高迁移率族蛋白1（HMGB1）是一种普遍存在的核和细胞溶质蛋白，在无菌炎症和感染期间释放到细胞外空间6免疫活性细胞在受到微生物产品和其他危险信号刺激后分泌HMGB14-6缺血和受损的体细胞也会释放HMGB1，但在这种情况下，释放机制是被动的6.细胞外HMGB1信号通过巨噬细胞中的TLR4受体诱导细胞因子释放6-7并通过与RAGE相互作用调节细胞迁移8由于中和HMGB1可减轻关节炎、结肠炎、脓毒症、缺血再灌注和其他感染性和无菌性损伤综合征的疾病严重程度，因此这些机制在疾病发病机制中的重要性已得到证实6HMGB1在无菌和感染性炎症交叉点的介导作用强调了调节免疫细胞分泌HMGB1的机制的重要性6.
早期观察表明巨噬细胞分泌HMGB1需要炎症小体和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性三-5,9-10与HMGB1从细胞核到细胞质的易位高度相关4,6HMGB1也是病毒入侵的通用前哨信号，其释放可由Poly I:C（一种双链RNA（dsRNA）模拟物）刺激11-12为了研究暴露于Poly I:C的巨噬细胞释放HMGB1的机制，我们首先考虑了早期的观察结果，即双链RNA依赖性激酶（PKR）在这些条件下磷酸化13-14由于PKR也被已知刺激HMGB1释放的原型PAMP和DAMP激活15-16，并激活炎症小体，我们推断PKR激活可能参与炎症小体激活。
因此，我们测量了PKR缺陷（PKR）小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1的释放-/-)PKR激酶结构域因基因缺失而功能失活的小鼠16PKR中Poly I:C暴露后HMGB1分泌-/-与野生型（PKR）相比，巨噬细胞显著减少+/+)巨噬细胞(). PKR中PKR的药理抑制+/+巨噬细胞剂量依赖性且显著抑制Poly I:C诱导的HMGB1释放和PKR磷酸化(,补充图1). 其他典型危险信号，包括ATP、尿酸单钠（MSU）、佐剂铝（ALU）和活性大肠杆菌还显著增加了PKR磷酸化和HMGB1的释放(). 向细胞外间隙添加钾显著抑制ATP诱导的PKR激活(). 基因缺失对巨噬细胞PKR的灭活作用()或药物抑制(,补充图2)也显著抑制HMGB1的释放。
PKR在热解介导HMGB1释放中的作用a至b。用PKR的Poly I:C.（a）巨噬细胞刺激细胞+/+或PKR-/-老鼠。（b） 巴基斯坦卢比+/+用指定剂量的PKR抑制剂2-AP处理巨噬细胞。c。LPS底漆PKR+/+如图所示，用或不用钾替代培养基（KCl）刺激或处理巨噬细胞。在指定的时间点对细胞进行裂解，并通过自身磷酸化监测PKR的激活。d-g。LPS底漆PKR+/+或PKR-/-如图所示，用2-AP刺激或处理巨噬细胞。Western blot检测上清液中HMGB1的水平。通过乳酸脱氢酶（LDH）测定细胞毒性。所示数据为3个独立实验的平均值±SD。#，与野生型刺激组相比，p<0.05。小时。HMGB1核定位序列乙酰化状态的质谱分析。
焦下垂是一种程序性炎症细胞死亡，伴随巨噬细胞炎症小体的激活而发生，我们观察到PKR的缺失显著抑制LDH的释放(). 对ATP、MSU或ALU释放的HMGB1进行串联质谱分析表明，HMGB1在核定位序列（NLS）中高度乙酰化(,补充图3-6). 相反，接受冷冻/解冻循环的巨噬细胞释放的HMGB1在NLS中没有乙酰化(). 以及炎症小体激活参与HMGB1核移位的证据4这些结果表明，HMGB1的超乙酰化和释放以及炎症小体的激活受PKR调控。
为了探讨PKR在激活NLRP3炎性体中的作用，我们测量了PKR腹腔巨噬细胞中caspase-1的激活和IL-1β的裂解+/+和PKR-/-老鼠。PKR中Caspase-1激活和IL-1β裂解被显著抑制-/-ATP、MSU和ALU刺激的巨噬细胞(). 在骨髓来源的树突状细胞中也获得了类似的结果(补充图7)和巨噬细胞(补充图8). 在PKR中NLRP3和前IL-1β的表达没有显著差异-/-巨噬细胞与PKR的比较+/+巨噬细胞(,补充图9)但暴露于活细胞的巨噬细胞分泌IL-1β大肠杆菌在PKR中被显著抑制-/-巨噬细胞与PKR的比较+/+巨噬细胞(). PKR中的TNF释放+/+和PKR-/-巨噬细胞具有可比性，表明PKR中IL-1β的释放减少-/-巨噬细胞不能归因于信号转导的整体缺陷(补充图10).
