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肝病学。作者手稿；PMC 2014年9月9日提供。
以最终编辑形式发布为：
肝病学。2011年7月；54(1): 133–144.
数字对象标识：10.1002/庚24341
预防性维修识别码：项目经理4158408
美国国立卫生研究院：NIHMS620875
PMID：21488066

脂肪酸和内毒素激活小鼠肝细胞中的炎症小体，释放危险信号刺激免疫细胞

Timea Csak公司,米查尔·甘兹,贾斯汀·佩斯皮萨,凯伦·柯迪斯,安吉拉·多尔加尼乌克、和Gyongyi Szabo公司
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和炎性体激活的发病机制涉及到连续性打击。炎症小体是由内源性和外源性危险信号诱导的，它将前白细胞介素-1β（pro–IL-1β）裂解为分泌的IL-1β。脂多糖（LPS）是一种toll样受体4配体，在NASH中发挥作用，并激活炎症小体。在这项研究中，我们假设NASH中的炎症小体被涉及内源性和外源性危险信号的多次点击激活。使用蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饮食诱导的NASH和高脂饮食诱导的NASH小鼠模型，我们发现炎症小体[包括NACHT、LRR和PYD结构域-包含蛋白3（NALP3；冰毒）、凋亡相关的斑点状CARD结构域-含蛋白、pannexin-1和前caspase-1]的上调与对照肝脏相比，在信使RNA（mRNA）水平，脂肪性肝炎小鼠的caspase-1活性和成熟IL-1β蛋白水平增加。在只有脂肪变性的小鼠中没有炎症小体激活。MCD饮食使小鼠对LPS诱导的肝脏NALP3、pannexin-1、IL-1βmRNA和成熟IL-1β蛋白水平的增加敏感。我们首次证明脂肪性肝炎中分离的肝细胞发生炎症小体激活。我们的新数据表明，饱和脂肪酸（FA）棕榈酸（PA）激活炎症小体，并诱导对LPS诱导的肝细胞IL-1β释放的敏感性。此外，PA以半胱天冬酶依赖的方式触发肝细胞释放危险信号。这些肝细胞衍生的危险信号反过来激活肝脏单核细胞中的炎症小体、IL-1β和肿瘤坏死因子α的释放。

结论

我们的新发现表明，饱和FA以首次撞击的形式代表一种内源性危险，上调NASH中的炎症组，并诱导对LPS第二次撞击肝细胞中IL-β释放的敏感性。此外，接触饱和脂肪酸的肝细胞会释放危险信号，触发免疫细胞中的炎症小体激活。因此，肝细胞在协调组织对NASH危险信号的反应中起着关键作用。

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是最常见的肝病之一，影响西方世界三分之一以上的人口。1,2NAFLD的组织病理学谱包括单纯脂肪变性、脂肪变性伴炎症和脂肪性肝炎伴坏死炎症（伴或不伴纤维化）。1最后一种是进行性的，可导致肝硬化，甚至肝细胞癌。11998年，提出了非酒精性脂肪性肝炎（NASH）发病机制的两击假说。最初的步骤是由于脂肪组织中游离脂肪酸（FFA）的过量输送以及肝细胞中脂质合成和输出之间的不平衡导致肝脏中的脂肪堆积。三然而，脂肪积累作为第一次撞击的组成部分所起的作用，以及进一步侮辱对肝脏致敏的影响尚不完全清楚。据报道，NASH患者中饱和和单不饱和FFA水平增加4,5并且与引发炎症有关，因此可能成为内源性危险信号。6内毒素或脂多糖（LPS）是一种由类毒素受体4（TLR4）检测到的细菌壁成分，可作为第二次打击，导致进行性肝损伤。蛋氨酸胆碱缺乏型（MCD）脂肪性肝炎小鼠的血浆内毒素水平升高7以及NAFLD患者。8重要的是，脂肪肝对脂多糖高度敏感，TLR4缺乏可减轻NASH动物模型中的肝脏脂肪变性和炎症。9

