达c-myc公司-标记的PLC-ɛ）。这种受体效应通过组成活性G12V Rap2B的表达来模拟。当显性负性Rap2B而非显性负性H-Ras或Rap1A共表达时，EGF诱导的PLC-ɛ的亚细胞再分布被完全消除（图。​（图3A）。3A级). 这些数据表明，Rap2B与PLC-ɛ相互作用。事实上，Rap2B与PLC-ɛ共免疫沉淀于HEK-293细胞的裂解液中，共表达c-myc公司-标记了PLC-和Rap2B，证明了它们在体内的相互作用（图。​（图3B）。3B公司). 最重要的是，EGF受体的刺激强烈增强了PLC-ɛ和Rap2B的相互作用。脂肪酶非活性H1144L PLC-ɛ也获得了类似的数据，这意味着脂肪酶活性对于PLC-与Rap2B的相互作用是不需要的。与显性负性Rap1A在EGF诱导的PLC-ɛ亚细胞易位中的缺失效应一致（图。​（图3A），3A级)，EGF没有导致Rap1A与PLC-ɛ的共免疫沉淀（数据未显示）。总的来说，这些数据表明EGF受体通过Rap2B的特异性结合和脂肪酶向质膜的移位诱导PLC-ɛ的刺激。

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图3。

Rap2B与PLC的相互作用-ɛ。（A） HEK-293细胞转染c-myc公司-标记的PLC-单独（对照）或与G12V Rap2B（25μg DNA）或与S17N Rap2B、S17N Ras或S17N Rap1A（各100μg DNA。48小时后，将细胞在不含（Basal）或含100ng/ml EGF的情况下处理5分钟，用抗c染色-myc公司抗体，并用免疫荧光激光共聚焦显微镜进行分析。棒材，5μm。（B） 用野生型Rap2B（50μg DNA）转染HEK-293细胞-myc公司-标记的野生型PLC-ɛ（WT）或H1144L PLC-ɦ（H1144L）（每个DNA 25μg）。48小时后，在不使用（−）或（+）100 ng EGF/ml的情况下，将细胞处理5分钟，然后用抗c-myc公司-抗体。c的免疫沉淀物（IP）-myc公司-标记的PLC-ɛ通过SDS-PAGE进行解析，并用抗-Rap2（α-Rap2）或抗-c探针进行探测-myc公司抗体（α-myc）如图所示。所示结果代表了三到四个实验。WB、Western blot。

RasGRP3参与EGF受体介导的PLC刺激和Rap2B激活。

Rap家族的GTP酶被各种GEF激活，如C3G、Ca²⁺/DAG监管的GEF、PDZ-GEF、Repac-GEF和Epac-GEF(5,23). 为了确定参与Rap2B介导EGF受体向PLC-ɛ的信号传导的特定GEF，我们将这些GEF表达到可比较的水平（图。​（图4A）4A级)并分析了它们对EGF诱导的PLC刺激的影响，[Ca²⁺]_我增加，并激活Rap2B。GEF对PLC和Ca的影响差异显著²⁺信号。PDZ、C3G、Epac1、Repac、GRP2和RasGRP1的表达没有改变基础或EGF诱导的IP_三地层结果（图。​（图4B）。第4页). 相反，RasGRP3的表达强烈增强了EGF诱导的IP_三地层（图。​（图4B）。第4页). 显性负Rap2B的共表达完全抑制了EGF诱导的IP的增强作用_三RasGRP3引起的形成（185±15 pmol mg⁻¹至56±10 pmol mg⁻¹[n个= 6];P（P）< 0.0001). 与它们对PLC刺激的不同作用一致，只有RasGRP3的表达，而C3G、PDZ、Epac1或GRP2的表达没有显著增强EGF诱导的[Ca]²⁺]_我水平从155±25 nM到295±29 nM(n个=8至10；P（P）<0.0001）（图。​（图4C）。4摄氏度). 由于RasGRP3似乎特异性地介导PLC信号，我们研究了HEK-293细胞是否内源性表达这种GEF。使用RasGRP-特异性寡核苷酸引物对的逆转录酶PCR证明，HEK-293细胞（除了编码RasGRP1和GRP2的特异mRNA转录物外）表达RasGRP3的特异性mRNA转录（图。​（图4D4D（四维）).