PKR对炎症小体激活很重要a-b类。LPS底漆PKR+/+或PKR-/-如图所示，巨噬细胞受到刺激。c。巴基斯坦卢比+/+巨噬细胞被2-AP或C刺激或处理13H（H）8N个4OS（CNS）如图所示。d-e类。巴基斯坦卢比+/+或PKR-/-给小鼠（n=5）注射活的大肠杆菌.f-g。如图所示转染HEK293A细胞。Western-blot评估Caspase-1激活和IL-1β裂解。数据代表至少三个独立实验。用ELISA法测定上清液（b）或血清（d）中IL-1β、IL-18、HMGB1和IL-6的水平。收集腹腔灌洗液，用流式细胞仪（e）测定中性粒细胞含量。所示数据为平均值±标准偏差#，与野生型感染组相比p<0.05。
Poly I:C和大肠杆菌骨髓来源树突状细胞中RNA显著激活caspase-1并刺激PKR中IL-1β的裂解+/+，但不是PKR-/-单元格(补充图11). 在PKR中也获得了类似的观察结果-/-和PKR+/+鱼藤酮刺激巨噬细胞，诱导线粒体ROS产生和PKR磷酸化(补充图12、13). PKR的药理学抑制剂量依赖性地抑制MSU诱导的caspase-1激活和IL-1β裂解。观察到的IC502-AP和C的13H（H）8N个4OS分别为0.5 mM和0.25μM，这与他们已知的IC非常吻合50针对PKR(,补充图14). PKR抑制显著降低小鼠巨噬细胞中ATP和ALU诱导的炎症小体激活(补充图15、16)和人单核细胞THP-1细胞(补充图17). PKR中IL-18的释放显著降低-/-巨噬细胞与PKR的比较+/+ATP、MSU或ALU刺激的巨噬细胞，而TNF和IL-6未被抑制(补充图18). 添加2-AP可降低MSU诱导的IL-18释放，但不降低TNF和IL-6(补充图18). 2-AP在PKR中未能抑制MSU诱导的caspase-1活化和IL-1β裂解-/-巨噬细胞(补充图19). 总之，这些发现确立了PKR在激活NLRP3炎性体中的关键作用。
巴基斯坦卢比+/+和PKR-/-然后将小鼠暴露于活的环境中大肠杆菌，为了激活NLRP3炎症小体体内
17PKR患者血清IL-1β、IL-18和HMGB1显著降低-/-小鼠与PKR的比较+/+老鼠(). 与先前的证据一致，即腹膜中性粒细胞浸润需要炎症小体激活18，我们观察到PKR腹腔灌洗液中中性粒细胞明显减少-/-小鼠与PKR的比较+/+控件(). 血清IL-6是一种炎症组独立的细胞因子，在两组中具有可比性(). PKR暴露-/-内毒素血症小鼠血清IL-1β和IL-18水平显著降低，但与PKR相比，TNF和IL-6的血清水平在数量上相似+/+控件(补充图20). 因此，PKR调节炎性体依赖性细胞因子的释放体内.
为了研究其机制，将通常不表达NLRP3成分的HEK293A细胞转染到共表达ASC、前caspase-1和NLRP3的质粒。然后将这些修饰细胞与表达PKR或特异性短发夹RNA（shRNA）的质粒共同转染，以抑制内源性PKR。PKR的过度表达显著增强了NLRP3炎性体再构成细胞中caspase-1的活化和IL-1β的裂解，shRNA对内源性PKR的敲除消除了caspase-1的裂解(). PKR的药理学抑制显著消除了IL-1β的切割(补充图21). 在缺乏NLRP3的情况下，PKR过表达不能直接激活caspase-1(补充图22)在缺乏caspase-1的情况下，并没有增强HMGB1的释放(补充图23). PKR底物内源性eIF-2a的敲除13-14未改变NLRP3炎性体再构成细胞中HMGB1的释放和IL-1β的裂解(补充图24).
