脱胶基因介导哺乳动物PCP保守通路以调节神经形成过程中的会聚延伸

摘要

简介

过去几十年来，人们发现了真核生物发育过程中所需的许多保守的遗传途径和细胞生物学机制，从而对胚胎发生过程中所需要的基本过程有了基本的了解。在进化过程中，这些保守的路径和机制会根据进化身体计划的要求进行调整和修改。保守通路的两个例子是Wnt和平面细胞极性（PCP）通路，它们共享一些共同的成分(Cadigan和Nusse，1997年;凯勒，2002;姆洛德齐克，2002年;Myers等人，2002年;Tree等人，2002a;Veeman等人，2003a;Wallingford等人，2002年). Wnt途径首次定义于果蝇属，这是人体节段前后极性和细胞命运决定所必需的(Cadigan和Nusse，1997年). 在非洲爪蟾Wnt通路参与轴决定和背心室（DV）模式(Cadigan和Nusse，1997年). 在哺乳动物中，扩大的途径对原肠胚形成和器官发生期间的细胞增殖和模式有不同的影响(Huelsken和Birchmeier，2001年;Wang和Wynshaw-Boris，2004年;山口，2001). 类似地，保守的PCP途径在果蝇属它调节上皮平面内细胞的极性，垂直于细胞的顶叶轴。这种极性的表现包括翅膀上皮细胞上被称为毛状体的细胞延伸的均匀平行排列，以及复眼共同单位的精确协调方向(斯特拉特，2002年;Tree等人，2002a;Veeman等人，2003a). 在非洲爪蟾斑马鱼和斑马鱼是一种调节会聚延伸的同源途径，会聚延伸是AP轴的协调延伸，同时伴有内侧（ML）轴的变窄(Carreira-Barbosa等人，2003年;Darken等人，2002年;Goto和Keller，2002年;凯勒，2002;Kinoshita等人，2003年;《公园与月亮》，2002年;Takeuchi等人，2003年;Veeman等人，2003b;Wallingford等人，2002年;Wallingford等人，2000年). 在这些动物的会聚延伸过程中，几个PCP蛋白被证明可以控制驱动细胞嵌入的跛足突起的极性(Jessen等人，2002年;Wallingford等人，2000年). 在斑马鱼中，PCP途径似乎也通过决定细胞分裂的方向来调节收敛延伸，至少部分是这样(Gong等人，2004年).

多功能蛋白Dishevelled（Dsh in fly，XDsh in非洲爪蟾哺乳动物中的Dvl1、Dvl2和Dvl3）参与典型Wnt信号通路和PCP通路(姆洛德齐克，2002年;斯特拉特，2002年;Tree等人，2002a;Veeman等人，2003a;Wallingford等人，2002年;Wallingford和Habas，2005年). 在典型的Wnt通路中，Dsh在传递Wnt与细胞表面受体Frizzled和共受体Arrow/Lrp5/6结合产生的信号方面起着重要作用。因此，细胞质蛋白犰狳/β-连环蛋白变得稳定，并被转运到细胞核中激活转录(He等人，2004年;Wang和Wynshaw-Boris，2004年). 在苍蝇的PCP途径中，Dsh参与一组不同的蛋白质，如斜视（Stbm）、Prickle（Pk）、Diego（Dgo）和Flamingo（Fmi）(Das等人，2004年;Jenny等人，2005年;斯特拉特，2002年;Tree等人，2002a;Veeman等人，2003a). 虽然Dsh决定PCP的确切机制尚不明确，但Dsh和其他PCP成员的不对称质膜定位似乎是在苍蝇中正确建立PCP通路所必需的，并且依赖于此(阿克塞尔罗德，2001;Bastock等人，2003年;Das等人，2004年;Jenny等人，2003年;Jenny等人，2005年;罗尔斯和沃尔夫，2003年;Strutt等人，2002年;斯特拉特，2002年;Tree等人，2002a;Tree等人，2002b;Veeman等人，2003a).

最近的遗传学研究也提供了证据，证明哺乳动物中存在PCP途径(Curtin等人，2003年;Hamblet等人，2002年;Kibar等人，2001年;Montcouquiol等人，2003年;默多克等人，2001年;Wang等人，2005年;Wang等人，2006年).环形尾翼(磅)是的点突变拉普或Vangl2号机组是苍蝇PCP成分的同源物Stbm公司(Kibar等人，2001年;Montcouquiol等人，2003年;默多克等人，2001年)，同时崩溃和旋转周期(Crsh和Scy)是摄氏1度，PCP途径成员的同源物功能性磁共振成像(Curtin等人，2003年). 卷发3(Fzd3型)和卷发6(Fzd6公司)编码哺乳动物中的两个Frizzled受体(Wang等人，2006年).Lp、Crsh、Scy、Fzd3^−/−; Fzd6公司^−/−和驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体导致耳蜗感觉毛细胞的静纤毛定位错误。耳蜗毛细胞上静纤毛的均匀取向被认为是PCP的一种表现(刘易斯和戴维斯，2002年). 事实上，我们发现一种转基因Dvl2-EGFP蛋白能够修复驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体显示不对称的质膜定位，在Lp/Lp胚胎(Wang等人，2005年). 其他人报告了类似情况Vangl2号机组-Fzd3和Fzd6在感觉毛细胞、胞囊和嵴中的依赖性不对称定位(Wang等人，2006年)，提示保守的PCP通路是协调静纤毛定向的潜在机制。此外，Lp、Crsh、Scy、Fzd3^−/−; Fzd6公司^−/−和驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体都会导致一种独特的严重神经管闭合缺陷，即从中脑到尾部的整个神经管无法闭合，这是一种人类的先天性缺陷，称为颅轴综合征(Curtin等人，2003年;Hamblet等人，2002年;Kibar等人，2001年;默多克等人，2001年;Wang等人，2006年). 在这些突变体中，颅轴痉挛的原因被推断为会聚延伸的失败，因为非洲爪蟾野生型或突变型XDsh和Stbm的过度表达（阻止收敛延伸）通常会导致类似的神经管闭合缺陷(Copp等人，2003年;Darken等人，2002年;后藤和凯勒，2002年;上野和格林，2003年;Wallingford和Harland，2002年). 然而，在神经形成过程中，由于哺乳动物PCP通路保守成员的丢失而中断的发育机制尚未被研究。没有实验证据表明这些PCP突变小鼠的神经管缺陷是由会聚延伸缺陷引起的，如果是这样，PCP如何调节哺乳动物的会聚延伸尚不清楚。

