果蝇属中心蛋白需要与钙调蛋白相互作用，才能在中心体和神经元基底体发挥作用，但在精子基底体则无此作用

PLP与CaM的交互依赖于PACT域内的CBD2

鉴于缺乏关于12种可能的PLP亚型的信息，我们选择了PLP^PF公司用于我们的研究（补充图S3A）。以前称为“长”亚型，PLP^PF公司共包含13个外显子（只缺少非常小的外显子2、10和12）。我们展示了PLP^功率因数是一个合理的选择，因为它定位于中心体（补充图S3B）并能完全解救公共图书馆⁻空动物（参见后面的讨论）。我们将参考PLP^PF公司作为本文其余部分的PLP。为了确定PLP和CaM之间的直接相互作用，我们将PLP截断为五个片段（PLP^一层楼–PLP^五楼)，注意不要破坏预测的线圈域(图2A). 这些片段被N端GFP标记并转染到S2细胞中（补充图S4A）。如预期，PLP^五楼（包含PACT结构域）定位于中心粒(图2B). 感兴趣的PLP^四层在S2细胞中定位于中心体的低频率（补充图S4B），但在表达GFP:：PLP的转基因动物中没有显示中心体定位^四层（补充图S4C）。综上所述，这些结果证实PACT结构域是PLP的主要中心体靶向结构域。转染S2细胞的免疫共沉淀显示CaM与PLP相互作用^五楼但无法与PLP交互^一层楼–PLP^四层（补充图S4D）。对CaM和五个PLP片段中的每一个进行酵母双杂交（Y2H）分析表明，PLP^五楼和CaM直接交互(图2C).

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图2：

PLP通过PACT域中的CBD2绑定CaM。（A） 可编程逻辑器件^PF公司在指定的氨基酸位置分为五个片段。F5（绿色）包括PACT域，其中包含CBD1和CBD2（红色）。蓝色方块表示预测的线圈区域。（B） S2细胞转染F5-GFP（绿色）并共染Asl（红色）。插图，所示中心粒的放大图（箭头）。棒材，5μm。（C） Y2H显示CaM和F5的直接相互作用，如SD–Ade–His–Leu–Trp（QDO）上的生长和SD–Leu-Trp+Aureobasidin A+X-α-Gal（DDOXA）上的蓝色生长所示。（D） CBD1和CBD2的氨基酸序列。黄色区域表示突变的残基。Y2H列显示了每种交互作用的图片和经验判断的强度。QDO上的生长以及DDOXA和SD–Ade–His–Leu–Trp+Aureobasidin A+X-α-Gal（QDOXA）板上的生长和颜色表明相互作用。