因此，我们推断PKR与NLRP3炎性体发生物理性相互作用，并使用抗PKR抗体制备小鼠巨噬细胞裂解物用于免疫沉淀。PKR降低NLRP3，NLRP3相互免疫沉淀降低PKR(补充图25). 在人类THP-1细胞中也得到了类似的观察结果(补充图26). PKR中未检测到PKR-NLRP3复合物-/-巨噬细胞(补充图27). PKR和NLRP3在HEK293A细胞中的共表达以及随后的免疫沉淀证实了PKR与NLRP3之间的物理相互作用。PKR未能与其他细胞溶质受体和炎性体家族成员NOD1、NLRP12或NLRX1发生物理联系(补充图28). PKR与含有PYD、NACHT和LRR结构域的截短型NLRP3共同免疫沉淀(补充图29)和Walker A突变型NLRP3(补充图30)，不能绑定ATP19.以及重组PKR与NLRP3形成异聚蛋白复合物的直接证据()这些结果表明PKR与炎症小体存在物理相互作用。
PKR与NLRP3相互作用并促进炎症小体激活a-b类。免疫沉淀（IP）和Western-blot（WB）分析PKR和NLRP3在无细胞系统中的物理相互作用，使用重组蛋白（a）或LPS引发的巨噬细胞，用ATP刺激或用2-AP或C处理13H（H）8N个4OS（CNS）如（b）所示。c。如图所示，使用重组蛋白和ATP/Poly I:C重组NLRP3炎性体。通过水解WEHD-pNA测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的活性。d。巴基斯坦卢比+/+如图所示，用2-AP刺激或处理巨噬细胞。细胞裂解物经凝胶过滤色谱仪和western blot分析。结果代表了三个独立的实验。
PKR暴露+/+巨噬细胞对ATP的反应显著增强NLRP3和PKR复合物的形成(). 2-AP和C对PKR磷酸化的药理抑制作用13H（H）8N个4OS显著抑制NLRP3-PKR复合物的形成(). 在无细胞体系中向NLRP3和PKR中添加Poly I:C和ATP显著诱导PKR磷酸化并增加NLRP3-PKR复合物的形成().
接下来，用重组NLRP3、ASC、前蛋白酶-1和PKR在无细胞系统中重建NLRP3炎性体。NLRP3和ASC与Pro-caspase-1结合不能增加caspase-1活性(). PKR和Poly I:C/ATP的添加显著增加了caspase-1的活性，而2-AP的添加则抑制了caspase-1的活性(). 在这个无细胞系统中需要PKR活性，因为在缺乏PKR的情况下，poly-I:C/ATP不能增加NLRP3炎症小体的活性。此外，用缺乏激酶活性的重组突变PKR（K296R）取代PKR13,16，未能激活NLRP3炎性体(). 虽然PKR是一种自磷酸化激酶，但理论上PKR可能直接磷酸化炎性体成分。NLRP3、ASC和Caspase-1的磷酸化不能被检测到，尽管Poly I:C/ATP显著刺激PKR的自磷酸化（数据未显示）。为了证实PKR自身磷酸化参与NLRP3炎性体激活，在HEK293A细胞中共表达了PKR K296R突变体和NLRP3炎症体成分。PKR K296R突变体未能结合NLRP3，而WT PKR确实结合了NLRP3(补充图31). 过度表达PKR K296R突变体未能激活HEK293A细胞中重建的NLRP3炎性体(补充图31). 总之，这些数据表明PKR与NLRP3在物理上相互作用，并且对炎症小体的激活至关重要。
由于PKR可能在组装过程中和炎性体成分相关，ATP刺激的巨噬细胞裂解物经过凝胶过滤层析。我们观察到，在ATP刺激的巨噬细胞提取物的高分子量部分中，PKR和NLRP3与ASC和caspase-1一起洗脱(,补充图32). 2-AP抑制PKR激活降低了高分子量炎症组分中的PKR(,补充图33). PKR K296R突变体的表达显著降低了高分子量炎性体组分中的NLRP3，但未显著改变NLRP3的总表达(补充图34). PKR缺陷的呈现细胞也显著损害了高分子量蛋白NLRP3炎性体复合物的形成，但未改变NLRP3蛋白的总表达水平(补充图35). 暴露于ATP、MSU、ALU或大肠杆菌在PKR中，caspase-1从低分子量的单体部分显著转移到高分子量的蛋白质复合物+/+巨噬细胞，但不在PKR中-/-巨噬细胞(补充图35). 因此，活化的PKR是组装的炎症小体的组成部分。