在这项研究中，我们提供证据表明，在神经形成期间，驱动器1和驱动器2神经板的延长和缩小是一个类似会聚延伸的形态发生过程。使用驱动器2BAC转基因表达功能性Dvl2-EGFP蛋白，我们发现神经上皮细胞中的亚细胞Dvl2定位与其会聚延伸功能一致。有趣的是，尽管磅在神经形成和耳蜗发育过程中与Dvl基因发生遗传相互作用，磅似乎对神经上皮中Dvl2的定位没有影响，而对耳蜗中Dvl2的分布有显著影响(Wang等人，2005年). 我们发现N末端DIX结构域的一部分，它对Wnt通路中的Dvl2功能至关重要(Capelluto等人，2002年)在神经形成或向质膜募集时，其功能在很大程度上是不必要的。相比之下，C端DEP域是PCP/flies和非洲爪蟾(Axelrod等人，1998年;Boutros等人，1998年;Rothbacher等人，2000年;沃林福德和哈兰德，2001年;Wallingford等人，2000年)对神经形成中的Dvl2功能和质膜定位至关重要。为了进一步测试我们是否可以从基因上区分PCP和收敛延伸，我们制作了一个驱动器2BAC转基因携带的点突变与dsh1号机组苍蝇中的等位基因，它专门消除PCP途径。我们对突变转基因的分析表明，Dvl函数在收敛延伸和PCP中严格保持不变。

材料和方法

结果

驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体破坏伴随的神经板延长和收缩

如前所述驱动器2^−/−单个突变体显示脊柱裂，而驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体显示颅棘症(Hamblet等人，2002年).驱动器2^−/−;驱动器3^−/−双突变体也表现为颅棘症（J.W.，N.S.H.和A.W.-B.，未发表）。然而，行程1^−/−(Lijam等人，1997年)和驱动器3^−/−单个突变体或驱动器1^−/−;驱动器3^−/−双突变体（J.W.和A.W.-B.，未发表）不显示神经管缺陷。这些发现表明驱动器2是哺乳动物中用于神经管闭合的最重要的Dvl基因，其本身足以用于正常的神经管闭合。相比之下，驱动器1和驱动器3对于正常的神经管闭合来说，它们本身是不够的，但当驱动器2完全缺失。

为了确定颅骨脊柱裂缺陷的原因驱动器1^−/−;行程2^−/−突变体，我们进行原位杂交以确定背腹（DV）模式，因为已知脊髓中有缺陷的DV模式会导致严重的神经管闭合缺陷(Copp等人，2003年;Ybot-Gonzalez等人，2002年). 我们发现正常的背侧表达宽1，宽3和工程设计2和腹侧表达声波刺猬(嘘)在脊髓中驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体（数据未显示）。这些结果表明神经管闭合失败驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体不是由于异常的DV模式。此外英语2，一个已知的Wnt靶基因，表明典型的Wnt通路在驱动器1^−/−;行程2^−/−突变体。

最近的研究非洲爪蟾表明XDsh介导的收敛-伸展形态发生运动在神经管闭合中起着重要作用(Wallingford和Harland，2002年). 在非洲爪蟾收敛延伸导致AP轴的协调伸长和ML轴的变窄，并反映为神经形成过程中长宽比（LWR）的持续增加(Wallingford等人，2002年;Wallingford和Harland，2002年). 确定是否驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体显示的缺陷与收敛扩展的中断一致，我们采用了非洲爪蟾(Wallingford和Harland，2002年)并测量神经发育小鼠胚胎的LWR(图1; 材料和方法）。在对照胚胎中，我们发现LWR在神经形成期间持续增加(图1E). 然而，当我们系统地测量驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变胚胎，我们发现从我们可以进行此分析的最早时间点开始，LWR持续显著降低(图1E). 更引人注目的是，从五到七个体节阶段，在对照胚胎的七个体节阶段，紧接着闭合1处的神经折叠第一次并置之前(图1C) (Ybot-Gonzalez等人，2002年)，年LWR几乎没有增加驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变胚胎。

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图1

驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体在神经形成过程中长宽比降低

(A-D公司)五至八段驱动器1^−/−;驱动器2^+/−或驱动器1^−/−;驱动器2^+/+控制胚胎。(A′-D′)驱动器1^−/−;驱动器2^−/−等体节期突变体。底板在行程1^−/−;驱动器2^−/−突变体。(E类)控制和驱动器1^−/−;驱动器2^−/−神经发育过程中不同体节阶段的突变胚胎。每个点代表至少三个独立胚胎的平均值。误差条表示标准偏差*P（P）<0.05; **P（P）<0.01.