炎症小体是炎症的主要促成因素。它们是大的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1激活的多蛋白复合物，通过细胞内NOD样受体（NLR）感知外源和内源性危险信号。10在炎性体的三种原型中，NACHT、LRR和PYD结构域包含蛋白质3（NALP3）参与感应内源性危险信号，包括尿酸晶体和淀粉样β蛋白。11作为对危险信号的响应，NALP3通过其适配器分子凋亡相关斑点样CARD-结构域包含蛋白（ASC）与前caspase-1相互作用，从而激活cas-pase-1。活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1促进促炎细胞因子[前白细胞介素-1β（前IL-1β）、前IL-18和IL-33]的分裂和成熟，以促进/维持炎症。10,11多项研究表明，炎症小体的激活是两种不同信号的结果：一种是激活前IL-1β的转录，通常由TLR配体提供，另一种是介导炎症小体的组装。10,11在一些细胞中，如巨噬细胞，caspase-1可以通过释放内源性三磷酸腺苷（ATP）而被激活，因此单剂量TLR4配体LPS足以诱导IL-1β的迅速释放。12炎症小体在肝脏中的库普弗细胞或肝细胞中的表达和作用尚未在NASH中进行评估。

在这项研究中，我们假设脂肪酸（FA）可能作为危险相关分子模式（DAMP），激活炎症小体，从而在脂肪性肝炎中发挥第一作用。我们还测试了FA可能在肝实质细胞和免疫细胞中发挥不同作用，并促进其他促炎因子的释放，以旁分泌方式诱导炎症小体激活的可能性；在后一种情况下，FA可能会在最初对LPS不敏感的细胞中诱导对LPS诱导的炎症小体激活（第二次撞击）的敏感性。因此，我们使用MCD诱导或高脂肪饮食（HFD）诱导的脂肪性肝炎小鼠和脂肪变性的瘦素缺乏小鼠来测试炎症小体激活在NASH中发生的假设。除了NASH小鼠模型外，我们还评估了NASH患者的人类肝脏样本。

我们的新数据表明，饱和脂肪酸可诱导肝细胞中炎症小体的上调，并导致对脂多糖诱导的炎症小体激活和炎症损伤的敏感性。这些结果表明了持续炎症的新机制，并确定了NASH可能的新治疗靶点。

材料和方法

动物研究

这项研究得到了马萨诸塞大学医学院动物使用和护理委员会的批准。6至8周龄的雌性C57Bl/6野生型小鼠（每组6至8只）被喂食MCD饮食5周或HFD 4周或9个月。对照组小鼠接受相同的MCD饮食，补充DL-甲硫氨酸（3 g/kg）和酒石酸胆碱（2 g/kg；Dyets，Inc.，伯利恒，PA）或常规啮齿动物饮食。我们还使用了9周龄的瘦素缺乏雌性小鼠（即ob/ob小鼠；B6.V-Lep ob/J，Jackson Laboratories）和年龄和性别匹配的对照组（C57Bl/6J）。在喂食MCD饮食的小鼠中，组织学证实存在脂肪性肝炎，而在喂食HFD的小鼠和ob/ob小鼠中，通过肝甘油三酯检测证明脂肪沉积。经腹腔注射TLR4配体LPS（西格玛，圣路易斯，密苏里州）【补充蛋氨酸胆碱（MCS）小鼠和MCD小鼠的体重为0.5毫克/千克，ob/ob小鼠的体重是12微克】。

生化分析和细胞因子测定

血清丙氨酸氨基转移酶水平用动力学方法（D-TEK，Bensalem，PA）测定，肝甘油三酯水平用L型甘油三酸酯H试剂盒（Wako Chemicals USA，Inc.，Richmond，VA）评估。用BD细胞计数珠阵列（BD Biosciences，Sparks，MD）测定血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）和IL-1β水平。

组织病理学分析

福尔马林固定肝脏切片用苏木精染色，而最佳切割温度冷冻样品用油红O染色；所有载玻片均经显微镜分析。ImageJ和Microsuite（奥林巴斯软成像解决方案股份有限公司，德国穆斯特）被用于20个高功率场上指示放大倍数的成像分析。

RNA分析

使用RNeasy试剂盒（马里兰州日耳曼镇Qiagen Sciences）和柱上DNA消化法纯化RNA。互补DNA通过逆转录系统转录（Promega Corp.，Madison，WI）。如前所述，使用iCycler（加州Hercules Bio-Rad Laboratories，Inc.）和SYBR Green作为双链DNA检测器进行实时定量聚合酶链反应（qPCR）13; 引物序列如所示支持表1.