出乎意料的是，PKR在HEK293A细胞中共同表达时，也与NLRP1、AIM2和NLRC4发生物理相互作用(). 为了研究PKR是否也可以调节NLRP1、AIM2和NLRC4炎性体，用炭疽致死毒素（LT）、Poly（dA:dT）转染或鼠伤寒沙门菌分别激活NLRP1、AIM2和NLRC4炎性体。这显著增强了PKR的自动磷酸化(补充图36). 基因缺失对PKR的灭活作用(,补充图37、38)或药物抑制(,补充图39)显著抑制胱天蛋白酶-1的激活、IL-1β的切割和HMGB1的分泌。PKR中LDH释放和IL-18生成也显著降低-/-巨噬细胞与PKR的比较+/+巨噬细胞，而TNF的生成在这些条件下没有受到抑制(补充图40、41). PKR的过度表达显著增强了HEK293A细胞中NLRP1、AIM2和NLRC4炎性体诱导的caspase-1激活和IL-1β裂解(,补充图42). 因此，PKR调节NLRP3、NLRP1、AIM2和NLRC4炎症小体的激活，但PKR活性不能决定哪个炎症小体将响应特定刺激而被激活。
PKR调节NLRP1、AIM2、NLRC4炎症小体激活a。如图所示转染HEK293A细胞。通过免疫沉淀（IP）和Western-blot（WB）分析PKR和myc标记蛋白的物理相互作用。b-d。LPS预处理（b）或未预处理（c，d）PKR+/+或PKR-/-巨噬细胞被炭疽致死毒素（LT）刺激，或被Poly（dA:dT）转染，或被感染鼠伤寒沙门菌(S.T公司). MOI，感染的多样性。e、。巴基斯坦卢比+/+如图所示，用2-AP刺激或处理巨噬细胞。f、。如图所示转染HEK293A细胞。Western-blot评估Caspase-1激活、IL-1β裂解和HMGB1分泌。结果代表了至少三个独立实验。
先前的观察表明，在细菌感染过程中，巨噬细胞通过热解死亡可能引发有害的炎症反应并损害免疫功能5,15PKR可以参与细菌诱导的巨噬细胞死亡15为了评估PKR缺乏是否影响细菌清除+/+和PKR-/-老鼠被活体暴露大肠杆菌（携带遗传标记）进入腹膜腔。24小时后脾脏和腹膜腔内基因标记细菌的滴度在PKR中显著降低-/-小鼠与PKR的比较+/+控件(补充图43)表明尽管PKR缺乏，动物仍保持清除细菌的能力。
本研究证实PKR活性是炎症小体组装和激活不可或缺的。PKR与炎症小体成分物理相互作用，对胱天蛋白酶-1激活、IL-1β切割和HMGB1释放很重要，并在无细胞系统中介导炎症小体活性。虽然最初研究的目的是作为病毒dsRNA的细胞内传感器，但最近有人提出PKR作为一种受细胞和代谢应激激活的危险传感分子发挥更广泛的作用15-16,20以及炎症组和HMGB1在无菌和感染相关炎症中的既定作用三,6,21-23PKR是炎症小体活性的关键调节因子，这对理解先天免疫对环境、代谢和侵袭信号的反应机制具有重要意义。
快速增长的证据表明炎症组与肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、脓毒症、结肠炎和其他疾病综合征的发病机制有关4-5,10,18,24-25针对炎症小体的治疗药物的开发需要了解调节炎症小体组装和激活的特定上游信号通路25-26现在应该可以设计和开发治疗药物，通过特异性靶向PKR来抑制炎症小体活性，而不会广泛损害免疫功能，用于治疗非消退性炎症和后炎症综合征。
方法
老鼠