这个结果表明非洲爪蟾会聚延伸，其定义为伴随组织的延长和收缩(Wallingford等人，2002年)，发生在小鼠神经形成过程中，并在驱动器1^−/−;驱动器2^−/−观察到神经管闭合缺陷之前的突变。如中所建议非洲爪蟾(Wallingford和Harland，2002年)，由此产生的更宽的神经板驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体也可能与小鼠正常的神经管闭合不相容。

Null（空）(Pinson等人，2000年)和低形态(Kokubu等人，2004年)Wnt共受体的等位基因Lrp6号机组导致较轻的神经管缺陷出现脑裂或脊柱裂，这意味着神经管闭合中存在典型的Wnt通路。此外，标准Wnt通路对AP轴的伸长至关重要，至少部分通过激活短梗(T型)表达式(山口等，1999年). 因此，我们分析了T型以证实LWR降低不是由于典型Wnt通路功能丧失所致。在头巾的早期阶段，T型表示为脊索、节点和原始条纹。在Wnt3a型-空鼠标，T型据报道，在前原始条纹中表达缺失。失去T型表达被解释为中轴线缩短的原因Wnt3a型^−/−突变体(山口等，1999年). 然而，在驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体，T型前原始条纹的表达似乎正常，表明LWR的降低不是由于典型Wnt通路的失败(图2A、B)以及减少的Dvl剂量驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体不会导致Wnt信号功能的全面丧失。

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图2

原位杂交分析Brachyury公司(T型)在头巾早期驱动器1^−/−;行程2^−/−和磅/磅突变胚胎

(A类)T型是一个已知的典型Wnt通路下游靶基因，在对照胚胎的脊索、节和原始条纹中表达(驱动器1^−/−;行程2^+/−). (B类)在驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体，T型节点和原始条纹中的表达保持不变，表明Wnt通路的活性正常。然而，T型脊索中的表达异常增宽。T型-脊索外也观察到阳性细胞（箭头），这与细胞向中央中线运动的中断一致。与野生型室友相比(C),T型在脊索中的表达也扩大了磅/磅胚胎(D类).T型-脊索外也观察到阳性细胞（D，箭头）。

与原始条纹相反，我们观察到T型脊索上的染色。在野生型胚胎中，脊索纤细，没有T型-脊索外的阳性细胞(图2A). 在驱动器1^−/−;驱动器2^−/−然而，突变体的脊索更宽，也有一些T型-脊索外的阳性细胞(图2B). 由于在没有细胞分裂的情况下，小鼠脊索的延长被认为是由收敛的伸展样细胞运动驱动的(贝丁顿，1994年)，不同的模式T型染色驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体表明脊索细胞向中线的PCP依赖性会聚减少。

磅/磅胚胎也表现出收敛延伸的中断

为了检验这个假设的有效性，我们检验了Lp公司小鼠PCP基因中含有功能丧失突变的突变体Vangl2号机组(Kibar等人，2003年;Kibar等人，2001年;Murdoch等人，2001年). 当我们分析T型中的表达式磅/磅小鼠胚胎，我们观察到类似的脊索加宽，以及T型-脊索外的阳性细胞，进一步证明这些缺陷可能是由于会聚伸展中断所致(图2C、D). 此外，当我们确定神经支配中的LWR时磅/磅我们发现，突变胚胎与驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体，磅/磅在关闭1之前，胚胎的LWR显著降低(图3A).磅/+突变体表现出扭结或环状的尾巴，但在大多数情况下仍能关闭神经管，并表现出LWR的适度降低。伴随着降低的LWR，磅/+胚胎表现出神经管延迟闭合：其神经管在8-9体节期通常保持未融合，而在同一阶段的野生型胚胎中，神经管沿AP轴广泛融合(图3B、C). 这些结果进一步证明，哺乳动物PCP通路调节收敛延伸，从而影响小鼠的神经管闭合。

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图3

之间的遗传相互作用驱动器2和磅和减小的长宽比（LWR）磅/磅和驱动器2^−/−;磅/+神经发育期间的胚胎

(A类)类似于驱动器1^−/−;行程2^−/−胚胎，磅/磅突变体在神经形成期间表现出LWR显著降低，而磅/+胚胎表现出中等程度的缩小。在第八阶段，野生型胚胎的一些神经折叠已经并置，并开始在背中线融合(B类). 然而，在降低LWR的同时，神经折叠在磅/+胚胎(C)相距甚远磅/磅胚胎(D类)属于同一体节期。两者类似驱动器1^−/−;驱动器2^−/−和磅/磅所有的变种人驱动器2^−/−; 磅/+胚胎在新胚形成过程中LWR也显著降低(E类). 从中间的交叉点驱动器1^+/−;驱动器2^+/−;磅/+和驱动器2^−/−老鼠，所有的后代驱动器2^−/−或驱动器1^+/−;驱动器2^−/−(F类)E10.5处神经管闭合正常。相比之下，所有驱动器1^+/−;驱动器2^−/−; 磅/+和驱动器2^−/−; 磅/+胚胎表现为颅轴裂(G公司). 误差条代表s.d。