PACT域包含两个高度保守的CaM-结合位点，其缺失会降低PACT靶向效率(Gillingham和Munro，2000年). 使用基于Web的预测程序(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/)，我们改进了PLP中CaM-结合位点的位置。我们定义了保守的C是B类编结D类域1（CBD1；VESHRKALVYQKR）和CBD2（ALAIIAIQRIKYIGR）是残基“得分”最高的区域，为7-9(雅普等., 2000). 这些CBD在物种之间是保守的，从苍蝇到人类和酵母的几个残基是绝对保守的（补充图S5）。我们首先产生了CBD1或CBD2的缺失突变；这些删除明显扰乱了PLP^五楼-CaM相互作用如Y2H所示(图2D). 然而，这些删除很可能会严重破坏PACT域的整个结构。因此，我们在CBD1和CBD2中的保守赖氨酸（K）和精氨酸（R）残基处产生了点突变，这已被证明破坏了Spc110（酵母中心蛋白）和人类Pcnt与CaM的相互作用(弗洛里等., 2000;Gillingham和Munro，2000年). 将CBD2（PLP）中的Ks和Rs突变为丙氨酸^五楼-2KR），但不在CBD1（PLP）中^五楼-1KR）扰乱了PLP^五楼-CaM相互作用(图2D). 作为对照，我们突变了每个CBD中的相邻残基。PLP公司^五楼-1LV突变体没有破坏与CaM的相互作用，而PLP^五楼-2IQ减少了互动，但没有消除互动(图2D). 为了确定这些突变体是否可以与细胞中的CaM相互作用，我们首先尝试通过在S2细胞中共过表达CaM和每个突变体来进行共免疫沉淀（Co-IP）实验。我们注意到突变体结构的稳定性存在很大差异，无法直接比较突变体和对照免疫沉淀（补充图S6A）。因此，我们开发了一个通用域名格式伊托软骨-t吨靶向（Co-MT）分析，其中我们同时表达GFP:：CaM和mito-RFP-X（其中X是任何PLP^五楼突变体；看见材料和方法)来自单个质粒。在本试验中，PLP^五楼碎片更稳定，可能是因为它们固定在线粒体表面（补充图S6B）。然后，我们确定GFP-CaM是否可以通过与每个突变等位基因相互作用而被吸引到线粒体上。使用Co-MT分析，我们显示PLP^五楼-2KR不能向线粒体募集GFP-CaM，而PLP^五楼-2IQ与PLP几乎无法区分^五楼-WT（补充图S6C），确认PLP^五楼-2KR无法与CaM交互。总之，我们成功地生成了一个突变体，该突变体破坏了PLP-CaM相互作用（PLP^五楼-2KR），让我们测试此交互的重要性。

将PLP靶向中心体需要PLP-CaM相互作用

我们通过RNA干扰（RNAi）去除CaM表明CaM在将PLP定位于中心体中起着直接作用，但间接影响PLP定位的可能多效性效应不能被忽视。为了测试PLP-CaM相互作用是否至关重要，我们设计了PLP^五楼-2KR和PLP^五楼-2IQ突变为全长PLP以产生PLP^2千卢比和PLP^2智商为了测试这些突变对PLP的影响，我们将每种GFP融合物转染到S2细胞中。我们在盲实验中使用了经验测量值，将PLP定位到中心体的强度分为强定位、弱定位或无定位(图3). PLP中心体定位效率明显降低^2千卢比，而控制PLP^2智商与PLP无法区分^重量(图3，A和B). 这些数据支持一个模型，其中CBD2处的CaM相互作用是PLP靶向中心体所必需的。

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图3：

CBD2突变破坏了PLP中心体靶向性。（A） 转染GFP-PLP的S2细胞的代表性图像^PF公司或每个CBD2突变体（绿色）。对细胞进行Asl（红色）染色，以确定中心粒。GFP在中心粒上的定位强度根据经验确定为强（顶部）、无信号（底部）或弱（这两个水平之间的任何值）。棒材，5μm。（B） 测定所示基因型中心体的PLP定位强度。至少进行了三个独立的实验，对150个以上的细胞进行了评分。“强”本地化的百分比显示在每列上方。PLP中PLP定位显著降低^∆CBD2和PLP^2千卢比（ANOVA后进行配对土耳其检验***第页<0.001），但PLP正常^2智商（不另作说明，不重要）。

PLP-CaM相互作用对于PLP在苍蝇中心体的定位和功能是必要的

虽然S2细胞中的PLP定位数据表明PLP-CaM相互作用具有重要作用，但其生理重要性尚不明确。因此，我们转向动物模型，果蝇属先前使用完全功能丧失突变的研究证明了PLP在果蝇属1）在中心体成熟（PCM募集）中的作用，2）在减数分裂细胞中维持中心粒完整性和精子发生过程中活动纤毛的正确形成中的作用以及3）在建立感觉器官纤毛中的作用(马丁内斯·坎波斯等., 2004). 我们假设PLP需要与CaM进行一个或多个这些功能的交互。我们的方法是对PLP完全丧失功能突变的动物与表达突变PLP但缺乏结合CaM（PLP）能力的动物进行详细比较^2千卢比).