半胱氨酸天冬氨酸酶活性测定

用比色法测定新制备的全肝裂解物中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1活性。caspase-1活性分析基于WEHD-pNA（Trp-Glu-His-Asp-p-硝基苯胺）底物的裂解（明尼苏达州明尼阿波利斯R&D Systems）。

乳酸脱氢酶（LDH）释放

LDH分析（西格玛-阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）用于测量释放到培养基中的细胞质LDH量，作为膜完整性和细胞活力的指标。

体外试验实验

如前所述，通过基于酶的组织消化法分离原代肝细胞和肝单核细胞（LMNCs）。14将肝细胞镀到胶原蛋白涂层板上，并用LPS（1000 ng/mL）、棕榈酸（PA）和牛血清白蛋白（0.33 mM）刺激肝细胞，或同时使用或不使用羧苯氧基-戊基-丙氨酸-天冬氨酸-[O（运行）-甲基]-氟甲基酮（ZVAD；40µM）。通过台盼蓝染色评估细胞活力。用qPCR评估细胞群体的纯度。

如前所述，维持Hepa1-6小鼠肝癌和RAW 264.7小鼠白血病单核-巨噬细胞细胞系。15

人体肝脏样本

这项研究符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则，并得到了马萨诸塞大学研究中人类受试者保护委员会的批准。所有参与者都提供了参与研究的书面同意书。

人类肝组织取自6名临床和生物病理证实的NASH患者（2名男性和4名女性；年龄=45±8岁）的活检样本。组织学检查显示脂肪变性（<1/3肝细胞，n=2；1-2/3肝细胞，n=3；>2/3肝组织，n=1），伴有罕见的肝细胞膨胀（0，n=2，和<1/3肝组织，n=4），炎症评分为1-4。5名患者出现小叶炎症。所有患者均未检测到纤维化。来自慢性丙型肝炎患者（n=5）的人肝组织被用作疾病对照。正常人类肝脏（n=4）的总RNA购自OriGene Technologies（马里兰州罗克维尔）

统计分析

适当时，采用非参数Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney检验确定统计显著性。数据以平均值和标准误差表示，在P（P）≤ 0.05.

结果

MCD饮食诱导的脂肪性肝炎与肝脏中IL-1β生成增加和NALP3炎症激活有关

NASH的MCD饮食模型以脂肪变性和显著炎症为特征，表现为肝脏中炎症细胞浸润数量增加和血清促炎细胞因子水平升高。9根据脂肪变性和炎性细胞浸润情况，对MCD饮食喂养小鼠中脂肪性肝炎的存在进行组织学评估。1我们发现，在其他促炎细胞因子中，9血清IL-1β水平(图1A)和肝脏IL-1β信使RNA（mRNA；图1B)与MCS对照组相比，MCD饮食喂养小鼠的肝脏显著增加。IL-1β通过半胱氨酸蛋白酶-1从前IL-1β中分离出来，半胱氨酸酶-1被炎症小体复合物激活。10,11因此，我们测试了炎症组分（NALP3、caspase-1和NALP适配器分子ASC）的表达，发现在MCD饮食喂养小鼠与MCS饮食喂养小鼠的肝脏中，所有mRNA水平均上调(图1B). NALP3通过衔接分子ASC与前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1结合，导致半胱氨酸蛋白酶-1的自动激活，从而裂解IL-1β。10与MCS对照组相比，喂食MCD饮食的小鼠肝脏中Caspase-1活性显著增加(图1C). 与MCS对照组相比，喂食MCD饮食的小鼠肝脏中成熟IL-1β蛋白水平增加，这与炎症小体表达和caspase-1激活增加一致(图1D). 除炎症外，喂食MCD饮食的小鼠肝脏中的甘油三酯水平也增加，这表明脂肪变性(图1E).