神经形成过程中Dvl2的质膜分布及其对DEP结构域的依赖性

据报道，在飞翼发育过程中，Dsh蛋白不对称地定位在质膜上(阿克塞尔罗德，2001;Bastock等人，2003年). 这种不对称的膜分布依赖于并对正确建立平面细胞极性很重要(阿克塞尔罗德，2001;Bastock等人，2003年). 我们最近生成了一个驱动器2包含EGFP编码序列的细菌人工染色体（BAC）转基因，插入到驱动器2(Wang等人，2005年)并发现转基因Dvl2-EGFP蛋白在Corti器官中显示出Vangl2依赖的极化膜分布。此外，转基因还能够挽救耳蜗延长和立体纤毛定向缺陷驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体(Wang等人，2005年)，表示驱动器2BAC转基因可以完全替代内源性驱动器2内耳发育期间的功能。

我们进一步发现驱动器2BAC转基因，以及其他驱动器2BAC转基因(Dvl2-EGFP2型,图4A)其中包括两个侧翼的洛克斯普基地，也能够进行救援驱动器1^−/−;行程2^−/−和驱动器2^−/−;磅/+可育成人的突变体，表明编码的Dvl2-EGFP融合蛋白也可以在神经形成过程中替代内源性Dvl2(图4B). 从这两个转基因获得的所有六个独立株系中获得了一致的结果，这表明BAC转基因方法是一种生产能够替代内源性Dvl2的转基因蛋白的可靠方法，可能是因为它能够更一致地重述内源性基因表达模式和水平(Lee等人，2001年).

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图4

Dvl2在神经形成过程中参与会聚延伸和膜分布的结构域要求

(A类)内源性野生型基因组结构示意图驱动器2等位基因，靶向驱动器2无效等位基因(Dvl2 KO阀)，两种野生型驱动器2BAC转基因，图2-EGFP1和Dvl2-EGFP2型，和三个突变体驱动器2BAC转基因：ΔDIX-EGFP公司, ΔDEP-EGFP程序和dsh1-EGFP.尽管图2-EGFP1有一个EGFP盒式磁带在帧内融合到的最后一个密码子驱动器2和一个LoxP位点插入内含子2进行基因分型（参见材料和方法），Dvl2-EGFP2型包含插入3′侧翼基因的额外LoxP位点阿卡德夫（酰基酶A脱氢酶，超长链）。ΔDIX-EGFP公司和ΔDEP-EGFP公司删除编码氨基酸67-159和442-736的序列，产生缺失突变转基因。dsh1-EGFP将AAG替换为ATG，在氨基酸446处引入K到M取代，从而产生点突变。下部面板显示了野生型的序列比对Dvl2-EGFP型和修改后的dsh1-EGFPBAC转基因以及内源性小鼠Dvl1、Dvl2、Dvl 3、，非洲爪蟾XDsh、，果蝇属Dsh和dsh1型在苍蝇中发现突变。尽管Dvl2-EGFP1、Dvl2-EGFP2(B类)和ΔDIX-EGFP公司(F类)可以完全修复神经管闭合缺陷驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体，ΔDEP-EGFP公司转基因完全不能修复神经管缺陷驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体(C). 共聚焦分析表明，尽管ΔDIX-EGFP主要定位于膜(G公司,H（H）)，ΔDEP-EGFP均匀分布于细胞质中(D类,E类).

我们研究了在小鼠神经形成过程中，Dvl2蛋白是否以极化方式定位行程2BAC转基因。在不同体节期的神经形成胚胎中，我们观察到Dvl2-EGFP转基因蛋白主要定位于神经上皮细胞的质膜上(图5A、E、I). Dvl2-EGFP和F-actin在某些细胞中的较弥漫的表观分布图5A-D是紧靠心尖质膜下方捕获单个焦平面的结果，可能反映了Dvl2-EGFP与心尖质体成员的密切联系。当整个系列z（z）对堆叠进行了检查（数据未显示），很明显，Dvl和actin都定位在外侧质膜上，因为单个光学切片更基本地扫描细胞。然而，我们无法找到任何证据证明神经上皮平面上Dvl2-EGFP分布的不对称模式(图5A、E、I; 数据未显示）。此外磅突变并不影响Dvl2-EGFP的膜定位，因为我们在磅/磅突变体(图5B、F、J; 数据未显示）。使用活的Dvl2-EGFP共焦显微镜在多个转基因株系中观察到一致的结果(图5I、J)和短暂固定的胚胎(图5E、F)或用抗GFP抗体染色的永久固定胚胎(图5A、B). 此外，尽管在非洲爪蟾斑马鱼可以改变细胞沿ML轴的方向和伸长(Jessen等人，2002年;Veeman等人，2003b;Wallingford等人，2000年)，我们的分析没有发现野生型和磅/磅胚胎（比较图5E、F具有5G，高). 我们注意到非洲爪蟾中胚层中ML细胞的极性很容易观察到，因为当细胞插入时，它们在内侧排列和伸长(Shih和Keller，1992年). 相比之下，神经细胞在向内收敛伸展时只是偶尔伸长非洲爪蟾，所以在任何给定的时间，只有少数细胞会被拉长，并出现内侧极化(Elul等人，1997年). 因此，用静态共焦成像评估神经细胞的内侧极性可能更加困难。