我们首先描述了表达公共图书馆²¹⁷²等位基因，在外显子6和7之间的P元件插入，不产生任何可检测的蛋白质，并针对PLP的N末端产生抗体（补充图S7A）。我们将参考公共图书馆²¹⁷²/Df（3L）BrdR15作为公共图书馆⁻贯穿始终。为了确定PLP功能丧失对中心体成熟的影响，我们分析了来自对照组和公共图书馆⁻突变体苍蝇在有丝分裂期间中心体招募PCM成分Cnn的能力(图4A). 考虑到这些细胞中顶端和基底PCM数量和行为之间的已知差异(Rebollo公司等., 2007;Rusan和Peifer，2007年)，我们分别测量了每个中心体的Cnn水平。公共图书馆⁻NBs显示中期顶端和基底中心体的Cnn显著减少(图4A和补充图S8，基因型C与基因型1）。我们还注意到在整个有丝分裂过程中PCM的整体紊乱(图4A)，与前面描述的类似(马丁内斯·坎波斯等., 2004). 这种紊乱在NBs中似乎更为突出，因为我们无法在有丝分裂（中期）精原细胞中检测到PCM的紊乱（补充图S7B）。为了量化NB中的无序性，我们测量了中心体圆度（见材料和方法). 在对照组NB中，中心体相当圆（0.9，其中1为完美圆），而在公共图书馆⁻NB、中心体更加杂乱无章，圆形度显著降低（0.7；图4C，C与。图1). 在突变体中，经常有额外的PCM超出测量区域。因此，这种圆形度测量很可能低估了紊乱，因为它只测量与中心体相邻的PCM。这种紊乱在顶端和基底中心体中都同样可见，在公共图书馆⁵（补充图S7C），一个低形态等位基因(马丁内斯·坎波斯等., 2004)我们将无义突变映射到残基Q1900（补充图S3A）。有趣的是，尽管中心体结构紊乱，但以前的报告表明公共图书馆⁻成神经细胞可以组装功能纺锤体(马丁内斯·坎波斯等., 2004;Lerit和Rusan，2013年). 这些数据共同证实，在有丝分裂期间，PLP对于适当的PCM水平和组织是必需的。

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图4：

PLP-CaM相互作用是神经母细胞中正确的PCM组织所必需的。（A） 来自对照组（基因型C）和公共图书馆⁻（基因型1）苍蝇染色Asl（绿色）检测中心粒，Cnn（红色）检测PCM。顶端（箭头）和基部（箭头）中心体增大。（B） 在突变体中表达指示转基因（GFP，绿色）的动物的NBs公共图书馆⁻背景。NBs被拉紧，Asl（红色，左）检测中心粒，Cnn（红色，右）检测PCM。所有数字均指基因型键（左上角）。图像是整个NB体积的最大强度投影。棒材，10μm。（C，D）对所示基因型的至少15个顶端和15个基底中心体进行圆形度和GFP测量。对每个心尖和基底中心体进行了两次独立的方差分析测试（图上的蓝色和绿色条），然后进行配对土耳其测试。（C） 圆度测量显示中心体形状在公共图书馆⁻（基因型1***第页< 0.001, ****第页<0.0001），但与对照组（基因型C）相比公共图书馆^重量（基因型2，n.s.，不显著）。循环在公共图书馆^2千卢比突变型（基因型3***第页< 0.001, **第页<0.01），但不是公共图书馆^2智商突变型（基因型4，无显著性差异）。（D） 中心体GFP信号归一化为心尖公共图书馆^重量水平（基因型2）。公共图书馆^2千卢比顶端和基底中心体的水平显著降低（基因型3****第页< 0.0001).公共图书馆^2智商水平高于公共图书馆^重量在顶端中心体上（基因型4***第页<0.001），这可能是由于公共图书馆^2智商转基因。在基础上未测量到显著差异公共图书馆^2智商中心体。

