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神经科学杂志。2014年9月10日；34(37): 12547–12559.
数字对象标识：10.1523/JNEUROSCI.0324-14.2014
预防性维修识别码：项目经理4160783
PMID：25209292

通过C/EBPβ的正性自身调节BDNF反馈环介导海马记忆巩固

Dhananjay Bambah-Mukku公司,1,2 阿莱西奥·特拉瓦利亚,1,* 狄龙·Y·陈,2,* 加布里埃拉·波洛尼尼,1和克里斯蒂娜·阿尔贝里尼通讯作者1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

目前对记忆巩固机制的时间进程和调节知之甚少。脑源性神经营养因子（BDNF）已被证明调节记忆巩固的维持，但这种调节的机制尚不清楚。通过对大鼠进行抑制性回避（IA），我们发现通过CCAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）的海马BDNF阳性自动调节反馈回路对调节记忆巩固是必要的。在训练中，BDNF的快速学习诱导需求伴随着快速从头开始翻译控制cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和C/EBPβ表达持续激活的诱导。后者反过来控制bdnf外显子IV转录物和BDNF蛋白两者都是必需的，并且与最初的BDNF需求一起调节记忆巩固。训练后48小时，C/EBPβ和pCREB降低，甲基-CpG结合蛋白-2、组蛋白去乙酰化酶-2和开关依赖性-3a结合增加，自动调节环终止bdnf外显子IV发起人。

关键词：BDNF、C/EBP、巩固、海马体、记忆、记忆持久性

介绍

长期记忆最初是不稳定的，但随着时间的推移，通过一个称为巩固的过程，对中断变得不敏感(戴维斯和乡绅，1984年;杜岱，2004;Alberini，2009年). 被广泛研究的破坏固结的药理化合物是蛋白质和RNA合成抑制剂，它们提供了证据从头开始转录和翻译是记忆巩固的进化保守机制。因此，许多研究，特别是基于基因突变或缺失的研究，都集中于确定哪些基因和蛋白质介导长期记忆形成。虽然记忆形成所必需的几个基因和蛋白质的性质已经确定，但学习依赖性的时间进程从头开始伴随记忆巩固进展的蛋白质合成和分子事件的特征仍然很差。这种表征对于理解记忆巩固和存储的功能机制的进展至关重要，这为如何/何时干预以增强或削弱记忆提供了重要信息。

大多数关于记忆巩固的早期研究都认为从头开始基因表达只需要一个非常短的时间窗口，大约在训练后1–2h（h）。然而，在过去十年中，有几份报告表明，训练激活了海马分子的变化，这些变化的进展在一天或更长时间内至关重要。这些变化包括谷氨酸受体的重新分布、蛋白激酶的激活和基因表达调控(Taubenfeld等人，2001a,b条;Katche等人，2013年). 特别是，在接受抑制回避训练（IA）的大鼠的海马中，进化上保守的CREB-C/EBP通路的关键作用在训练后立即开始，持续超过20小时。事实上，IA记忆形成伴随着CREB活化的显著增加（Ser133、pCREB磷酸化；Taubenfeld等人，2001a,b条)训练后持续20小时以上，需要在训练后24小时以上表达CREB下游靶基因C/EBPβ(Taubenfeld等人，2001a). 这些数据表明从头开始对记忆巩固至关重要的蛋白质合成必须在IA训练后24小时内进行(Alberini，2009年). 一致的是，在下台IA训练后12小时，向海马注射茴香霉素，在训练后第2天，记忆保持完好，但在训练后7天，这种记忆衰退，这表明从头开始训练后～12小时的蛋白质合成对记忆的持久性至关重要(Bekinschtein等人，2007a). 此外，海马BDNF的表达在IA训练后12小时增加，训练后12 h阻断海马BDNF-会阻碍记忆持久性。最后，将重组BDNF共同注射到海马中可以缓解训练后12小时注射茴香霉素引起的记忆障碍(Bekinschtein等人，2008年)，表明BDNF对内存持久性至关重要(Medina等人，2008年). 尽管有这方面的知识，但介导蛋白质合成和BDNF对记忆持久性的这种暂时性延长需求及其调节的分子机制尚不清楚。此外，还不知道内存整合的脆弱阶段会持续多久，以及是什么机制结束了这一过程。在这项研究中，我们准确地提出了以下问题：扩展的基因表达和BDNF需求是线性过程吗？他们有联系吗？如果是，如何？那么，它们是如何终止的呢？我们使用大鼠IA来阐明诱导、进展和完成记忆巩固所需的基因表达的时间演变和BDNF依赖机制。

材料和方法

动物。

成年雄性Long–Evans大鼠，体重在200至250克之间，作为所有实验的受试者。所有动物都是单独饲养的，以12小时的光/暗周期进行饲养。实验在光循环期间进行。允许所有大鼠随意在进行任何手术之前，每天处理3分钟，持续5天。所有方案均符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》，并得到西奈山医学院和纽约大学动物护理委员会的批准。

插管植入和海马注射。

用氯胺酮（65 mg/kg，i.p.）和甲苯噻嗪（7.5 mg/kg，i.p.）麻醉大鼠，立体定向植入不锈钢导向套管（22号），以双侧靶向海马（海马角后方4.0 mm，中线外侧2.6 mm，腹侧2.0 mm；Taubenfeld等人，2001a). 将大鼠送回其家中笼子，并允许其从手术中恢复7天。在训练或恢复之前或之后的指定时间点，大鼠按照规定接受双侧注射化合物。实验时间表中的箭头指示了所有注射。每侧海马注射1μl。海马注射使用一根28号针头，该针头伸出引导套管尖端1.5 mm，并通过聚乙烯管连接至Hamilton注射器。使用输液泵以0.33μl/min的速度进行输液。注射后，将注射针留在原位2分钟，以使溶液完全分散。为了验证套管植入物的正确放置，在行为实验结束时，杀死大鼠，并用10%的福尔马林缓冲液对其大脑进行固定。通过海马体切取40微米冠状切片，并在光学显微镜下进行检查。插管放置不正确的大鼠（<2%）被从研究中剔除。

IA公司。

IA按照之前的描述执行(Taubenfeld等人，2001a). IA室（Med Associates）由一个矩形有机玻璃盒组成，分为一个安全隔间和一个减震隔间。安全舱是白色的，亮着灯，减震舱是黑色的，暗着灯。通过恒流扰频器电路将脚震传送到减震室的格栅地板。该仪器位于一个隔音、无照明的房间内。在训练过程中，每只老鼠都被放在安全的隔间里，头部背对门。10秒后，分隔隔间的门自动打开，允许老鼠进入减震隔间；大鼠通常在开门后10～20s内进入电击（黑暗）室。在大鼠进入休克室1s后，门关闭，并进行了2s的脚电击。所有涉及抗BDNF、TrkB-Fc、茴香霉素和雷帕霉素的初始行为实验均使用0.6 mA的足部电击进行。随后的生物化学和行为实验是使用0.9毫安的脚电击进行的，因为较高的电击强度会产生更强的分子变化。为了确保行为结果得到更高足震的证实，我们使用0.9 mA足震重复了训练前TrkB-Fc和训练后抗BDNF注射，并获得了可比较的结果(图5;Chen等人，2012年). 进入减震室的延迟时间以秒为单位。然后将大鼠送回其家中的笼子，并在指定的时间点进行记忆保持测试。通过将大鼠放回安全隔间并测量其进入休克隔间的潜伏期来进行保留试验。在保留测试中未进行脚电击，测试在540秒或900秒终止，如详细说明。如前所述，在一些实验中，我们还使用了未配对IA范式作为对照。在这个范例中，将大鼠暴露在环境中，1小时后将其放在脚部电击网格上，并立即进行脚部电震。因此，本研究方案暂时分离了受试者、环境和脚部电击暴露；此未配对的协议不会产生IA内存保留(Chen等人，2011年). 所有行为测试都是对实验组盲法进行的。在生化研究中，未对大鼠进行记忆保持测试。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns9991461390005.jpg