库尔德工人党-/-如前所述，小鼠及其同窝出生的野生型对照最初处于129Sv/BALB/C混合背景中16.英寸大肠杆菌感染和内毒素血症实验中，我们使用了已培育成C57Bl/6J遗传背景的小鼠。全基因组SNP分析证实，这些小鼠约98%的遗传背景是C57Bl/6J。动物护理和实验程序得到了范斯坦医学研究所和哈佛大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。巴基斯坦卢比-/-和PKR+/+用PCR引物（5’-GGAACTTGGAGCAATGGA-3’；5’-TGCAAATCACAATACATAAC-3’；5‘-TGTCTGTGGCTACAGGG-3’和5’-TGACGATT CTTCTGAGGG-3′）对小鼠进行基因分型，在TAE的2%琼脂糖凝胶中电泳后产生240 bp野生型DNA带和460 bp突变DNA带。
试剂
从Invivogen中获得了超纯LPS和NLRP3炎性体激动剂ATP、尿酸单钠晶体（MSU）和佐剂铝（ALU）。抗NLRP3抗体（Cryo-2）来自Adipogen。兔抗PKR（磷酸化T446）单克隆抗体（E120）来自Abcam。小鼠HMGB1 mAb IgG2b 2G7如前所述7,10eIF2a siRNA分子及其阴性对照物来自Life Technologies（目录：4392420）。重组NLRP3蛋白来自Abnova。从PKR中纯化重组标记的PKR蛋白-/-稳定表达标记PKR的小鼠胚胎成纤维细胞。从过度表达标记ASC和Procaspase-1（Origene）的HEK293A细胞中纯化重组标记ASC与Procaspase1蛋白。抗人裂解IL-1β（D116）购自Cell Signaling。抗小鼠IL-1β（sc-1251）、抗小鼠caspase-1（sc-514）和抗人caspase-2（sc-622）抗体来自圣克鲁斯。
细胞制备和刺激
如前所述分离和培养腹腔巨噬细胞7原代骨髓源性巨噬细胞（BMDM）和骨髓源性树突状细胞（BMDC）在体外如前所述18用100nM佛波醇-12-氨基丁酸-13-乙酸酯（PMA）诱导人THP1细胞分化3h。106将腹腔巨噬细胞、BMDM、BMDC或PMA-分化的THP1细胞置于12孔板中，用超纯LPS（500 ng/ml）刺激4 h，然后用MSU（150μg/ml）、ALU（200μg/ml大肠杆菌（MOI=20）持续6小时（感染后1小时通过向培养基中添加抗生素来阻止细菌生长），或按指示用ATP（5 mM）脉冲30分钟或1小时。用Poly I:C（50μg/ml）刺激超纯LPS（1 ng/ml）激发的小鼠腹腔巨噬细胞16小时。对于沙门氏菌感染，野生型鼠伤寒沙门氏菌在Luria-Bertani肉汤中培养过夜，然后以1:100的稀释度重新接种，并生长到中指数期（3 h），以诱导沙门氏菌致病岛1型III分泌系统的表达。为了尽量减少沙门氏菌感染期间NLRP3炎性体激活的参与+/+和PKR-/-巨噬细胞感染了野生型鼠伤寒沙门氏菌（感染的多重性为5到100）。感染后1小时收集上清液样本。研究AIM2炎症小体激活，PKR+/+和PKR-/-使用Lipofectamine 2000以（1μg DNA加3.5μl Lipofectamine 2000/ml）的浓度将Poly（dA:dT）转染巨噬细胞。转染后6 h收集上清液样本。分析Caspase-1激活、HMGB1和LDH释放。为了研究DNA转染诱导的IL-1β裂解，LPS引物PKR+/+和PKR-/-以5μ/ml的浓度用Poly（dA:dT）/Lyovec（Invivogen）转染巨噬细胞。这种方法使细胞死亡最少。用Western blot分析细胞裂解物和沉淀上清液。
PKR的药理抑制
PKR抑制剂2-氨基嘌呤（2-AP）购自Sigma。将2-AP溶于磷酸盐缓冲盐水：冰醋酸（200:1）中，温度为60°C，持续60分钟。PKR抑制剂C13H（H）8N个4OS从Calbiochem购买。用2-氨基嘌呤（2-AP）（0.5或1.0 mM）或C13H（H）8N个4OS（0.25或0.5μM）1至4小时，然后用各种炎症小体激活剂刺激。由于非靶向效应，不建议使用更高浓度的上述PKR抑制剂。用Western blot分析细胞裂解物和沉淀上清液。
酶联免疫吸附试验