为了验证我们的假设，即PLP需要与CaM相互作用才能在体内定位和发挥作用，我们制作了转基因动物，表达由泛素启动子驱动的三个GFP标记的转基因基因：1）野生型PLP:：GFP（简称为公共图书馆^重量)，2）PLP-2IQ:：GFP（简称公共图书馆^2智商)，和3）PLP-2KR:：GFP（简称可编程逻辑器件^2公里). 通过Western blotting（补充图S9A）和测量GFP荧光的细胞质水平（补充图S9B）分析，我们选择了产生类似数量蛋白质的转基因动物。接下来，我们将每一个转基因导入公共图书馆⁻产生以下基因型的背景：1）公共图书馆^重量;公共图书馆⁻（救援苍蝇），2）公共图书馆^2智商;公共图书馆⁻（对照突变体），和3）公共图书馆^2千卢比;公共图书馆⁻（CaM相互作用突变体）。难以解释的是，在Western blot上，突变背景中的所有三个转基因在内源性PLP大小上都显示出可检测的带（补充图S9A，蓝色星号）。然而，详细的PCR基因分型证实，内源性PLP位点在所有三种基因型中均被破坏（补充图S9C）。这条较低的带可能代表GFP标记蛋白的截短或公共图书馆²¹⁷²产生一种蛋白质产品，通常无法检测到，但在转基因存在下可以稳定下来。对于本研究最重要的是，无论其来源如何，该产品都是无功能的，因为它无法拯救公共图书馆⁻突变表型（见后面的讨论）。

为了确定干扰PLP-CaM相互作用对NB中PLP定位和中心体功能的影响，我们分析了来自可编程逻辑器件^重量;公共图书馆⁻,公共图书馆^2智商;公共图书馆⁻，以及公共图书馆^2千卢比;公共图书馆⁻苍蝇(图4B). 对顶部和底部有丝分裂中心体的分析显示公共图书馆^2公里与相比的水平可编程逻辑器件^重量(图4D基因型2 vs.基因型3）。尽管减少了公共图书馆^2千卢比在中心体，PCM分析显示，无论是在顶端还是基底中心体上，Cnn水平都没有降低（补充图S8B，基因型5对基因型6）。然而，中心体的圆形（形状）在公共图书馆^2千卢比;公共图书馆⁻NB与公共图书馆^重量;公共图书馆⁻(图4C，基因型2 vs.基因型3）和公共图书馆^2智商;公共图书馆⁻(图4C基因型2 vs.基因型4）。值得注意的是公共图书馆^2千卢比野生型背景中的转基因显示出轻微的显性效应，增加了PCM水平（补充图S8，基因型2 vs.基因型3），但对中心体循环没有显性效应（补充图S9D，基因型2vs.基因类型3）。综上所述，我们在动物体内的数据强烈表明，PLP-CaM相互作用需要靶向/锚定PLP到中心体并组织PCM，但不需要招募适当数量的PCM。

果蝇属细胞培养和双链RNA干扰

果蝇属如前所述进行细胞培养、体外dsRNA合成和dsRNA处理(罗杰斯和罗杰斯，2008年). 简而言之，S2和Kc细胞在Sf900II培养基（纽约格兰德岛生命科技公司）中培养，每3-4天分裂一次。RNAi在六孔组织培养板中进行。用10μg dsRNA在1ml培养基中处理细胞（50-90%汇合），每隔一天补充新鲜培养基/dsRNA，持续4-7天。使用以下基因特异性引物扩增RNA合成的DNA模板：对照（5′-CGCTTTCTGGATTCATCGAC-3′和5′-TGAGTAACCTGGCTAGG-3′），PLP（5′-TCAGTTTTCCAGTTTTTCTCC-3′和5′-TACAAACCACGAAGAATTGG-3′）、CaM（5′-CGATCAGCTGACAGAG-3′和5’-AGTATTTCCCCACACATCC-3′）和Sas6（5′-TTGAACCGTCTAC-3′和5'-CTTGAGTCCTCTACTT-3′）。