BDNF在一个自动调节的正反馈回路中募集C/EBPβ。A类，qRT-PCR分析bdnf外显子IV在指定时间点处死的训练大鼠的背海马cDNA（标准化为gapdh公司). 与幼稚相比，训练显著增加bdnf外显子IV训练后12小时和20小时的水平(n个=4-8/组；12小时，第页< 0.05; 20小时，第页< 0.01; 单因素方差分析（ANOVA）和邓内特（Dunnett）的多重比较事后（post-hoc）测试）。无增加bdnf外显子IV暴露于环境和电击1h后12h，大鼠海马出现水平（未配对方案）。数据表示为平均褶皱变化±SEM。B类,Bdnf外显子IVAS（而非SCR ODN）中断了内存整合。实验时间表如上图所示。IA训练后6小时注射ODN（箭头所示）。训练后第2天（测试1）和第7天（测试2）对大鼠进行测试。与SCR相比，AS显著降低了测试1和测试2的记忆保持力(n个=9–10/组；AS与SCR，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(1,51)= 29.14). 脚部电击提醒后，未观察到明显的恢复(第页> 0.05). 数据表示为平均潜伏期±扫描电镜***第页< 0.001.C类、琼脂糖凝胶中经溴化乙锭染色的代表性PCR片段和显示qRT-PCR的图表bdnf外显子IV用抗C/EBPβ进行ChIP后获得的启动子。这些碎片是从训练后30分钟、12小时或48小时处死的训练大鼠的背侧海马获得的。培训导致C/EBPβ与bdnf外显子IV促进者训练后12小时(n个=4/组；幼稚vs训练有素，12小时，第页<0.05，单因素方差分析，然后是Dunnett的多重比较事后（post-hoc）测试；F类(3,15)= 3.998,第页= 0.0346). 数据表示为平均输入富集百分比±SEM。天，qRT-PCR分析bdnf外显子IV训练后5小时在幼稚和训练过的大鼠海马内注射SCR-ODN或β-ODN（箭头），训练后12小时处死（正常化为gapdh公司). 培训显著增加bdnf外显子IV12小时时的水平；这种增加被β-ODN阻断(n个=6–8/组；幼稚的SCR-ODN与训练有素的SCR-DON第页<0.01，训练过的SCR-ODN与训练过的β-ODN第页<0.05，单因素方差分析，Newman–Keuls多重比较事后（post-hoc）测验；F类(2,21)= 8.136,第页= 0.0028). 数据表示为平均褶皱变化±SEM。E类在训练后5小时注射SCR-ODN或β-ODN，并在训练后20小时处死（归一化为肌动蛋白）的幼稚和训练大鼠背海马提取物中BDNF蛋白水平的Western blot示例和密度定量Western blot分析。训练后20小时BDNF水平显著增加；这种增加被β-ODN阻断(n个=6–8/组；幼稚的SCR-ODN与训练有素的SCR-DON，训练有余的SCR-OON与训练过的β-ODN第页<0.05，单因素方差分析，Newman–Keuls多重比较事后（post-hoc）测验；F类(2,20)= 5.568,第页= 0.0131). 数据表示为注射SCR-ODN的平均百分比±SEM初始对照。F类，qRT-PCR分析bdnf外显子IV在训练前15分钟注射IgG或抗BDNF抗体（箭头），并在训练后12小时处死幼年和训练大鼠的背海马cDNA（归一化为gapdh公司). 抗BDNF阻断了依赖训练的bdnf外显子IV(n个=8–12/组；幼稚IgG vs训练有素IgG，训练有余IgG vs训练练有素抗BDNF第页<0.05，单因素方差分析，Newman–Keuls多重比较事后（post-hoc）测验；F类(2,27)= 4.949,第页= 0.0155). 数据表示为平均褶皱变化±SEM*第页< 0.05, **第页< 0.01.

药物和寡核苷酸注射。

羊抗BDNF抗体购自Millipore，溶于1×PBS中。抗BDNF-抗体注射量为0.5μg/支/侧。重组人TrkB-Fc嵌合体购自R&D Systems，并溶解于PBS中。TrkB-F-c以0.5μg/支/侧注射量注射。在这些剂量下，当注射到海马体中时，抗BDNF和TrkB-Fc被用来破坏长期记忆巩固(Alonso等人，2002年). 对照羊IgG购自Sigma-Aldrich，溶于1×PBS中，每侧注射0.5μg。从PeproTech购买重组BDNF和NT-3，并将其溶解在PBS中，每侧注射0.25μg。从R&D Systems购买重组IGF-II，并在1×PBS中的0.1%BSA中溶解。茴香霉素（Sigma-Aldrich）在pH 7.4的0.9%盐水中溶解，并以125μg/μl的速度注射。该剂量最多可在6小时内阻止>80%的背海马蛋白质合成(Milekic等人，2006年). 雷帕霉素购自LC Laboratories，溶解于二甲基亚砜中，并在1×PBS中稀释至每侧1 ng/μl的最终浓度。先前的研究表明，雷帕霉素的剂量可以阻断大鼠S6激酶磷酸化和空间记忆(Dash等人，2006年). 在所有反义实验中，以2 nmol/μl的浓度注入反义寡核苷酸（ODNs）和相对加扰序列（SCR-ODNs。序列如下：C/EBPβ反义（β-ODN:5′-CAGCAGGCGGTGCATAAC-3′），C/EBP？打乱（SCR-ODN:5'-TCGGACTAAGCGGCCAC-3′），bdnf外显子IV反义（5′-CAGTCACTACTTGTCAAAGTA-3′），和bdnf外显子IV加扰（5′-ATTAACTACAAGCGTTCGACT-3′）。作为对照的各SCR-ODN含有相同的碱基组成，但顺序是随机的，与GenBank数据库中的序列没有同源性。所有ODN均在5′端和3′端的三个末端碱基上进行硫代磷酸化，以提高稳定性。ODN经反相-碳桥纯化并从Gene Link获得。

组织制备和蛋白质印迹分析。

将海马背侧置于冰镇皮质剥离缓冲液中进行解剖，并在干冰上快速冷冻。使用Polytron匀浆器在裂解缓冲液（0.2米氯化钠，5米米EDTA，10%甘油，100米米HEPES，2米米磷酸钠），含蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma；按照制造商的建议使用），0.5 m米苯甲基磺酰氟，2 m米二硫苏糖醇，磷酸酶抑制剂混合物（Sigma；按照制造商的建议使用），2 m米氟化钠，1μ米微囊藻毒素LR和1 m米原钒酸钠。蛋白质浓度通过使用Bio-Rad蛋白质测定法（Bio-RadLaboratories）测定。根据每个标记的分子量，在7.5%、10%或15%的聚丙烯酰胺凝胶上溶解5至20μg蛋白质，然后转移到Immobilon-P膜（Millipore）。根据制造商的建议，将膜封闭并与一级抗体孵育。在4°C下将一级抗体培养过夜后，根据需要在室温下用二级辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔（1:4000）或山羊抗鼠（1:4000。肌动蛋白用于解释负荷变化。使用增强化学发光检测试剂（GE Healthcare）清洗和培养膜，并暴露于HyBlot CL放射自显影胶片（Denville Scientific）。使用NIH Image软件进行定量密度分析。抗体如下：抗pCREB（1/1000）和抗CaMKIIα（1/2000；Millipore）；抗CREB（1/1000）、抗filin和抗pCaMKIIα（1/5000；细胞信号技术）；抗pCofilin（1:1000；Abcam）；抗C/EBPβC-19（1/1000）；抗BDNF（1:1000）；和抗肌动蛋白-HRP（1/4000；Santa Cruz Biotechnology）。