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MCD饮食诱导的脂肪性肝炎与肝脏中IL-1β生成增加和NALP3炎性体激活有关。C57Bl/6小鼠被喂食MCD饮食或MCS饮食5周。（A） 测定血清IL-1β水平和（B）IL-1β和NALP3炎性体复合物（包括NALP3、ASC、caspase-1和pannexin-1）的肝脏mRNA倍变化。通过测量肝脏中（C）caspase-1活性和（D）成熟IL-1β蛋白水平来评估炎症小体的功能活性。（E） 测量肝脏甘油三酯（每组6只小鼠）*P（P）与MCS饮食喂养的小鼠相比，<0.05。

长期（但非短期）HFD喂养与肝脏炎症激活相关

人类NAFLD的谱包括脂肪肝和NASH。尽管MCD饮食模型会诱发NASH，但HFD会在4周后导致脂肪变性，长期HFD喂养后会发现炎症迹象。16,17与此一致的是，我们观察到肝脏TNF-α表达增加(支撑图1)仅在HFD喂养9个月后在肝脏中，而不是在4周后。我们发现，喂食HFD 4周后，炎症小体的表达没有增加(图2A)而9个月的HFD喂养在mRNA水平诱导NALP3炎性体复合物（NALP3、ASC、caspase-1、pannexin-1和IL-1β）显著上调(图2B). caspase-1活性增加表明炎症激活(图2C)与相应的对照组相比，9个月HFD组的肝脏中成熟IL-1β蛋白水平较高，但4周HFD组没有(图2D). 肝甘油三酯水平升高表明MCD饮食中脂肪堆积(图1E)和9个月的HFD喂养(图2E). 4周HFD组和对照组的肝甘油三酯水平无显著差异(图2E); 值得注意的是，与其他对照组相比，该对照组的甘油三酯水平显著升高。

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长期HFD饮食诱导的脂肪性肝炎与肝脏中IL-1β生成增加和NALP3炎性体激活有关。C57Bl/6小鼠被喂食HFD或对照饮食4周或9个月。在（A）喂食HFD 4周或（B）喂食9个月后，测定IL-1β和NALP3炎性体复合体（包括NALP3、ASC、caspase-1和pannexin-1）的肝脏mRNA倍变化。通过测量肝脏中（C）caspase-1活性和（D）成熟IL-1β蛋白水平来评估炎症小体的功能活性。（E） 测量肝脏甘油三酯（每组6只小鼠）*P（P）与相应的对照组相比，<0.05。

无炎症特征的肝脂肪变性在瘦素缺乏（ob/ob）小鼠中也很明显。18与对照组相比，我们发现ob/ob小鼠没有炎症小体激活(支撑图2)、和体内与对照组相比，LPS激发未能在ob/ob小鼠中诱导加速炎症小体激活(支撑图2).

人类NASH中炎性体表达增加

为了验证小鼠模型的观察结果，我们接下来评估了人类肝脏。与健康对照组相比，NASH患者肝脏中炎症小体基因表达（包括NALP3、ASC、caspase-1和pannexin-1）显著增加(图3). 在人类NASH中的这一观察证实了NASH小鼠模型中炎症小体的激活。慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染患者的肝脏样本也显示炎症小体表达增加，尽管程度低于NASH肝脏(图3).

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人类NASH中炎症小体表达增加。用qPCR检测NASH患者、市售正常人肝脏（n=4）和HCV感染患者肝脏样本中NALP3、ASC、caspase-1和pannexin-1的mRNA表达*P（P）与对照组相比，<0.05。

脂多糖诱导肝脏炎症的上调

炎症激活需要两个信号，通常由内源性危险信号和TLR配体组成。10–12NASH的发病机制也与两次撞击有关。三有人认为，内毒素（LPS）可能是肠道来源的，通常起到强有力的第二次打击作用，并加重肝损伤。7–9在这里，我们测试了脂肪性肝炎中TLR4/LPS是否能进一步激活炎症小体。体内TLR4配体LPS刺激导致肝脏炎症小体成分NALP3和IL-1β在mRNA水平上调(图4A、B)肝脏中IL-1β蛋白水平升高(图4C)在MCD饮食中-喂食小鼠和MCS饮食-喂食老鼠。我们还注意到，在LPS激发后，喂食MCD饮食的小鼠比喂食MCS饮食的小鼠的炎症小体诱导率明显更高。总之，这些数据表明，NASH与炎症小体激活和对LPS诱导的上调炎症小体功能的敏感性有关。

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脂多糖诱导肝脏炎症小体的上调。C57Bl/6小鼠喂食MCD饮食或MCS饮食5周，并经腹腔注射LPS（0.5 mg/kg体重）2小时。用qPCR分析（A）NALP3和（B）IL-1β的肝脏mRNA表达，用酶联免疫吸附试验测定（C）成熟IL-1β蛋白水平（每组6只小鼠）*P（P）与基线时喂食MCS饮食的小鼠相比，<0.05#与LPS刺激后喂食MCS饮食的小鼠相比，P<0.05。