免疫荧光

将S2和Kc细胞涂布在1.5号伴刀豆球蛋白A涂层盖玻片上，并让其扩散30–60分钟。然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）短暂清洗细胞，并在−20ºC甲醇中固定15分钟。细胞在一级抗体中在室温下染色1小时，二级抗体染色30分钟，并安装在Aqua-Poly/Mount（Polysciences，Warrington，PA）。将第三季幼虫的全脑在PBSTx（PBS，0.3%Triton X-100）中的9%甲醛中固定15分钟，在PBSTx中洗涤3×15分钟，并在PBT（PBS、0.1%吐温-20，1%牛血清白蛋白[BSA]）中封闭1小时。为了进行脉络神经分析，将第三天蛹的整个头部固定为大脑20分钟。然后从头部取出整个触角。为了进行睾丸成像，将幼虫或成年睾丸解剖并固定为大脑。大脑或睾丸在PBT和4%正常山羊血清（NGS）中的一级抗体中孵育4℃过夜。在多次清洗后，样品被进一步封闭在改良PBT（PBS、0.1%吐温-20、2%牛血清白蛋白和4%NGS）中，并在室温下与二级抗体孵育2小时。样品最终在PBST（PBS，0.1%吐温-20）中清洗3×15 min，并安装在Aqua-Poly/Mount中。使用的主要抗体是兔抗PLP（1:5000；罗杰斯等2008年）、豚鼠抗Asterless（1:30000；亚利桑那州图森市亚利桑那州大学亚利桑纳大学癌症中心G.Rogers赠送）、小鼠抗CaM（1:500，05-173；Millipore）和兔抗Cnn（1:2000，T.Megraw赠送（佛罗里达州立大学，塔拉哈西；豪尔（Heuer）等., 1995). 次要抗体为Alexa Fluor 488、568或647（1:500；Life Technologies）。以1:500的比例使用磷灰石，并与二级抗体一起在室温下搅拌添加3小时。

构建和转染

编码全长PLP的cDNA的合成^PF公司由GenScript委托。该质粒使用以下引物对所有PLP片段（1-5）进行模板PCR扩增：片段1（5′-CACATGAATCTGTACACTATACGTG-3′和5′-AGGCGGATCCTCCTCTTCC-3′）、片段2（5′-CACCATGTCCCTCCTTGGATGC-3′和5’-TGGAGGAGAATGTG-3′）、，片段3（5′-CACATGGATCTCAAGAGCATGCGGG-3′和5′-CAGCCGCTCGATTCGCGC-3′）、片段4（5′-CACCATGACGCTGCGGTCATGGAGG-3’和5′-TTCATTGAAGTTCAACTCTG-3′），片段5（5′-cACATGCGTAACCGCAAGCCAG-3′and 5′-ATGCGCATGCTC-3′）。将这些片段定向克隆到pENTR/D载体中，用于Gateway克隆系统（Life Technologies）。使用制造商的协议进行网关重组反应，用GFP或FLAG标记每个片段。在S2细胞中工作时，使用pAWG（肌动蛋白启动子，C-末端GFP标记）目的载体，而pAFW（肌动分子启动子，N-末端FLAG标记）目的向量则使用3xFLAG标记这些相同的片段，用于Co-IP实验。有关pAWG和pAFW矢量的详细信息，请访问果蝇属基因组资源中心（DGRC；印第安纳州布卢明顿；https://dgrc.cgb.indiana.edu/主页)和果蝇属网关网站(http://emb.carnegiescience.edu/labs/murphy/Gateway%20vectors.html). 为了生成GFP-40aaLinker-CaM构建体，从T.Megraw提供的未发表的载体中PCR扩增出一个带有N端40氨基酸连接子的CaM cDNA，并克隆到pENTR/D载体中。然后使用网关系统将40aaLinker-CaM标记到pAGW（肌动蛋白启动子，N末端GFP标记；DGRC）中，以生成GFP-40aaLinker-CaM。所有缺失和点突变均使用QuikChange II试剂盒（安捷伦科技公司）按照制造商的方案产生。S2或Kc细胞通过遵循制造商的方案，使用Effectene（Qiagen，Venlo，Netherlands）在含有融合单层细胞的六孔板中转染。转染48小时后处理细胞进行免疫荧光或免疫沉淀。