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图5

在神经形成过程中，Dvl2-EGFP主要定位于神经上皮膜

神经形成胚胎神经上皮的激光扫描共聚焦显微镜的单光学切片显示，在野生型背景下，Dvl2-EGFP主要定位于神经上皮（A、E、I）的质膜。在用抗EGFP抗体染色的野生型和Lp/Lp突变的两体期胚胎中观察到一致的结果(A类,B类)或通过直接可视化来自短暂固定的五体节期胚胎的Dvl2-GFP信号(E类,F类)或培养活的八成熟期胚胎(我,J). Dvl2-EGFP和肌动蛋白在A、B细胞中的胞质分布明显弥散，这是由于共焦激光显微镜扫描了位于顶端质膜正下方的焦平面所致。来自二体期和五体期的野生型和突变胚胎也用磷脂酶染色(C,D类,G公司,H（H）)标记F-actin。当整个系列z（z）对堆叠进行了检查（数据未显示），很明显，Dvl和肌动蛋白都定位在外侧质膜上，因为单个光学切片更基本地扫描细胞。奇怪的是，在五体细胞期（E-H），Dvl2-EGFP和肌动蛋白在体细胞中胚层的分布也更为分散。Dvl2-EGFP在神经上皮中的总体分布在磅/磅突变体（B、D、F、H、J、L；数据未显示）。(K、 L（左）)培养中活野生型（K）或Lp/Lp突变型（L）胚胎的DIC图像。NE，神经上皮；SM，体细胞中胚层。

Dsh/Dvl中的两个保守结构域DIX和DEP在Wnt通路和PCP/收敛延伸中发挥不同的作用(Axelrod等人，1998年;Boutros等人，1998年;Rothbacher等人，2000年;Wallingford和Habas，2005年;Wallingford等人，2000年). 在非洲爪蟾，中胚层的内侧插入需要Xdsh的C末端DEP结构域，而不是N末端DIX结构域(沃林福德和哈兰德，2001年;Wallingford等人，2000年). 为了证实哺乳动物神经形成需要相同的Dvl2结构域，我们产生了突变体驱动器2BAC转基因与非洲爪蟾(ΔDEP-EGFP公司,图4A) (Rothbacher等人，2000年;沃林福德和哈兰德，2001年;Wallingford和Harland，2002年;Wallingford等人，2000年). 当跨入时驱动器1^−/−;行程2^−/−背景，ΔDEP-EGFP公司完全未能修复神经胚缺损(图4C; 八驱动器1^−/−;驱动器2^−/−;ΔDEP-EGFP公司预计有6名患者痊愈，所有患者均表现为颅脊柱痉挛）。相比之下，aΔDIX-EGFP公司部分DIX结构域被删除的转基因仍然可以完全修复驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体(图4F; 12驱动器1^−/−;驱动器2^−/−;ΔDIX-EGFP公司预期，15例恢复，全部显示正常神经管闭合）。作为ΔDIX-EGFP公司转基因去除了N末端区域的VKEEIS基序，该基序对典型Wnt通路中的Dvl2功能至关重要(Capelluto等人，2002年)，这一结果也证实了驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体不是由于Wnt信号功能的丧失。

当我们研究突变体Dvl2蛋白在神经形成过程中的分布时，我们发现尽管ΔDIX-EGFP仍然主要是膜定位的(图4G)与野生型Dvl2-EGFP无明显区别，ΔDEP-EGFP均匀分布于细胞质中(图4D). 这一结果与现有文献一致，并证实了哺乳动物神经形成过程中DEP结构域靶向Dvl2质膜的要求。

与苍蝇dsh1等位基因相同的点突变破坏了Dvl2-BAC公司挽救神经胚缺损驱动器1^−/−;驱动器2^−/−

上述结果表明，依赖于DEP的Dvl2-EGFP质膜定位可能是其参与神经会聚延伸和神经管闭合的先决条件。然而，Dvl2-EGFP在神经上皮和Corti器官中的定位存在差异，其中Dvl2-EGFP表现出不对称的膜分布，在磅/磅突变体，让人联想到飞PCP的建立(图6E)（请参见Wang等人，2005年). 我们想知道这是否是由于Dvl蛋白在聚合延伸和PCP建立过程中的功能不同。为了进一步解决这个问题，我们测试了点突变dsh1号机组明确废除PCP(Axelrod等人，1998年;Boutros等人，1998年)，可能影响哺乳动物的会聚延伸。这个dsh1号机组突变导致C末端DEP结构域的K到M错义突变(Axelrod等人，1998年;Boutros等人，1998年). 利用BAC重组，我们将一个相同的突变引入Dvl2-EGFP型美国银行(图4A)并产生转基因小鼠。全部驱动器1^−/−;行程2^−/−; dsh1-EGFPE9.5或之后恢复的胚胎表现为颅轴裂(图7A、D，预计8人，6人康复，所有患者均表现为颅脊柱痉挛），表明dsh1型突变完全破坏了Dvl2在收敛扩展期间的功能。此外，与我们的建议一致，即会聚延伸是耳蜗延伸的基础(Wang等人，2005年)，我们在驱动器1^−/−;驱动器2^−/−; dsh1-EGFP胚胎(图6E、F). 然而，在野生型或驱动器1^−/−;驱动器2^−/−背景，这种突变似乎对Dvl2-EGFP的膜定位没有明显影响(图7B、C)神经形成过程中的神经上皮。