NASH肝细胞炎症反应体上调

肝脏由实质细胞（肝细胞）和免疫细胞（巨噬细胞等）组成，肝细胞代表大部分细胞。炎症体的表达和激活主要在先天免疫细胞中进行研究11; 迄今为止，炎症小体在肝实质细胞中的表达和作用尚不清楚。在这里，我们试图评估肝细胞中是否存在炎症小体激活。我们发现，与对照组相比，喂食MCD饮食的小鼠的原代肝细胞NALP3、ASC、caspase-1、pannexin-1和pro-IL-1βmRNA的表达增加(图5A). 原代肝细胞分离物的纯度通过白蛋白的高表达和炎症细胞标记物[CD11b（单核细胞和巨噬细胞）、F4/80（巨噬细胞）、CD11c（树突状细胞）和胶质纤维酸性蛋白（星状细胞）的缺乏得到证实；参见支撑图2].

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NASH肝细胞中炎症小体上调。饱和脂肪酸（而非不饱和脂肪酸）诱导肝细胞和巨噬细胞系中NALP3 mRNA的表达。将C57Bl/6小鼠喂食MCD饮食或MCS饮食5周，并按照材料和方法部分所述分离原代肝细胞。（A） 测定IL-1β和NALP3炎性体复合体（包括NALP3、ASC、caspase-1和pannexin-1）的肝细胞mRNA折叠变化。（B） 血清内毒素数据以平均值和标准误差表示（每组4至6只小鼠）。（C） 将用作肝细胞原型的Hepa1-6细胞和用作巨噬细胞原型的（D）RAW巨噬细胞暴露于饱和FA PA（0.165或0.33 mM）或不饱和FA，如油酸（0.33或0.66 mM）和亚油酸（0.3或0.66 m M）。用qPCR分析NALP3 mRNA的表达*P（P）与对照组相比，<0.05。

FAs诱导肝细胞炎症激活及对LPS诱导的IL-1β分泌的敏感性

循环FA和肠源性内毒素（LPS）都有助于NASH的发病。1–三,9我们发现脂肪性肝炎小鼠的血清内毒素水平升高，这表明肠道衍生LPS（TLR4配体）存在于NASH模型中(图5B). 我们还发现，MCD饮食和HFD饮食都会导致显著的脂肪变性，表现为肝甘油三酯水平升高(图1E和​和2E第二版).

考虑到脂肪肝炎症小体成分的表达升高(图1和​和2）2)这个过程发生在肝细胞中(图4)接下来，我们测试了FAs和LPS对肝细胞炎症小体表达的影响。一个在体外治疗表明，PA（一种饱和脂肪酸）诱导两种Hepa1-6细胞（用作肝细胞原型；图5C)和RAW巨噬细胞（用作肝巨噬细胞的原型；图5D). 相反，不饱和脂肪酸是油酸(图5D)和亚油酸(图5E)未能增加Hepa1-6细胞或RAW巨噬细胞中NALP3的mRNA表达。这表明构成性炎症组分的表达仅由饱和FA激活。

基于对细胞系的这种新观察，我们试图在原代肝细胞中验证结果。用PA和/或LPS处理小鼠原代肝细胞（PA预处理18小时后再进行LPS）。PA或LPS单独上调肝细胞NALP3 mRNA表达(P（P）< 0.01;图6A)PA诱导IL-1β蛋白分泌适度增加(图6B). 在PA预处理后LPS刺激的肝细胞中，IL-1β的水平显著升高，并且早期生成(P（P）<0.001），与单独接受PA或LPS治疗的肝细胞相比，这表明肝细胞存在致敏性(图6B).