对于线粒体靶向实验，我们修改了Gateway目的载体pAGW（肌动蛋白启动子，N末端GFP标签；DGRC）。我们用斯图我和年龄我删除GFP的序列，然后将PCR产物连接到其位置，该PCR产物包括GFP的N端36个氨基酸果蝇属Tom20基因（马里兰州贝塞斯达国家心肺血液研究所洪旭的礼物），紧接着是编码TagRFP的序列。这个新的目的载体被命名为pAT20TRW。然后我们从这里描述的pAGW-40aaLinker-CaM结构中扩增了启动子、GFP和钙调蛋白，并将其插入Mlu公司我站在pAT20TRW的主干线上，制作pAT20TRW-AGFP-CaM。然后通过标准网关克隆方法将PLP片段导入pAT20TRW-AGFP-CaM。这些载体允许从同一质粒同时表达PLP片段和GFP-钙调蛋白的线粒体靶向TagRFP融合。

免疫沉淀和免疫印迹

用GFP-CaM和五个FLAG-PLP片段中的每个片段共同转染S2细胞。在CLB（50 mM Tris，pH 7.2，125 mM NaCl，2 mM二硫苏糖醇，0.1%Triton X-100和0.1 mM苯甲烷磺酰基氟化物）中溶解转染细胞，通过离心进行预分离，并稀释至5 mg/ml。将兔抗GFP抗体（克隆ab290；英国剑桥Abcam）添加到裂解液中，并在4ºC下摇动60分钟。然后将30μl平衡蛋白A Sepharose珠（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）添加到裂解液中，并在4℃下再摇晃60 min。然后在CLB中清洗珠子三次，并在SDS–PAGE样品缓冲液中煮沸5分钟。Co-IP实验中的Western blot使用了以下主要抗体：小鼠抗GFP（1:10000，克隆JL-8；Clontech Laboratories，Mountain View，CA）和小鼠抗FLAG（1:1000，克隆M2；Sigma-Aldrich）。

从dsRNA处理的细胞中提取的S2细胞提取物（补充图S1C）通过在PBS中再悬浮细胞颗粒和0.1%Triton X-100产生。将SDS–PAGE样品缓冲液添加到提取物中并煮沸5分钟。进行蛋白质印迹以确定击倒效率。动物组织提取物(图4A)将每个基因型的20个大脑切片，添加到50μl的1×SDS–PAGE样品缓冲液中，用微管杵彻底研磨，并煮沸样品5分钟。使用以下抗体：小鼠抗钙调素（1:500，MA3-917；Thermo Scientific），小鼠抗α-微管蛋白（1:5000，克隆DM1a；Sigma-Aldrich）、豚鼠抗Sas6抗体（1:5000；G.Rogers赠送）和兔抗PLP抗体（1:500；罗杰斯等., 2008).

显微镜

所有图像均在配备100×（1.49数值孔径、偏振和全内反射荧光）物镜、CSU-22旋转圆盘共焦头（日本东京横河）和行间转移冷却电荷耦合器件相机（CoolSNAP HQ2；Photometrics，亚利桑那州Tuscon）的尼康钛显微镜上采集。激发激光由配备491、561和642纳米固体激光器的激光合并模块提供（英国桑德兰VisiTech国际公司）。排放过滤器（Semrock，Rochester，NY）由MAC6000（Ludl Electronic Products，Hawthorne，NY）控制。该系统由MetaMorph软件（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）控制。对于固定电池，Z轴-通过获取间距为200nm的光学切片，收集覆盖每个细胞整个体积的堆栈；这些数据显示为最大强度投影。