染色质免疫沉淀。

染色质免疫沉淀（ChIP）如前所述进行(Tsankova等人，2004年). 将大鼠海马解剖并切成～1 mm的碎片，在室温下立即在1%甲醛中交联17 min，并旋转。通过添加最终浓度为0.125的甘氨酸来停止交联反应米将组织在含有蛋白酶抑制剂的冷PBS（罗氏应用科学公司）中清洗五次，然后在干冰上冷冻。通过添加500μl裂解缓冲液（1%十二烷基硫酸钠，50 m）溶解并提取染色质米三重HCl，pH 8.1和10 m米EDTA），然后进行超声波处理。在1.1 ml ChIP稀释缓冲液（1.1%Triton X-100，167 m）中稀释匀浆米氯化钠，16.7米米三氯化氢，pH 8.1，1.2 m米EDTA和0.01%十二烷基硫酸钠）。然后将匀浆用于ChIP。向匀浆中添加30微升磁性蛋白A微球（EZ-Magna ChIP A试剂盒；Millipore）和7.5μg C/EBPβ抗体（Abcam）、MeCP2抗体（Abcam）、Sin3a抗体（Abcam）、HDAC2抗体（Abcam）或pCREB抗体（Millipore）。将混合物在4°C下旋转培养过夜。清洗、洗脱和反向交联游离DNA均按照制造商的方案（EZ-Magna ChIP A/G试剂盒）进行。设计了特异性引物来扩增约200 bp 5′的近端启动子区外显子IV老鼠的bdnf公司，其中包含假定的C/EBP绑定位点。使用在线程序AliBaba 2.1和Matinspector预测推测的C/EBP结合位点。在其他物种中也发现了类似的C/EBP结合位点(van Dijk等人，1992年). 引物序列如下：正向5′GGC TTC TGT GTG CGT GAG TTC GC 3′；基于先前公布的结果，反向5′AAA GTG GGT GGT AGT CCA CGA G 3′(Martinowich等人，2003年). 标准35周期PCR的执行如下：在95°C下变性30 s，在58°C下退火30 s，并在72°C下延伸30 s。PCR在2%琼脂糖凝胶上解析并测序。测序证实了片段的身份。DNA测序由康涅狄格州纽黑文耶鲁大学的W.M.Keck设施进行。对于ChIP时间进程研究，定量实时PCR分析如下所述。

实时定量RT-PCR。

用TRIzol（Invitrogen）提取海马总RNA，并使用SuperScript II RNase H减去RT（Invit罗gen）或Bio-Rad iScript第一链合成试剂盒（Bio-Rad-）进行反向转录。实时PCR在ABI Prism 7900HT（Applied Biosystems）或Bio-Rad My-IQ单色RT-PCR机上进行；使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen）或Bio-Rad-iQ SYBR Green-Sermix（Bio-Rad）对500 pg的第一链cDNA进行PCR扩增。40个PCR扩增周期如下：95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s。对每个cDNA样本进行三次PCR分析，共三次。Bdnf外显子IV（正向，5′CCCAGTCTCTGTGCTAGAAATGG 3′，反向，5′ACTCGCCTTCAGAGAA 3′），Gapdh公司（正向、5′GAACATCATCCCTGCATCCA 3′、反向5′CCAGTGAGCTCCCGTTCA 3′）作为内部控制。使用序列检测器系统2.0版软件（Applied Biosystems）分析数据。选择循环阈值法（CT；见应用生物系统用户公告第2号，P/N 4303859），即ddCT，以确定训练和对照大鼠中基因表达的相对定量。

统计分析。

单向方差分析（ANOVA），然后是纽曼-基尔斯（Newman–Keuls）事后（post-hoc）测试是在比较成对的组时进行的事后（post-hoc）需要对每组进行分析(图4,​,55C–E类). 单向方差分析（ANOVA）后接邓内特（Dunnett）的事后（post-hoc）当每组与单个对照组（Naive；图5A类,B类,​,7).7). 双向ANOVA，然后是Bonferroni事后（post-hoc）在比较两个因素（例如治疗和测试；图1​1–三,​,5,5,​,6).6). 学生的t吨当两组进行比较时（例如，提醒电击），使用测试。

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记忆巩固期间海马蛋白质合成需求的时间分布。实验时间表如上图所示。A–G在指定的时间点向大鼠双侧海马注射载体或茴香霉素（箭头），以平均潜伏期±SEM（秒）表示获得（Acq.）和保留。A类IA训练前15分钟海马注射茴香霉素对训练后1小时测试的短期记忆没有影响(n个=8/组，试验1，载药与茴香霉素，第页>0.05，学生的t吨测试）。B类，IA训练前15分钟海马注射茴香霉素会干扰训练后2天和7天的记忆测试(n个=8–9/组，试验1和试验2，载药与茴香霉素，第页<0.01，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(1,28)= 22.37,第页<0.0001）以及脚部电击提醒后1天（试验3，载药与茴香霉素，第页<0.01，学生的t吨测试）。测试1、测试2或测试3的记忆保持时间与采集延迟没有显著差异(第页>0.05，学生的t吨测试）。C类IA训练后立即海马注射茴香霉素，训练后第2天和第7天测试记忆中断(n个=8/组，试验1和试验2，载药与茴香霉素，第页<0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(1,28)= 13.79,第页=0.0009）以及脚部电击提醒1天后（试验3，载药与茴香霉素，第页<0.05，学生的t吨测试）。测试1的记忆保持率与采集延迟显著不同(第页<0.05，学生的t吨测试）。天IA训练后第1天海马注射茴香霉素对注射后第2天的记忆测试没有影响(n个=10/组，试验1，载药与茴香霉素，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试），但在注射后第7天重新测试的记忆力明显受损（测试2，第页<0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(1,36)= 5.277,第页= 0.0275). 学生的t吨将樟柳霉素组的测试2与其相对获得潜伏期进行比较的测试显示出统计学上的显著差异（Student’st吨测试，第页= 0.0210).E类IA训练后第1天海马注射茴香霉素显著干扰了注射后第7天测试的记忆(n个=8/组，试验1，载药与茴香霉素，第页<0.05，学生的t吨测试）。学生的t吨将樟柳霉素组的测试1与其相对获得潜伏期进行比较的测试显示出统计学上的显著差异（Student’st吨测试，第页= 0.0412).F类训练后2天海马注射茴香霉素对注射后2天（测试1）或7天（测试2）的记忆测试没有影响(n个=12–14/组，试验1和试验2，载药与茴香霉素，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）两个实验的测试）。G公司训练后第7天海马注射茴香霉素对注射后第2天（测试1）、第7天（测试2）或第21天（测试3）的记忆力没有影响(n个=8–9/组，试验1、试验2和试验3，溶媒vs茴香霉素，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试）*第页< 0.05, **第页< 0.01.