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FAs在体外诱导肝细胞炎症小体激活并对LPS诱导的IL-1β分泌物敏感，这些分泌物涉及炎症小体依赖性（caspase-1）和炎症小体诱导依赖性（caspase-8依赖性）通路。（A） 用PA（0.33 mM）和/或LPS（1000 ng/mL）处理正常啮齿动物饮食的C57Bl/6小鼠分离的肝细胞6小时，并用qPCR测定NALP3 mRNA水平。（B） 在暴露于PA（0.33 mM）、LPS（1000µg/mL）或两者中2、6或18小时后，用酶联免疫吸附试验测定肝细胞上清液中的IL-1β蛋白水平。用酶活性测定法测定（C）炎症caspase-1和（D）凋亡caspase-8的激活*P（P）与对照组相比，<0.05。

总之，这些结果表明饱和的FA-PA使炎症小体对LPS诱导的肝细胞IL-1β释放敏感。

肝细胞中IL-1β的产生以炎症小体依赖性（Caspase-1）和炎症小体非依赖性（Caspase-8–De-pendent）方式发生

为了进一步评估炎症小体在PA和LPS诱导肝细胞IL-1β中的作用，我们检测了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的激活，这导致45-kDa前半胱氨酸蛋白酶-1分裂为其酶活性形式，即p20和两个p10亚基的异二聚体。10我们发现PA并没有启动caspase-1的裂解，而PA预处理后再进行LPS刺激会导致肝细胞中caspase-1的显著激活(图6C). 这种caspase-1激活模式反映了PA预处理和LPS刺激后IL-1β的释放(图6B)这表明肝细胞中功能性caspase-1的激活需要来自饱和FA和LPS的信号。

PA单独诱导IL-1β分泌的观察(图6B)由于缺乏caspase-1激活的广泛证据，我们不得不评估肝细胞中IL-1裂解的替代机制。虽然前IL-1β的裂解主要是炎症小体介导的caspase-1激活的结果，但也可以被caspase-8裂解。19事实上，我们发现PA20,21（但不是LPS）导致caspase-8活化，更重要的是，PA和LPS的结合并没有增加caspase-8.活化。这些结果表明caspase-8可能参与PA处理的肝细胞中IL-1β的裂解(图6D).

PA处理的肝细胞在LMNC中传递危险信号并诱导炎症激活

除了IL-1的裂解外，胱天蛋白酶-8在细胞凋亡中也被诱导。22,23PA激活caspase-8的观察(图6D)以及先前关于饱和脂肪酸诱导肝细胞凋亡的报道21–23促使我们评估NASH中炎症小体激活和细胞死亡之间的机制联系(图6D和​和7A）。第7章). PA治疗后肝细胞LDH释放增加表明诱导了细胞死亡(图7A). 我们确定PA上调NALP3和IL-1βmRNA是caspase依赖性的，因为在肝细胞中添加胰蛋白酶抑制剂ZVAD可以阻止这些事件的发生(图7B、C). 该观察结果还表明，凋亡肝细胞中产生的损伤相关分子而非PA本身可能有助于炎症小体的激活。

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PA处理的肝细胞在LMNC中传递危险信号并诱导炎症小体激活。（A） 在存在或不存在胰蛋白酶抑制剂ZVAD（40µM）的情况下，用PA（0.33 mM）或LPS（1000 ng/mL）处理C57Bl/6小鼠在正常啮齿动物饮食中分离的肝细胞。测定LDH释放作为细胞死亡的标志。用qPCR分析肝细胞（B）NALP3和（C）IL-1βmRNA折叠变化。用PA处理肝细胞上清液6小时，然后在没有PA的新鲜培养基中培养，将其转移到LMNC。分析（D）NALP3和（E）IL-1β的mRNA表达*P（P）与对照组相比，<0.05。

为了进一步评估肝细胞源性损伤相关分子在炎症小体激活中的作用以及肝细胞和单核细胞之间的潜在串扰，我们测试了PA处理的肝细胞是否可以诱导炎症细胞中的炎症小体活化。用PA处理肝细胞6小时，然后在没有PA的新鲜培养基中培养。我们发现，这些来自PA处理的肝细胞的无PA上清液诱导NALP3上调(图7D)和IL-1βmRNA(图7E)在LMNC中；这表明FA暴露的肝细胞可以将激活转移到周围的免疫细胞。肝细胞衍生危险信号向单核细胞的传递依赖于肝细胞中caspase的激活；当ZVAD与PA一起添加到肝细胞时，肝细胞上清液缺乏LMNC激活，这表明了这一点(图7D、E).