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图4。

类Ras GTPases的不同GEF对EGF诱导的PLC和Ca的影响²⁺信号。（A至C）用空载体（vector，V）、PDZ、C3G、Epac1、Repac、GRP2、RasGRP1或RasGRP3（每个25μg DNA）转染HEK-293细胞。转染后48小时，IP水平_三在没有（基本）或存在100 ng EGF/ml（B）和EGF诱导的[Ca的情况下测量1分钟的形成²⁺]_我增加量（C）已确定。（A） 转染细胞裂解液中HA标记GEF的免疫印迹检测。插入面板B：C3G的免疫印迹检测。（D） 用逆转录酶PCR（RT-PCR）检测HEK-293细胞中的RasGRP。面板B中的数据表示平均值±SEM(n个=3至5）；在面板C中，[Ca的叠加轨迹²⁺]_我如图所示。

HEK-293细胞的EGF处理引起Rap2B的快速、相当持久的激活，在5分钟时达到最大水平（通过用固定的RalGDS RBD从细胞裂解物中提取GTP负载的Rap2B来确定）（图。​（图5A）。5A级). PDZ、C3G、Epac1、Repac（数据未显示）、GRP2或RasGRP1的表达对EGF激活Rap2B没有影响。相反，RasGRP3的表达（其本身没有影响）强烈增强了EGF对Rap2B激活的刺激作用（约为其两倍）（图。​（图5B）。5亿). 然而，PDZ、C3G、Repac、GRP2和RasGRP1未处于非活动状态；这些GEF分别增强了Rap1A和H-Ras的EGF诱导的GTP负荷（数据未显示）。因此，RasGRP3是Ca的成员²⁺/已知DAG-调节的GEF家族可在体内外诱导Ras和Rap家族成员的GTP负荷(20,25,39)显然与EGF受体介导的Rap2B激活和随后的PLC刺激有关。

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图5：。

EGF受体激活Rap2B及其对RasGRP3、细胞内Ca的调节²⁺和PLC-γ1。（A） 用野生型Rap2B（50μg DNA）转染HEK-293细胞。在转染后48小时，在没有（−）或（+）100 ng EGF/ml的情况下刺激细胞指定的时间段。（B）HEK-293细胞仅转染Rap2B（对照）和指定的GEF（每个25μg DNA）。转染后48小时，在不使用（−）或使用（+）100ng EGF/ml的情况下刺激细胞5分钟。（C）用Rap2B转染HEK-293细胞。在转染后48小时，首先在无（对照）或100 nM Gö6976或20μM BAPTA/AM的情况下处理细胞30分钟，然后在无（Basal）或100 ng EGF/ml的情况下刺激细胞5分钟（左面板），或用1μM A23187或1μM离子霉素刺激细胞（右面板）。（D） HEK-293细胞单独转染Rap2B（对照）或H1144L PLC-ɛ或H335Q PLC-γ1（各100μg DNA）。转染后48小时，在不使用（Basal）或100 ng EGF/ml的情况下刺激细胞5分钟。用RalGDS-RBD提取GTP-负载的Rap2B，用SDS-PAGE分离，并用抗Rap2抗体进行免疫印迹。所示结果代表了三到六个实验。

我们感谢K.Baden、M.Hagedorn、H.Geldermann、D.Petermeyer和A.Kötting-Dorsch提供的专家技术援助，C.Rimmbach在PCR实验中提供的援助，C.Heneweer在显微镜分析方面提供的建议，以及A.Blaukat、J.L.Bos、C.von Eichel-Streiber、J.de Gunzburg、D.Illenberger、J.W.Lomasney、J.T.Parsons、H.Rehmann、，J.de Rooij、P.-G.Suh和A.Ullrich提供毒素和cDNA结构。

这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft、Interne Forschungsförderung Essen和化学工业基金会的支持。