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长期记忆巩固需要快速雷帕霉素敏感期。每个图上方的实验时间表(A–C). 采集（Acq.）和保留表示为平均潜伏期±SEM（秒）。箭头表示在IA训练前15分钟或训练后立即在双侧海马注射溶媒或雷帕霉素。与车辆相比，训练前15分钟注射雷帕霉素(A类)不影响短期记忆(n个=7/组，溶媒vs雷帕霉素，第页>0.05，学生的t吨测试），但(B类)在测试1和测试2中完全中断记忆保持(n个=7/组，试验1，载药与雷帕霉素，第页<0.01雷帕霉素；试验2，载药与雷帕霉素，第页<0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(1,24)= 19.77,第页=0.0002，与Acq.相比，每个雷帕霉素组。，第页>0.05学生的t吨测试）。提示电击后记忆没有恢复（测试3，车辆与雷帕霉素，第页<0.05，学生的t吨测试）。C类，训练后立即注射雷帕霉素对记忆保持没有影响(n个=9–10/组，试验1和试验2，载药与雷帕霉素，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试）*第页< 0.05, **第页< 0.01.

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长期记忆巩固期间海马BDNF需求的时间分布。每个图上方的实验时间表。在指定的时间点双侧海马注射IgG、抗BDNF或TrkB-Fc大鼠的获得（Acq.）和保持用平均潜伏期±SEM（秒）表示(A–E).A类在IA训练前15分钟海马注射抗BDNF或TrkB-Fc显著干扰训练后2天和7天测试的记忆(n个=8–9/组，IgG vs抗BDNF或vs TrkB-Fc试验1，第页<0.01和试验2，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(2,46)= 17.08,第页<0.0001）以及脚震提示后1天（试验3，IgG与抗BDNF或TrkB-Fc，两种治疗第页<0.01，Newman–Keuls多重比较的单向方差分析事后（post-hoc）测验；处理效果F类(2,25)= 8.174,第页= 0.0021).B类训练后立即海马注射抗BDNF或TrkB-Fc对注射后第2天的记忆测试没有显著影响(n个=8–10/组，试验1，IgG与抗BDNF或TrkB-Fc第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）但在注射后第7天重新测试了记忆（测试2，抗BDNF和TrkB-Fc，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(2,48)= 12.93,第页< 0.0001). 在提醒电击后，显著损伤持续存在（测试3，两种治疗第页<0.001，单因素方差分析，Newman–Keuls多重比较事后（post-hoc）测验；处理效果F类(2,26)= 9.958,第页= 0.0007).C类IA训练后第1天海马注射TrkB-Fc对注射后第2天的记忆测试没有影响(n个=8–9/组，试验1，3 d，IgG vs TrkB-Fc第页>0.05，学生的t吨测试），但在注射后7天测试的记忆明显中断(n个=7–8/组，试验1，8 d，IgG vs TrkB-Fc第页<0.05，学生的t吨测试）。天IA训练后2天海马注射抗BDNF或TrkB-Fc对注射后2天（测试1）或7天（测试2）测试的记忆没有影响(n个=6–9/组，IgG与抗BDNF或TrkB-Fc第页> 0.05; 双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试）。E类IA训练后第7天海马注射抗BDNF对注射后第2天（测试1）、第7天（测试2）或第14天（测试3）测试的记忆没有影响(n个=7/组，IgG vs抗BDNF第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试）*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

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训练时海马BDNF需要增加pCREB、pCofilin、pCaMKIIα和C/EBPβ。A类幼年大鼠和训练大鼠在训练前15分钟给予海马注射IgG或抗BDNF，训练后12小时处死，其背海马提取物的示例和密度定量Western blot分析。训练后，pCREB、pCofilin、pCaMKIIα和C/EBPβ的表达显著增加，这种增加被抗BDNF注射显著阻断(n个=6–12/组，天真vs训练-IgG，天真vs.训练-抗-BDNF，单因素方差分析，然后是纽曼-凯尔斯多重比较事后（post-hoc）测验；pCREB公司：F类(2,30)= 7.608,第页= 0.0023; pCofilin蛋白：F类(2,20)= 5.796,第页= 0.0114; pCaMKIIα：F类(2,32)= 8.621,第页= 0.0011; C/EBPβ：F类(2,23)= 5.308,第页= 0.0136). 总CREB、总CaMKIIα或总Cofilin水平无明显变化(第页>0.05，数据未显示）。数据表示为注射IgG的平均百分比±SEM原始对照*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.B类，该图总结了在IA训练前15分钟注射抗BDNF抗体或对照IgG抗体的大鼠获得的背侧海马提取物中pCREB和pCaMKIIα的训练依赖性增加的时间分布(n个=5–8/组），训练后30分钟或12小时或20小时死亡。图表包括之前报告的30分钟和20小时的数据(Chen等人，2012年)除了这里研究的12小时时间点之外。密度定量Western blot分析数据表示为平均百分比±SEM原始，注射IgG的对照组在匹配的时间点死亡。所有数值均根据肌动蛋白进行标准化。与注射IgG（浅灰色圆圈）的原始对照组相比，在IA中训练的大鼠在训练后30分钟、12和20小时（黑色方块）表现出显著的海马pCREB和pCaMKIIα诱导。训练前15分钟海马内注射抗BDNF可阻断所有三个时间点pCREB的诱导以及12小时和20小时（而非30分钟）pCaMKIIα的诱导（深灰色三角形；单向方差分析，然后Newman–Keuls多重比较事后（post-hoc）测试）*表示Naive-IgG组与Trained-IgG组的显著性水平比较*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001. #表示训练性IgG组与训练性抗-BDNF组之间的显著性水平比较#第页< 0.05, ##第页<0.01，以及###第页< 0.001.