这些结果表明，肝细胞是FA的第一靶点，并产生炎性体介导的危险信号，进而以半胱氨酸蛋白酶依赖的方式激活巨噬细胞。

讨论

NASH脂肪变性和炎症的发病机制与多种机制有关，三如氧化应激、肝细胞线粒体损伤和肠源性LPS。7–9炎症是对细胞损伤和病原体的反应，分别由内源性和外源性危险信号触发。炎症小体的受体组分NALPs感知内源性危险信号，这些信号上调炎症小体，炎症小体是一种参与caspase-1介导的IL-1裂解的多蛋白复合物。炎症激活通常是通过外源或内源性危险信号通过TLR激活两种信号的结果。10

在这里，我们报告了一些与炎症小体激活在NASH中的新作用有关的发现。首先，我们描述了在NASH小鼠模型和人类肝脏中NALP3炎性体成分（包括NALP3、ASC和前caspase-1）的上调，并且我们证明了通过caspase-1激活和IL-1β产生的功能激活。我们的数据还表明炎症小体激活发生在脂肪性肝炎中，而不是在小鼠的早期脂肪变性中。其次，我们报告称，尽管循环内毒素水平的增加可能有助于炎症小体的激活，但外源性LPS可以增强脂肪性肝炎中炎症小体激活和IL-1β的分泌。第三，我们首次证明炎症小体激活和IL-1β分泌发生在NASH分离的肝细胞中。我们揭示了炎症小体激活的机制，并表明饱和脂肪酸（但不是不饱和脂肪酸）通过TLR4激活的第二次刺激增加炎症小体的表达并使肝细胞对IL-1β的释放敏感。我们的新数据表明，FA不仅上调炎症小体，还诱导肝细胞凋亡和危险信号的释放。最后，我们首次报道了来自FA暴露的肝细胞的危险信号在LMNC中诱导炎症小体激活，并证明了NASH中受损肝细胞和炎症细胞之间的串扰(图8).

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NASH炎症小体激活概述。

NALP3和NALP1在初级免疫细胞和其他细胞类型（包括上皮细胞、神经元和性腺细胞）中高度表达。24这里我们报告肝细胞表达NALPs。我们发现肝细胞表达衔接分子ASC和整个功能性炎症小体机器，并且能够产生IL-1β。

阐明导致NASH炎症小体表达和功能增加的触发因素具有新的重要性。FFA可以被认为是内源性危险分子，并诱导炎症信号转导和激活核因子κB和c-Jun N末端激酶-激活蛋白1通路，从而产生细胞因子和趋化因子。25,26虽然TLR检测细胞表面或内质网管腔中的配体，27NLR是细胞内细胞质（NALP3）或核（NALP1）传感器。24我们发现饱和脂肪酸可诱导肝细胞中前IL-1β和NALP3的上调。据报道，在MCD饮食诱导的小鼠中，FFA水平增加，28HFD诱导，29或瘦素缺乏引起的脂肪性肝炎30以及患有脂肪变性或脂肪性肝炎的人类NAFLD患者。4,5虽然一些报告已经评估了动物模型中的脂肪酸分布以及饱和和不饱和脂肪酸的比率28–30在NASH患者的血浆中，4,5肝脏或血清中FA成分的变化是否与脂肪变性或脂肪性肝炎相关尚待确定。我们推测NASH中饱和FA可能有利于炎症小体激活，而单纯脂肪变性中不同成分的FFA可能不会触发此类事件。这些差异可能会因其他信号（如LPS或受损肝细胞的危险信号）的存在而进一步放大。

越来越多的证据表明，先天性免疫途径在代谢综合征中被激活，在NASH的发病机制中起着至关重要的作用。31已观察到TLR4配体LPS的血浆水平升高，对LPS诱导的肝损伤的敏感性增强。7–9我们发现脂肪性肝炎小鼠的血清内毒素水平升高，这表明存在外源性TLR配体。我们和其他人已经证明TLR4缺乏可以预防实验性NASH。9,32外源性LPS进一步增加脂肪性肝炎患者肝脏中IL-1β水平和炎性体表达；这表明脂肪肝已为脂多糖诱导的炎症小体激活做好准备。这一新的观察结果补充了先前的报告，这些报告表明脂肪肝对脂多糖诱导的TNF-α生成和脂多糖导致的肝损伤敏感。9TLR4缺乏和用益生菌调节TLR4通路改变肠道菌群并抑制TLR相关反应可改善NASH的肝脏损伤和炎症。9,32更重要的是，我们发现炎症小体功能增强，这表现为前半胱天冬酶-1的裂解和IL-1的生成增加，以及炎症小体在NASH模型中的表达增加。