荧光测量和统计分析

确定野生型和突变型PLP定位于S2细胞中心粒的相对数量(图1和​和3三和补充图S2），我们在盲实验中对所有基因型使用了荧光强度的经验判断。细胞在显微镜上用外荧光显示，首先通过红通道中的Asterless染色识别中心粒标记。然后将过滤立方体切换到绿色通道，从而确定荧光强度的判断。这种强度被判断为强、弱或无信号。图3显示了一个强信号和无信号的示例。这两个极端之间的任何东西都会发出微弱的信号。在这些实验中，每个试验条件下至少检测200个细胞。每个独立试验在同一天进行，包括野生型（对照dsRNA或全长PLP）和非野生型（dsRNA处理或突变公共图书馆等位基因）细胞。对中所示的每个实验在三天内进行了三次独立的盲试图1和​和3三和补充图S2；给出了所有三个试验的平均值。

对于成神经细胞的荧光测量，所有被测基因型的细胞在同一天被解剖和处理。测量总是相对于特定日期的对照进行的，这构成了一个单独的实验，并重复三次。通过中心体体积加总强度来测量Cnn和GFP的水平，然后用一个足够大的感兴趣区域（ROI）来概括中心体的体积，并收集总积分强度的测量值。背景积分强度从相邻细胞质区域的相同ROI中收集，并从中心体测量值中减去，以获得最终值。用于中心体圆度分析(图4)用手勾勒中心体荧光轮廓，并使用ImageJ（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）中的形状描述符进行分析。为了测量细胞质GFP水平，选择了远离中心体、细胞核和所有其他显著细胞特征的成神经细胞细胞质区域。625像素的总荧光强度²测量单个共焦平面上该区域的面积，提供固定体积细胞质的总荧光。将这些数据归一化为PLP的平均总荧光强度^重量（WT中）。所有分析的图像都是在16位进行数字化的，为了避免饱和，最多只能使用相机全动态范围的四分之三。ImageJ用于所有图像分析。所有统计分析和绘图均使用Prism软件（GraphPad，La Jolla，CA）进行。所有图形均使用PhotoDraw（Microsoft，Redmond，WA）进行组装。

酵母双杂交

PLP和CAM片段被引入pDEST-pGADT7和pDEST-pGBKT7(罗西尼奥等., 2007)使用网关克隆系统（生命技术）。在用于克隆之前，使用酵母介导的重组将pDEST-pGBKT7中的卡那霉素抗性盒替换为氨苄西林抗性盒。使用标准技术将pGADT7或pGBKT7中的片段分别转化为酵母菌株Y187和Y2HGold（Clontech，Mountain View，CA）。携带这些质粒的酵母培养物培养至OD₆₀₀30ºC时，在SD Leu或SD–Trp培养基中酌情添加0.5，以保持质粒选择。为了进行交配，将20μl的Y187菌株和Y2HGold菌株添加到100μl的2×酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖培养基中的96 well培养皿中。交配培养物在30℃下摇晃培养20–24小时。然后使用多点复制器（VP 407AH；V&P Scientific）将约3μl细胞固定在SD–Leu–Trp（DDO）板上，并在30℃下培养板5天。将这些板复制电镀到四个板上：1）DDO，2）QDO（SD–ade–leu-trp–ura），3）DDOXA（SD–leu–trp板，含有Aureobasidin A（Clontech）和X-α-Gal（Gold Biotechnology，St.Louis，MO），4）QDOXA。平板在30ºC下生长5天。根据蓝色的生长发育情况对相互作用进行评分。本研究中使用的质粒都不能单独驱动酵母双杂交报告酶的活性（未公布的数据）。

我们感谢杰里米·史密斯的评论和建议。N.M.R.由国家心脏、肺和血液研究所/国家卫生研究院（1ZIAHL006126）的壁内研究部门提供支持。G.C.R.由美国国家癌症研究所/美国国家卫生研究院（P30CA23074）和美国国家癌症学会/美国国家健康研究院（P50CA95060）、美国国家科学基金会（1158151）和亚利桑那州生物医学研究委员会（1210）支持。T.L.M.由国家普通医学科学研究所/国家卫生研究院（R01GM068756）提供支持。