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训练后C/EBPβ或BDNF阻断导致的记忆障碍被BDNF挽救。数据表示为平均潜伏期±SEM。实验时间表如上图所示(A–F).A类IA训练后5h注射Rec-BDNF而非Rec-NT3，可缓解C/EBPβ表达受阻引起的记忆障碍。在IA训练后5 h注射β-ODN或SCR-ODN，以及rec-BDNF、rec-NT3或Vehicle。注射后第2天（测试1）或第7天（测试2）对大鼠进行测试。与SCR-ODN相比，β-ODN在训练后第2天和第7天显著降低记忆保持力(n个=6–8/组；SCR-ODN/VEH与β-ODN/VEH-，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(4,58)= 13.73,第页< 0.0001). BDNF（而非NT3）显著且完全地挽救了这一失忆症，并且挽救效果持续存在（β-ODN/VEH vsβ-ODN/BDNF，第页< 0.001; β-ODN/VEH与β-ODN/NT-3的比较，第页> 0.05; SCR-ODN/VEH与β-ODN/BDNF的比较，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测试）。B类在IA训练后12 h注射Rec-BDNF，但不注射Rec-IGF-II，可显著缓解训练后5 h注射β-ODN引起的记忆障碍(n个=6–11/组，β-ODN/VEH vsβ-ODN/BDNF，第页< 0.001; β-ODN/VEH与β-ODN/IGFII的比较，第页> 0.05; SCR-ODN/VEH与β-ODN/BDNF的比较第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(2,34)= 13.51,第页< 0.0001). 注射后第2天（测试1）或第7天（测试2）对大鼠进行测试。C类,天，注入Rec-BDNF 2 d(C类)或4天(天)训练后不能挽救因阻断C/EBPβ表达而引起的记忆障碍。IA训练后5 h注射β-ODN或SCR-ODN。注射后第2天（测试1）或第7天（测试2）对大鼠进行测试(n个=6–8/组；β-ODN/VEH与β-ODN/BDNF的比较，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；治疗效果：用于C类,F类(2,34)= 13.51,第页< 0.0001; 对于天,F类(2,40)= 46.42,第页< 0.0001),E类在IA训练后12 h注射Rec-BDNF并不能挽救因预训练抗BDNF而引起的记忆损伤。训练前15分钟注射IgG或抗BDNF抗体（箭头）。训练后12小时注射Rec-BDNF或车辆（箭头所示）。注射后第2天（测试1）或第7天（测试2）对大鼠进行测试(n个=6–7/组；抗BDNF/VEH与抗BDNF/BDNF，第页>0.05，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(2,32)= 41.39,第页< 0.0001).F类，IA训练后12 h注射Rec-BDNF，挽救训练后注射抗BDNF引起的记忆衰退。训练后立即注射IgG或抗BDNF抗体（箭头）。训练后12小时注射Rec-BDNF或Vehicle（箭头所示）。注射后第2天（测试1）或第7天（测试2）对大鼠进行测试(n个=9–10/组；抗BDNF/VEH与抗BDNF/BDNF，试验2，第页<0.001，双向方差分析，然后是Bonferroni事后（post-hoc）测验；处理效果F类(2,50)= 8.36,第页= 0.0007); ***第页< 0.001.

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阻遏物/激活物结合率增加bdnf外显子IV启动子与反馈回路的终止有关。A类，226bp上游区域方案bdnf外显子IV用ChIP分析启动子。B类、琼脂糖凝胶中经溴化乙锭染色的代表性PCR片段和(C类–F类)qRT-PCR分析bdnf外显子IV使用针对pCREB、MeCP2、HDAC2或Sin3a的抗体的ChIP之后的启动子片段。qRT-PCR取自训练后30分钟、12小时或48小时处死的训练大鼠的背侧海马。数据以平均输入富集百分比±SEM表示(n个=4–7/组；第页< 0.05,第页<0.01，单因素方差分析，然后是Dunnett的多重比较事后（post-hoc）测试；pCREB公司：F类(3,15)= 5.437,第页= 0.0136; MeCP2：F类(3,15)= 7.069,第页= 0.0054; HDAC2：F类(3,19)= 5.960,第页= 0.0063; Sin3a：F类(3,15)= 5.842,第页= 0.0104).G公司，转录调控的示意模型bdnf外显子IV发起人接受IA培训。训练中的BDNF导致pCREB和C/EBPβ结合增加bdnf外显子IV启动子在IA训练后12小时，这与bdnf外显子IV以及BDNF蛋白(图5). 训练后48小时，pCREB和C/EBPβ在bdnf外显子IV启动子返回基线，而抑制剂Sin3a、MeCP2和HDAC2的结合随着BDNF水平返回基线而增加*第页< 0.05, **第页< 0.01.

结果

海马的时间演化从头开始记忆巩固过程中的蛋白质合成需求

定义背海马的时间需求从头开始在长期IA记忆巩固期间的蛋白质合成，我们在训练前15分钟、训练后立即或训练后24小时、48小时或7天，向大鼠背侧海马注射125μg翻译抑制剂茴香霉素。该剂量最多可在6小时内阻止>80%的背海马蛋白质合成(Milekic等人，2006年). 在注射后2天（测试1）和7天（测试2）测试记忆保持，或者在特定情况下，仅在指定时间测试。

与运载工具相比，在训练前15分钟注射茴香霉素完全破坏了测试1和测试2的记忆保持，而不影响训练后1小时测试的短期记忆(图1A类,B类). 在测试1和测试2中，注射茴香霉素的大鼠的记忆保持时间与获得时间没有显著差异，表明记忆被完全破坏。在测试2后24小时，与在不同环境下进行训练的强度相等的提醒性脚震并没有恢复24小时后测试的记忆（测试3），这表明记忆丧失不是由于暂时的记忆保留/提取抑制所致。这样的脚步声拯救了IA灭绝(Inda等人，2011年).

训练后立即注射茴香霉素，但与运载工具相比仍会造成显著的记忆损伤（测试1和测试2），与获得相比，产生了明显更高的记忆保持力，表明几分钟后从头开始训练后的蛋白质合成足以产生持续2天的记忆保留。测试2后1天的提醒电击未能挽救测试3的记忆(图1C类).

训练后24小时注射茴香霉素的大鼠在2天后（测试1）的记忆力与车辆注射对照组相似，但5天后（测试2）与对照组相比显著丧失记忆力(图1天). 这种记忆丧失并不完全，因为记忆保持率明显高于记忆获得率。测试测试1是否有助于测试2的效果(Inda等人，2011年)，只在训练后第7天对大鼠进行相同的处理和测试(图1E类). 与载体相比，茴香霉素显著降低记忆保持能力，这表明训练后24小时的翻译是记忆保持所必需的。

相反，在训练后第2天或第7天注射茴香霉素对注射后第2、7或21天测试的记忆保持没有影响(图1F类,G公司)表明海马从头开始IA记忆巩固所需的蛋白质合成在训练后2天完成。

最后，雷帕霉素，已知可抑制mTOR通路并靶向树突中蛋白质子集的翻译(Richter和Klann，2009年)训练前15分钟注射雷帕霉素完全破坏记忆保持，而训练后同样的治疗没有效果，这表明IA记忆巩固需要海马非常短暂的阶段，依赖于雷帕霉素的机制(图2).

因此从头开始蛋白质合成是启动记忆巩固所必需的。该要求持续24小时以上，培训后48小时终止。干扰翻译时间或训练后一天会导致记忆的形成，然而，记忆只会持续几天，然后迅速衰退。

记忆巩固期间海马BDNF需求的时间演变与从头开始蛋白质合成

基于先前的研究表明（1）BDNF导致mTOR激活和蛋白质合成，这是LTP和长期记忆形成所必需的(Tang等人，2002年;Slipczuk等人，2009年); （2） 训练前15分钟海马区阻滞BDNF或TrkB会在训练后2天破坏记忆，而不会影响短期记忆(Chen等人，2012年); （3） 海马BDNF需要在训练后12小时内持续存在，但不能形成降压IA记忆(Bekinschtein等人，2007a); （4）BDNF可在跳台IA训练后12小时内，通过注射蛋白质合成抑制剂来挽救记忆衰退(Bekinschtein等人，2008年)，我们着手确定BDNF是否既是启动整合培训所需快速翻译阶段的快速上游中介，又是整个整合过程进展的关键持久中介。因此，我们测试了BDNF需求的时间进程是否与整个蛋白质合成依赖阶段的时间进程平行。

预先训练双侧向背海马注射抗BDNF或其受体清除剂TrkB-Fc，在两天时都会完全破坏记忆保持（测试1；图3A类)与对照IgG（测试2）进行比较。脚震提醒后未发现恢复（测试3；图3A类).

在测试1中，训练后立即给予的相同治疗导致记忆下降的趋势不明显(图3B类). 通过测试2，这种记忆保持率显著下降。提示性足震（测试3）后没有发现记忆恢复，表明从测试1到测试2的记忆下降不是因为消失，而是巩固障碍(图3B类).