我们还证明饱和脂肪酸有助于LPS诱导肝细胞分泌IL-1β的增敏作用。FAs对炎症小体的影响是直接的还是间接的，是通过FFA代谢的中间产物还是通过FFA诱导的细胞死亡发生的，尚待确定33以及DAMP分子的释放。然而，我们发现胰蛋白酶抑制剂ZVAD可以阻止FFA诱导的炎症小体上调，这表明脂肪毒性和内源性危险分子在这一过程中发挥了作用。34,35饱和脂肪酸（如PA）毒性更大，更容易发生凋亡，而单不饱和脂肪酸，如油酸，则会产生脂肪，并能防止细胞培养中饱和脂肪酸的凋亡作用。22PA和LPS共同导致炎症小体和caspase-1激活。相反，PA仅诱导caspase-8激活，而未检测到炎症小体激活，这表明caspase-8负责PA处理的肝细胞中IL-1β的裂解。Caspase-8已被证明是巨噬细胞对TLR3和TLR4刺激时裂解前IL-1β的替代方案。19在Fas配体诱导的腹膜免疫细胞凋亡中，也报道了IL-1β的caspase-1非依赖性释放。36在这里，我们证明了饱和FA处理后受损肝细胞释放的危险信号会触发LMNC中的炎症小体激活。

先前的研究表明，NASH中LPS可增强炎症反应和肝损伤。9除了肠源性LPS外，来自肝细胞的其他危险信号水平也可能增加。短暂的ATP预刺激可导致巨噬细胞内LPS诱导的caspase-1激活和IL-1β分泌。37我们的数据表明，脂肪肝对脂多糖诱导的炎症小体激活和IL-1β分泌具有敏感性；然后，IL-1β可以通过IL-1受体进一步放大炎症反应。最后，我们不能排除这样一种观点，即除了脂肪酸外，炎症小体的替代激活物，如ATP、尿酸单钠晶体和焦磷酸钙，也可能有助于脂肪肝的炎症小体激活。

总之，我们认为饱和脂肪酸流入肝脏的增加会导致炎症小体激活、IL-1β裂解和炎症。我们已经证明饱和脂肪酸可诱导肝细胞凋亡和caspase-8的激活，从而触发危险分子的释放。总之，这些事件与循环内毒素协同作用，导致肝细胞中的炎症小体激活，通过激活LMNC创建炎症放大回路，并诱导肝损伤。我们的发现揭示了NAFLD/NASH的新机制，并提出了潜在的治疗策略。

补充材料

支撑图1

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支撑图2

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支撑图3

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支持信息表

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确认

作者非常感谢Jason Kim的合作，他慷慨地提供了HFD喂养小鼠的肝脏样本。

这项工作得到了DK075635（Gyongyi Szabo）拨款的支持，还使用了糖尿病内分泌研究中心拨款DK32520支持的核心资源（Gyong yi Szabo是马萨诸塞大学糖尿病内分泌研究院的成员）。

缩写

ASC公司凋亡相关斑点样CARD-结构域蛋白
列车自动防护系统三磷酸腺苷
DAMP公司危险关联分子模式
FA公司脂肪酸
金融流量账户游离脂肪酸
丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒
高频驱动高脂饮食
伊利诺伊州白细胞介素
乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶
LMNC公司肝单核细胞
液化石油气脂多糖
MCD公司蛋氨酸胆碱缺乏
MCS公司蛋氨酸胆碱补充
信使核糖核酸信使RNA
北美自由贸易区非酒精性脂肪肝
NALP公司NACHT、LRR和PYD结构域–包含蛋白质
美国国立卫生研究院非酒精性脂肪性肝炎
荷兰卢比NOD样受体
PA公司棕榈酸
定量PCR定量聚合酶链反应
TLR公司toll样受体
肿瘤坏死因子-α肿瘤坏死因子α
ZVAD公司羧苯氧基-戊基-丙基-天冬氨酰-[O-甲基]-氟甲基酮

脚注

潜在利益冲突：无需报告。

其他支持信息可以在本文的在线版本中找到。

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