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图6

Dvl2-EGFP和dsh1-EGFP在Corti器官中的定位

(A-E公司)E18.5处Corti整体器官毛细胞顶面共聚焦扫描，显示天然Dvl2-EGFP（A，C，E）或dsh1-EGFP信号。(A′-E′)是Dvl2-GFP（绿色，A′，C′，E′）或dsh1-EGFP（绿色，B′，D′）与毛细胞膜和静纤毛束（红色）的覆盖层，用指骨素染色勾画。在E18.5，与野生型Dvl2-EGFP（A，A′）相比，dsh1-EGFP在远端膜上的定位更具点状（B和B′中的星号）。相比之下，在驱动器1^−/−;驱动器2^−/−背景在E16.5，dsh1-EGFP在膜上的定位大多丢失，并在细胞质中观察到积聚（箭头位于D，D′）。驱动器1^−/−;驱动器2^−/−; dsh1-EGFP突变体也显示出内部毛细胞的排列错误（D′中的箭头）。虽然野生型Dvl2-EGFP可以在驱动器1^−/−;驱动器2^−/−背景E16.5（C，C′），其膜定位减少，不再局限于远侧（E，E′箭头）Lp/Lp这一阶段的突变体。

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图7

dsh1-EGFP未能挽救患者的颅气管炎、耳蜗伸长和静睫状体极性表型行程1^−/−;驱动器2^−/−胚胎

(A类,D类)驱动器1^−/−;驱动器2^−/−; dsh1-EGFP胚胎（A中右侧）在E9.5和E16.5处表现出颅轴痉挛，表明dsh1-EGFP不能弥补神经形成中的会聚延伸缺陷驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体。(B类)共聚焦分析表明，dsh1-EGFP主要定位于神经上皮细胞的质膜。(C)阴茎倍体染色的共焦分析。(E类,F类)耳蜗在p0时从驱动器1^−/−;驱动器2^+/−和驱动器1^−/−;驱动器2^−/−; dsh1-EGFP小鼠，表明dsh1-EGFP也未能挽救驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体也被认为是由于收敛延伸的中断。(G公司,我)在基底部（G）或内侧区（I）进行的共焦扫描显示p0的Corti器官中有均匀的睫状体定向驱动器1^−/−;驱动器2^+/+鼠标。(H（H）,J)然而，在Corti的器官中驱动器1^−/−;驱动器2^−/−; dsh1-EGFP小鼠，一些毛细胞中的静纤毛束方向错误（箭头所示）。也可以观察到外毛细胞的错位。

确定是否dsh1号机组也影响哺乳动物PCP的建立，我们分析了耳蜗中的静纤毛束方向。在P0（出生后第0天）对照幼崽中，耳蜗中感觉毛细胞的立体纤毛束显示出均匀的方向(图7G，I). 相比之下，P0驱动器1^−/−;驱动器2^−/−; dsh1表皮生长因子耳蜗，我们观察到均匀的静纤毛方向被破坏，静纤毛的形式不太容易辨认(图7H，J)，类似于驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体。偶尔会出现内毛细胞排列不齐，这在驱动器1^−/−;驱动器2^−/−和驱动器2^−/−; 磅/+突变体(Wang等人，2005年)，也观察到(图7J和图5D'，箭头）。

在飞翼开发中dsh1型突变被认为通过取消DSH-EGFP在质膜上的定位而破坏PCP的建立(阿克塞尔罗德，2001). 调查如何dsh1号机组突变可能破坏哺乳动物的PCP，我们检测了其在静纤毛束形成过程中的分布。在E16.5中驱动器1^−/−;驱动器2^−/−; Dvl2-EGFP型胚胎，在检测到睫状体极性之前，野生型Dvl2-EGFP已经定位于远侧膜(图6C，C′），类似于E18.5处较成熟的毛细胞(图6A，A′）。然而，在E16.5中驱动器1^−/−;驱动器2^−/−; dsh1表皮生长因子胚胎，大多数dsh1-EGFP失去了膜定位(图6D，D′，箭头），并在顶端细胞质中形成聚集体，表明dsh1号机组突变通过干扰Dvl在膜上的定位，影响了哺乳动物PCP建立中的Dvl功能。有趣的是，dsh1-EGFP聚集体并不是均匀分布在整个顶端细胞质中，而是主要局限于毛细胞的远端。此外，通过增加野生型Dvl的剂量，细胞质dsh1-EGFP分布在表型野生型E18.5中得到了很大程度的挽救驱动器1^−/−;驱动器2^+/−; dsh1-EGFP耳蜗dsh1-EGFP蛋白主要定位于毛细胞远端的膜(图6B，B′），尽管与野生型Dvl2-EGFP相比，其定位似乎有些点状(图6A，A′）。E16.5中也发现了类似的差异（数据未显示）。推测，野生型Dvl3和Dvl2蛋白的存在可能解释了dsh1-EGFP定位缺陷的部分修复。