此外，与茴香霉素类似，训练后第1天注射TrkB-Fc不会影响第2天的保留（试验1；图3天)但仅在注射后第7天测试记忆力显著受损(图3C类，测试1，8 d）。同样类似于从头开始蛋白质合成，训练后2天完成海马BDNF信号的需要。事实上，在训练后第2天或第7天注射抗BDNF或TrkB-Fc，在注射后第2、7和21天进行测试时，对保持力没有影响（测试1-3；图3天,E类).

总之，这些数据表明BDNF信号和从头开始在记忆巩固期间，海马体的蛋白质合成遵循相似的需求时间进程。他们还表明，BDNF依赖性通路的快速激活对于启动记忆巩固至关重要，并且需要在训练后的前1-2天持续或循环激活BDNF相关通路才能完成海马记忆巩固。

BDNF信号的初始激活是启动和维持pCREB、C/EBPβ、pCaMKIIα和pCofilin持续增加所必需的

因为巩固需要基因表达，所以我们假设BDNF依赖性表达增加的自我调节-正反馈回路是记忆巩固的关键机制。

我们首先研究了阻断BDNF对训练后IA记忆形成的基因表达的时间分布的影响。以前的结果来自Chen等人（2012）显示在训练前在背侧海马中阻断BDNF完全阻断pCREB的快速（在30分钟时）IA训练依赖性诱导。这种阻滞与钙pCaMKIIα和突触蛋白1的磷酸化阻滞一起持续到训练后20小时。

在这里，我们通过测试训练后12小时预训练抗BDNF对相同和额外标记物表达水平的影响，扩展了分子变化的研究。我们选择这个时间点是因为它反映了训练时启动的基因表达的进展阶段。它还报告了训练后即刻阶段和仍然需要蛋白质合成和BDNF的24小时时间点之间发生的变化。定量蛋白质印迹分析显示，预训练的抗BDNF治疗显著阻断了海马pCREB的训练依赖性增加、肌动蛋白切断蛋白辅纤维蛋白（Ser-9；pCofilin）和pCaMKIIα的磷酸化以及C/EBPβ的诱导(图4A类). 在接受非配对上下文休克方案（UN）的大鼠海马中未观察到这些变化，该方案已知不会诱导IA记忆t吨所有比较的测试：12 h，pCREB：naive=100.0±9.380(n个=5），UN=81.05±12.47(n个= 6),第页= 0.27; C/EBPβ：朴素=100.0±11.96(n个=5），联合国=81.34±16.46(n个= 6),第页= 0.40; pCaMKIIα：朴素=100.0±16.99(n个=5），联合国=82.98±9.508(n个= 6),第页= 0.38; pCofilin：朴素=100.0±17.96(n个=5），联合国=109.9±13.41(n个= 6),第页= 0.66; 20小时，BDNF：初始=100.0±10.31(n个=5），联合国=93.37±7.577(n个= 5),第页= 0.62].

在总CREB、总CaMKIIα或总cofilin水平上未观察到显著变化（数据未显示）。

海马分子变化的时间进程综述体内下游BDNF对IA学习的响应如所示图4B类与在匹配时间点处死的幼年大鼠的水平相比，显示了训练后的所有变化。此外，在暴露于非配对上下文休克、单独休克或单独上下文休克并在匹配时间点死亡的大鼠海马中，pCREB、pCaMKIIα和BDNF的水平与幼年大鼠相似，表明训练依赖性变化与上下文休克关联相关(Taubenfeld等人，2001b;Chen等人，2012年). 因此，与原始条件相比，显示了训练引发的分子变化。

总之，这些数据表明，BDNF对pCREB-C/EBPβ依赖性事件级联的激活是必要的，持续时间大于24小时。这一级联事件的进展和完成对记忆巩固是必要的。

记忆巩固期间，BDNF通过自我调节-正反馈回路由海马中的C/EBPβ调节

CREB是BDNF转录所必需的(Tao等人，1998年)已知BDNF介导CREB激活(Finkbeiner等人，1997年;Pizzoruso等人，2000年;Alonso等人，2002年). 同样，如上所示，海马中C/EBPβ的训练依赖性诱导也是BDNF下游和在体外数据表明，除了CRE外，BDNF启动子上还存在推测的C/EBP结合位点(Shieh等人，1998年;Tao等人，1998年;Takeuchi等人，2002年). 因此，我们测试了持续24小时以上的BDNF依赖性记忆巩固需求是否可能是由于BDNF通过C/EBPβ的正向自动调节反馈回路所致。

因此，我们首先研究了bdnf外显子IVmRNA，因为该外显子在突触可塑性和记忆巩固中被调节(Hong等人，2008年;Lubin等人，2008年). 用实时定量PCR（qRT-PCR）检测IA训练后40分钟和6、12、20和48小时处死的大鼠背海马RNA的表达，并与对照组比较bdnf外显子IVmRNA。结果表明，与幼年大鼠相比，经过训练的大鼠的bdnf外显子IV训练后12和20小时的mRNA水平，但在其他测试时间点没有(图5A类).

确定是否bdnf外显子IV表达对学习至关重要，我们使用反义ODN来对抗对bdnf外显子IV把这份成绩单写下来。大鼠接受双侧海马注射bdnf外显子IVIA训练后6小时，反义（AS）或SCR ODN。AS注射在训练后20小时显著降低了BDNF水平[AS=64.32±4.254(n个=5），SCR=100.0±12.01(n个= 5),第页=0.0221，学生的t吨测试]，验证AS的击倒效应。与SCR相比，AS在训练后第2天和第7天显著降低记忆保持力(图5B类). 此外，注射AS的大鼠的记忆并没有通过脚部电击恢复(图5B类)，表明bdnf外显子IV该表达式实际上是IA内存整合所必需的。

然后我们问：bdnf外显子IV是C/EBPβ的转录靶点体内.带有抗C/EBPβ或对照IgG抗体的背海马提取物的ChIP(图5C类)然后使用侧翼推测C/EBPβ结合位点的引物进行PCRbdnf外显子IV发起人(图5C类,​,77A类)与对照IgG抗体相比，抗C/EBPβ结合显著(图5C类). 因此，我们对训练后30分钟、12小时或48小时处死的大鼠背海马提取物进行了ChIP qRT-PCR分析。与幼年大鼠相比，训练后大鼠海马C/EBPβ与外显子IV在训练后12小时启动子，但不是在训练后30分钟或48小时恢复到对照水平(图5C类). 此配置文件与bdnf外显子IVmRNA和训练诱导的C/EBPβ表达(Taubenfeld等人，2001b)从而表明bdnf公司可能是大鼠海马中C/EBPβ的直接转录靶点体内.

进一步定义是否bdnf公司是C/EBPβ的功能靶点，我们确定阻断训练诱导的C/EBPbdnf外显子IVmRNA。训练后5小时用寡核苷酸β-ODN通过反义介导的C/EBPβ敲除，这一方案已被证明可以阻止训练后12小时C/EBP的诱导(Taubenfeld等人，2001a)，完全阻止了bdnf外显子IVqRT-PCR分析测定mRNA(图5天). 此外，训练后5 h注射β-ODN阻断了训练后20 h BDNF蛋白的训练依赖性诱导，证实训练诱发的BDNF增加是下游C/EBPβ(图5E类).