根据制造商的说明，对细胞培养上清和小鼠血清样品进行小鼠IL-1β、IL-6、TNF、IL-18（研发系统）和HMGB1（IBL INTERNATIONAL）的检测。
转染
106PKR的BMDC+/+或PKR-/-用超纯LPS预处理小鼠2 h，然后用脂质体2000转染5μg Poly I:C 6 h。在另一组实验中，超纯LPS预处理BMDCs（106单元格）来自PKR+/+或PKR-/-使用Nucleofector（程序V-01）和细胞系Nucleofector Kit V（Amaxa AG）通过电穿孔将5μg Poly I:C或大肠杆菌RNA（Ambion）转染给小鼠。3h后，取细胞提取物和沉淀上清液，进行Western blot分析。
HEK293A细胞中的重组炎症小体
对于人类NLRP3炎性体重建分析，0.2×106将HEK293A细胞接种在缺乏抗生素的细胞培养基中的24孔板上。24小时后，使用脂质体2000将表达IL-1β原和炎症组分（Origene）的质粒转染细胞，如ASC、前caspase-1、NLRP3或NLRP1。然后将这些修饰细胞与表达PKR（目录：puno-hPKR，Invivogen）或特定shRNA（目录：ksina42-hPKR，Invivogen）的质粒共同转染，以击倒内源性PKR。使用控制质粒将DNA总量标准化为每孔600纳克。24小时后，收集细胞裂解物，通过Western blot分析IL-1β成熟和Caspase-1裂解。
免疫沉淀
使用针对PKR、NLRP3、Flag或Myc的抗体，在4°C条件下，在20μl蛋白A/G珠（Santa Cruz）存在下过夜，从细胞裂解中沉淀蛋白质。蛋白质复合物用裂解缓冲液洗涤四次，然后在95°C下培养5分钟，并通过Western blot分析进行解析。
免疫印迹
如前所述，通过甲醇/氯仿沉淀从无细胞上清液中提取蛋白质18细胞提取物的制备如前所述7样品通过4-20%SDS-PAGE或4-20%天然PAGE分离，并转移到PVDF膜上。用重组HMGB1蛋白进行Western blot分析，绘制标准曲线，测定培养基中HMGB1的相对含量。
PKR自动磷酸化分析
如前所述，PKR磷酸化通过PKR自磷酸化分析进行评估15,16对于小鼠细胞衍生样本，建议使用PKR自磷酸化分析。
凝胶过滤色谱法
如前所述19，小鼠巨噬细胞的新鲜可溶性裂解物通过低渗裂解和27号针头剪切制备。使用Bio-Rad Duoflow色谱系统在PBS中使用2 mM DTT在Biosil 400凝胶过滤柱上运行可溶性裂解物（0.6 mg总蛋白）。
无细胞系统中的重组炎症小体
将重组NLRP3、ASC和前caspase-1与重组PKR和ATP（2.5mM）/Poly I:C（0.001μg/mL）在37°C下的PKR反应缓冲液（20 mM HEPES[pH7.4]、10 mM MgCl2、40 mM KCl、2 mM DTT）中培养1小时。通过水解WEHD-pNA来测量caspase-1活性。
大肠杆菌-诱导性腹膜炎和内毒素血症模型
巴基斯坦卢比-/-和PKR+/+小鼠腹腔注射活的大肠杆菌(2×109每只鼠标）。6h后采血，ELISA法检测血清IL-1β、IL-18、HMGB1和IL-6水平。同时，用10ml PBS洗涤腹膜腔。使用中性粒细胞标志物GR-1通过流式细胞术分析灌洗液中的中性粒细胞流入。对于细菌滴度实验，PKR+/+和PKR-/-小鼠接受活的2×109
大肠杆菌进入腹腔。24小时后测量腹腔和脾脏的细菌滴度大肠杆菌挑战。为了防止样品采集过程中出现其他细菌污染大肠杆菌用氨苄青霉素抗性基因进行了转化。用含氨苄西林的LB琼脂平板测定细菌效价。对于内毒素血症实验，PKR-/-和PKR+/+小鼠接受20mg/kg LPS，2.5小时后采血。ELISA法测定血清IL-1β、IL-18、TNF和IL-6水平。
统计分析
使用Student t检验和单因素方差分析对所有不同组进行比较。p值<0.05被认为具有统计学意义。