有趣的是磅突变也影响了Dvl2膜的定位，但方式不同：在E16.5中磅/磅突变体Dvl2-EGFP表现出随机和减少的顶端膜定位，但很少在顶端细胞质中形成聚集体(图6E). 然而，Dvl2-EGFP在磅/磅突变体与dsh1-EGFP膜分布的丢失驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体与发育后期均匀静纤毛极性的破坏相关(Montcouquiol等人，2003年;Wang等人，2005年). 总之，这些结果证明了极化的Dvl2膜定位在哺乳动物毛细胞PCP建立中的重要性，但在神经形成过程中不在神经上皮中。

讨论

最近的研究表明非洲爪蟾斑马鱼需要几种同源蛋白参与在苍蝇中建立PCP，这表明一种与PCP途径高度相似的机制调节收敛延伸(姆洛德齐克，2002年;Myers等人，2002年;Tada等人，2002年;Veeman等人，2003a). 然而，也观察到显著差异，可能代表不同下游细胞和发育过程中每个途径的进化适应(姆洛德齐克，2002年;Tada等人，2002年;Veeman等人，2003a). 我们的结果进一步证明，神经上皮和PCP的会聚延伸在小鼠中共存，并且可能通过使用同一组核心PCP蛋白共同进化。

使用LWR测量和T型原位神经支配驱动器1^−/−;行程2^−/−胚胎，我们展示了哺乳动物的基本功能Dvl（驱动阀）AP轴的协同延长和ML轴的收缩中的基因，这是一个形态发生过程，类似于在非洲爪蟾相比之下，尽管Dsh/Dvl在典型Wnt途径中也是必不可少的，但我们对驱动器1^−/−;驱动器2^−/−胚胎在神经形成过程中没有显示Wnt信号功能的全面丧失，可能是因为剩余的Dvl3活性足以补偿Wnt信号中Dvl1和2的丧失。这些结果也与我们的解释一致，即驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体并非继发于典型Wnt通路中的缺陷，而是继发于PCP通路中的缺损。我们的发现进一步支持了这一解释，即LWR和T型在磅/磅和Lp/+；行程2^−/−突变体。磅是Stbm公司同系物Vangl2号机组，是PCP通路的核心成分，但不是典型Wnt通路的一部分(Darken等人，2002年;Goto和Keller，2002年;Kibar等人，2001年;默多克等人，2001年). 最后，ΔDIX-EGFP公司缺失VKEEIS基序的BAC转基因对Dvl2参与典型Wnt途径至关重要(Capelluto等人，2002年)仍然能够完全挽救驱动器1^−/−;驱动器2^−/−突变体，而ΔDEP-EGFP公司和dsh1-EGFP转基因完全没有这样做，表明神经管闭合缺陷驱动器1^−/−;行程2^−/−不是由于Wnt信号功能的丧失，而是由于PCP通路的中断。

我们对LWR的分析表明，神经板在整个神经形成过程中经历了协调的延长和变窄，类似于在非洲爪蟾神经管闭合。此外，三个小鼠突变体，驱动器1^−/−;驱动器2^−/−,磅/磅和Lp/+；驱动器2^−/−，均表现出类似的严重神经管闭合缺陷。在每种情况下，LWR在七眼期之前都有显著降低，七眼期是神经形成的关键时期，提升的神经折叠位于背中线。这些发现表明，哺乳动物PCP途径是这种会聚伸展样形态发生过程的驱动力非洲爪蟾，这一过程的中断是神经管闭合缺陷的原因，而不是结果。然而，值得注意的是，我们的数据并不意味着哺乳动物神经形成过程中涉及到类似类型的细胞运动。虽然在中进行了收敛扩展非洲爪蟾由细胞嵌入驱动(Elul和Keller，2000年;Elul等人，1997年;Shih和Keller，1992年;沃林福德和哈兰德，2001年)也可以通过斑马鱼的定向迁移或定向细胞分裂来实现(Gong等人，2004年;Solnica-Krezel等人，1995年;Wallingford等人，2002年). 哺乳动物神经收敛延伸背后的确切细胞行为尚待确定。

有人认为，一种高度保守的途径类似于苍蝇中的PCP途径，可以调节非洲爪蟾和斑马鱼。我们的结果在哺乳动物中扩展并加强了这一概念，证明神经收敛延伸的破坏和PCP的建立在三个小鼠突变体中共存：驱动器1^−/−;驱动器2^−/−，磅/磅和Lp/+；行程2^−/−（另请参见Wang等人，2005年). 基于类似的神经管闭合缺陷，我们推断哺乳动物PCP同源物的突变塞尔斯1和预测3/6导致耳部PCP缺陷，也导致神经形成过程中的会聚延伸缺陷(Curtin等人，2003年;Wang等人，2006年). 我们的发现是错义点突变dsh1号机组在苍蝇中发现，它特别干扰PCP途径(Axelrod等人，1998年;Boutros等人，1998年)还废除了Dvl2调节会聚延伸和静睫状体极性的功能，表明Dsh/Dvl通过非常保守的机制在会聚延伸及PCP的建立中发挥作用。这一观点也得到了这样一个事实的支持，即遗传背景变异在相同程度上修改了神经管闭合和静睫状体极性缺陷。