由于C/EBPβ的诱导需要BDNF(图4)，我们测试了bdnf外显子IV12小时时的mRNA诱导也会被预处理注射抗BDNF抗体所阻断。qRT-PCR分析显示，与IgG相比，在训练前15分钟注射抗BDNF抗体可以阻止诱导bdnf外显子IV训练后12小时(图5F类).

总之，这些数据表明，训练中快速的BDNF信号传导导致CREB-C/EBP通路的招募，而CREB-C-EBP通路又通过C/EBPβ上调BDNF的表达。成功完成记忆整合需要这种自动调节正反馈回路。

BDNF对C/EBPβ基因敲除介导的记忆损伤的修复作用

鉴于BDNF招募CREB-C/EBP通路来调节其自身的表达，我们询问BDNF是否足以在IA训练后5小时挽救C/EBPβ敲除引起的记忆损伤。IA训练后5小时，大鼠接受双侧海马注射β-ODN或SCR-ODN。将注射β-ODN的大鼠进一步分为三组：一组与重组BDNF（Rec-BDNF）共注射，一组与载体共注射，第三组与另一重组营养因子神经营养素3（Rec-NT3）共注射。训练后2天（测试1）和7天（测试2）对所有大鼠进行测试。与SCR-ODN相比，β-ODN在训练后第2天和第7天显著降低了记忆保持能力，这证实了我们之前的结果(图6A类). BDNF显著且完全地挽救了这种失忆症，而NT3却没有。此外，BDNF的救援效果随着时间的推移而持续(图6A类). 因此，BDNF选择性地挽救了C/EBPβ敲低介导的记忆损伤。

为了研究BDNF的拯救作用是否发生在CREB-C/EBP-依赖性基因表达阶段的时间限制窗口内，如上图所示，该阶段调节BDNF内源性增加，我们监测了海马注射rec-BDNF的效果。IA训练后5小时，大鼠接受双侧海马内注射β-ODN或SCR-ODN。两组均在训练后12 h、2 d或4 d接受溶媒或rec-BDNF，并在注射后2 d（测试1）和7 d（测试2）进行测试(图6B–D类). Rec-BDNF在训练后12小时注射β-ODN时，选择性地、完全地挽救了β-ODN引起的记忆损伤，而注射SCR-ODN时记忆保持力没有改变(图6B类). 这种作用是选择性的，因为另一种C/EBPβ靶向生长因子IGF-II不能挽救C/EBPβ敲低引起的记忆缺陷。值得注意的是，如果在训练后第2天或第4天注射BDNF，则BDNF不再能挽救记忆损伤(图6C类,天)这表明该效应仅限于基因表达依赖性巩固期。因此，BDNF以选择性和时间限制的方式挽救了C/EBPβ敲除引起的记忆损伤。这种效应发生的时间窗与海马的需求相似从头开始蛋白质合成对记忆巩固至关重要，这进一步支持了我们的假设，即BDNF至少介导记忆巩固所需的部分蛋白质合成。

最后，由于预训练抗BDNF抗体导致健忘症，并在训练后12小时阻断C/EBPβ的诱导，我们测试rec-BDNF是否可以挽救这种健忘症。在IA训练前15分钟，大鼠背部海马注射抗BDNF或IgG；12小时后，当抗BDNF大鼠注射rec-BDNF或载体时，注射IgG的对照组接受载体。训练后第2天（测试1）和第7天（测试2）对所有大鼠进行测试(图6E类). BDNF未能挽救海马内预训练抗BDNF注射引起的记忆障碍(图6E类)这表明BDNF的预训练阻断完全阻止了启动巩固过程的快速变化，BDNF可以在巩固过程中拯救记忆。相反，在训练后5小时，使用β-ODN阻断C/EBPβ诱导至少5小时的巩固机制，使基质在12小时内被BDNF保存记忆。为了排除训练前15分钟注射的抗BDNF抗体在训练后12小时仍然存在，从而阻止了12小时BDNF的抢救效果，训练后立即将抗BDNF-抗体注入大鼠的背海马，训练后12 h注射载体或rec-BDNF。如所示图3B类，我们证实，训练后注射抗BDNF在训练后第2天未能显著改变记忆，但在训练后7天显著破坏记忆。训练后12小时注射rec-BDNF后，衰变完全被挽救(图6F类)，证实了BDNF在以后的抢救效果需要一种快速、依赖BDNF的机制。

因此，BDNF足以挽救由海马C/EBPβ敲低引起的记忆损伤，该时间限制窗口与海马C/EBPβ敲低的时间限制窗口重叠从头开始蛋白质合成需要巩固。此外，只有当合并过程已经启动或正在进行时，BDNF才能拯救内存，但不能超出此时间窗口。

BDNF依赖性转录抑制和反馈环的终止与HDAC2、MeCP2和Sin3A与其启动子的结合相关

哪种机制结束了从头开始训练后48小时蛋白质合成和BDNF自动调节反馈回路？自bdnf公司mRNA水平在训练后48小时恢复到基线水平，我们假设在bdnf外显子IV可能起到分子刹车的作用，发出BDNF反馈回路结束的信号。此外，训练依赖性的pCREB和C/EBPβ的增加也在48小时后恢复到控制水平。因此，我们检测了pCREB和C/EBPβ以及转录阻遏物MeCP2及其辅抑制物HDAC2和Sin3a在bdnf外显子IV启动子，因为这些因素之前已经牵涉到bdnf外显子IV发起人在体外(Chen等人，2003年;Martinowich等人，2003年).

从训练后30分钟、12小时或48小时的大鼠背海马提取物中提取的含有抗pCREB、抗C/EBPβ、抗MeCP2、抗HDAC2和抗Sin3a的ChIP，在训练后30 min、12 h或48 h处死，然后进行qRT-PCR分析bdnf外显子IV启动子区(图7A类)发现pCREB和C/EBPβ在bdnf外显子IV启动子在训练后12小时（而不是30分钟）显著增加，并在48小时后恢复到初始控制水平(图7B类,C类,​,55B类). 相反，MeCP2与bdnf外显子IV与原始对照组相比，启动子在训练后48小时启动，但在30分钟或12小时不启动(图7B类,天). 同样，HDAC2结合在训练后48小时显著增加，但在早期没有增加(图7E类). 我们还观察到，训练后30分钟和48小时，Sin3a结合显著增加，但12小时没有增加，这表明Sin3a可能在不同的时间点具有不同的结合伙伴。值得注意的是，Sin3a与外显子IV启动子似乎与bdnf外显子IVmRNA表达(图7F类). 这些数据表明bdnf外显子IV启动子可能由MeCP2、HDAC2和Sin3a介导，在训练后48小时BDNF转录随之减少，伴随着巩固过程的终止。

讨论

我们已经证明，为了巩固IA记忆，需要海马从头开始蛋白质合成在训练时迅速开始，持续超过24小时，训练后48小时结束。与这一过程并行的一个关键机制是BDNF的释放及其通过正的自我调节反馈环进行的表达调控，该反馈环启动、维持和结束基因表达依赖性巩固阶段。训练后24小时对翻译或BDNF功能的干扰会影响巩固的进程，并导致记忆衰退。C/EBPβ对BDNF正反馈回路至关重要：C/EBP？的诱导需要训练时的BDNF，反过来C/EBP调节巩固持续阶段BDNF表达的增加。