利用表达能够替代内源性Dvl2功能的Dvl2-EGFP融合蛋白的BAC转基因，我们发现Dvl2-EGFP主要定位于神经上皮细胞的质膜，这是其参与会聚延伸的先决条件(Park等人，2005年). 与苍蝇和非洲爪蟾我们发现，在Dvl2-EGFP定位到质膜及其在神经形成过程中介导神经管闭合和会聚延伸的能力中，需要C末端DEP结构域。相比之下，尽管已知Vangl2绑定到Dvl和磅突变削弱了结合(Torban等人，2004年)，我们没有发现Dvl2-EGFP在神经形成的神经上皮中的分布有任何变化磅/磅突变体，表明神经上皮中Dvl2的膜定位并不严重依赖Vangl2的功能。该观察结果与我们之前在耳蜗的发现形成了直接对比，Dvl2-EGFP显示磅-依赖性不对称膜分布与静纤毛的定位和定向相关，类似于飞翼细胞中PCP的建立(Wang等人，2005年). 类似地，我们当前的结果是dsh1-EGFP转基因还揭示了在PCP建立过程中经历会聚延伸的神经上皮细胞和感觉毛细胞之间的差异。在飞行中dsh1号机组点突变破坏Dishevelled细胞膜定位(阿克塞尔罗德，2001). 在这里，我们发现同一点突变消除了Dvl2-EGFP膜在耳蜗感觉毛细胞中的定位驱动器1^−/−;驱动器2^−/−胚胎及其建立PCP的能力。相比之下，尽管dsh1号机组在神经形成过程中，突变也破坏了Dvl2-EGFP在会聚延伸中的功能，我们未检测到dsh1-EGFP分布在神经上皮中的任何显著变化。总之，这些数据表明，Dvl2-EGFP的质膜分布可能对其参与会聚延伸是必要的，但还不够。与Dvl2一样，最近显示Fzd3和Fzd6显示磅-内耳中的依赖性不对称定位，但其在神经上皮中的分布尚未见报道(Wang等人，2006年).

如果Dvl蛋白通过高度保守的机制在收敛延伸和PCP中发挥作用，那么为什么磅和dsh1号机组突变对神经上皮细胞（会聚延伸）和感觉毛细胞（建立PCP）中Dvl2-EGFP定位有不同影响？一种可能性是另一种万格尔同源，Vangl1号机组，编码一种蛋白质，允许Dvl2在神经上皮而非内耳中的膜定位。在斑马鱼中，Vangl1和Vangl2的表达模式基本上不重叠，但生化功能相似(Jessen和Solnica-Krezel，2004年).Vangl1号机组尚未在发育中的哺乳动物神经管或内耳中仔细检查表达。

第二种可能性是，在经历会聚延伸的神经上皮中，Dvl2-EGFP分布在依赖Vangl2和功能性PCP通路的特定位置，但我们的成像技术不够敏感，无法识别它们。为了解决这个问题，我们使用了不同的Cre公司转基因与floxedDvl2-EGFP2型转基因以产生由非GFP细胞包围的单个Dvl2-EGFP细胞组成的嵌合胚胎。我们的初步结果表明，Dvl2-EGFP没有极化分布，这可能与胚胎的AP轴或ML轴有关。类似研究非洲爪蟾也没有发现Dsh在进行会聚伸展的中胚层细胞中一致的极化膜定位(Park等人，2005年).

第三种可能性是，尽管Dvl在PCP建立和收敛扩展中的作用类似，但不同的细胞过程需要不同的作用模式。例如，在排列良好的感觉毛细胞中建立极性的过程中，Dvl和其他PCP成分的极化分布决定了毛细胞内静纤毛集合的精确位置。相比之下，在经历动态细胞重排和插入的细胞中，Dvl和其他PCP成分的定位相对可移动，以介导细胞间黏附和产生牵引力的临时细胞骨架组装(Ulrich等人，2005年;Wallingford和Harland，2002年). 支持性证据来自以下观察结果：非洲爪蟾，XDsh阻止收敛延伸的突变体也会导致不太稳定的膜突起(Wallingford等人，2000年). 这一观点也与PCP信号在会聚延伸中起着允许因素的建议相一致，而细胞插入的排列和方向可能由AP极性决定(Ninomiya等人，2004年). 在这种情况下，Dvl在神经上皮中的膜定位可能仅代表稳定状态分布，不需要Vangl2的功能，也不赋予极性。

为了更深入地了解PCP途径在哺乳动物中的功能，不仅要找出PCP与细胞和分子水平上的聚合延伸之间的相似之处，还要找出它们之间的差异，这一点非常重要。在这方面，值得注意的是非洲爪蟾斑马鱼也涉及Wnt/Ca²⁺信号转导，一种在苍蝇PCP测定中没有牵连的途径，但仍需要PCP蛋白的功能，如Dsh和Pk(Veeman等人，2003a). Wnt/Ca的功能分析²⁺小鼠体内的途径可能会导致更好地理解核心PCP蛋白如何协同进化以调节收敛延伸和PCP测定。

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