两者的要求从头开始在训练后的即刻阶段，海马中的蛋白质合成和BDNF/TrkB对于快速启动记忆巩固至关重要，几分钟的BDNF/TrkB信号传导和翻译足以产生一些记忆保留，这种记忆保留维持几天，但随后迅速衰退。我们的茴香霉素结果扩展了经典研究中提出的时间窗口，即快速翻译的初始阶段足以促进记忆巩固(Squire and Davis，1975年). 事实上，在大多数情况下，这些调查并没有在训练后的第一天或两天之后继续进行时间分析(马克和瓦茨，1971年;Squire and Davis，1975年). 我们的研究结果还扩展了Medina实验室的研究结果，该实验室显示，在下台IA训练后12小时，而不是训练后9小时或24小时，向背海马注射茴香霉素，会破坏训练后7天而不是2天测试的记忆保持能力(Bekinschtein等人，2007a,2010). 此外，在海蜗牛在神经元培养中，翻译的晚期持续阶段对长期促进的稳定至关重要，这表明翻译的持续需求是长期可塑性和记忆的进化保守机制(Miniaci等人，2008年). 总之，我们的实验广泛描述了IA记忆巩固期间背海马翻译需求的时间分布，从而得出以下结论：从头开始训练后超过1d但少于2d，蛋白质合成是必不可少的。

此外，我们还发现，启动记忆巩固的翻译需要遵循与BDNF相似的时间进程，尽管BDNF阻断治疗前后的差异比茴香霉素更显著。这种差异可能是由于阻滞剂的效率或浓度所致，但也可能是由于抗BDNF抗体与茴香霉素的靶机制不同所致。事实上，BDNF靶向几种信号转导途径，包括MAP激酶、Akt和PLCγ介导的信号转导途径，此外还影响翻译和mTOR途径(Takei等人，2004年;Musumeci和Minichiello，2011年). 此外，已知雷帕霉素会影响茴香霉素和BDNF靶向的翻译子集，与之前的研究一致(Bekinschtein等人，2007b)，与训练后注射相比，海马训练前注射的差异更为显著。这表明雷帕霉素的作用靶点非常迅速地启动记忆巩固，然后通过雷帕霉素依赖性机制进行。

BDNF/TrkB和翻译都需要一天以上但不到两天的时间来完成合并过程。这些数据扩展了Medina实验室的研究结果，该实验室显示，在下台IA训练后12小时，而不是训练后9小时或24小时，阻断背海马的翻译或BDNF，会破坏训练后7天而不是2天测试的记忆保持能力(Bekinschtein等人，2007a,2010). 本研究与我们关于24小时BDNF阻断对训练后第7天记忆保持的影响的数据之间的差异可能只是明显的，而且很可能是由于在他们的实验中重新测试的影响。

海马介导的整合需要一整天才能完成，这一事实很有意思，因为它表明昼夜节律和睡眠可能会显著参与其中(Eckel-Mahan和Storm，2009年;Wang等人，2011年;Tononi和Cirelli，2014年).

我们的结果表明，BDNF的扩展作用需要BDNF表达的上调，这遵循与C/EBPβ诱导相似的时间曲线，如bdnf外显子IVmRNA水平在训练后12和20小时显著升高，但在训练后30分钟或6小时没有升高，训练后48小时恢复到基线水平。mRNA的增加与BDNF蛋白的增加平行。作为bdnf外显子IV敲除导致BDNF蛋白水平降低并破坏记忆巩固，我们得出结论体内bdnf外显子IV表达对于长期记忆的形成是必要的。此外，我们发现C/EBPβ是BDNF表达的关键激活剂，因为首先，C/EBPβ与bdnf外显子IV与pCREB一样，这种结合在训练后12小时显著增加，在训练后48小时恢复到基线水平，此时BDNF水平也恢复到基线。其次，训练后5小时C/EBPβ基因敲除可防止BDNF增加并损害长期记忆。值得注意的是，这种记忆损失被rec-BDNF完全挽救，这表明BDNF足以挽救C/EBPβ依赖机制。

由于C/EBPβ诱导发生在训练时BDNF需求的下游，反过来控制BDNF表达的诱导，我们的结论是，当记忆完全抵抗海马分子干扰时，背侧海马中的BDNF-C/EBPβ-BDNF阳性自动调节环对于启动和维持巩固过程是必要的。在神经元培养研究中，已经描述了由CREB调节的BDNF诱导BDNF合成(Finkbeiner等人，1997年;Tao等人，1998年)据推测，运动后海马体中会出现一个涉及BDNF的反馈回路(Vaynman等人，2003年).

据我们所知，我们的结果首次证明了BDNF的自动调节正反馈回路在长期记忆巩固中的作用体内.

训练后给予BDNF并不能挽救训练前阻断BDNF所导致的失忆症，这表明除了下游C/EBPβ外，BDNF依赖的初始变化对记忆巩固也是必要的。然而，训练后立即阻断BDNF可以使BDNF挽救记忆衰退。这些结果证实，训练后几分钟BDNF诱导的变化对于启动记忆巩固至关重要，在此期间需要BDNF，但不足以维持整个过程。我们推测，在快速初始阶段发生的变化可能包括活动依赖性翻译后修饰以及突触部位关键转录物的翻译。

最后，我们发现与bdnf外显子IV转录抑制剂的启动子，可能对关闭自身调节阳性BDNF环至关重要。MeCP2，一种在Rett综合征中突变的蛋白质，作为转录阻遏物和/或染色质结构的全局调节器发挥作用(Chahrour等人，2008年;Skene等人，2010年;Cohen等人，2011年)与Sin3a和HDAC2一起显著增加其与bdnf外显子IV当BDNF mRNA恢复到基线时，启动子在训练后48小时启动，但当训练后12小时启动子启动子启动，BDNF的mRNA因训练而增加。HDAC2和Sin3a以前都被证明与bdnf外显子IV促进剂两者在体外和体内并下调监管bdnf公司皮层神经元培养中的转录(Chen等人，2003年;Martinowich等人，2003年;Guan等人，2009年). 我们的结果将此知识链接并扩展到体内海马调节记忆巩固的机制，表明MeCP2及其辅抑制因子Sin3a和HDAC2的结合增加bdnf外显子IV启动子以及pCREB和C/EBPβ结合减少是BDNF阳性自动调节终止的关键机制(图7G公司). 终止BDNF表达的正向自动调节可能是有效巩固的关键步骤，其改变可能导致功能损伤，正如BDNF过度表达确实会导致记忆损伤的事实所表明的那样(Cunha等人，2009年,2010).

总之，我们认为BDNF通过C/EBPβ介导的正性自我调节反馈环在训练后24小时内在海马中发挥持续的关键作用，并通过MeCP2、HDAC2和Sin3a介导的转录抑制终止。巩固所需的持续分子机制可能有助于训练后24小时内记忆痕迹的重新激活，这有助于促进海马-新皮质的相互作用，从而导致记忆储存(Frankland和Bontempi，2005年). 我们推测，类似的机制可能支持BDNF在其他脑区和功能中发挥关键作用的长期可塑性反应。

这一知识对于更好地理解记忆是如何巩固和储存的，以及制定关于衰老和疾病中记忆缺陷或丧失的新的工作假设非常重要。开发新的策略来增强或干预记忆巩固也很重要，从而对抗认知损伤或与致病性记忆相关的障碍，如创伤后应激障碍和成瘾。

脚注

这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助（RO1-MH065635和R37-MH065635给C.M.A.，F31-MH816213给D.Y.C.）。我们感谢Ja Wook Koo和Victoria Swiss提供的技术支持。

作者声明没有竞争性的经济利益。

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文章来自神经科学杂志由以下人员提供神经科学学会