Trk受体EGF反式激活调节新生皮层神经元的迁移

EGF激活皮层前体Trk受体

为了确定这些观察的基础，我们从E12前脑分离出神经元细胞²¹这些细胞培养物主要由Pax6和nestin阳性的放射状胶质样前体细胞组成，这些前体细胞形成神经球，可以通过层粘连蛋白上的镀层进行分化(补充图2). 这些Pax6和巢蛋白阳性培养物也表达相对较高水平的TrkB(图2a、b). 将神经球源性细胞贴于层粘连蛋白后的前2天，MAP2阳性神经元的百分比较低（12.4±3.2%，平均值±标准差。；图2c和补充图2). 然而，这些细胞中的大多数表达nestin(补充图2)和Pax6（72.5±5.1%，平均值±标准差。；图2c). 因此，它们类似于从E11前脑（74.4±4.6%Pax6）分离的新制备的皮层细胞⁺和9.2±3.3%MAP2⁺，平均值±标准误差。；图2c). 由Trk受体的PLCγ结合位点的磷酸特异性抗体测定的Trk受体磷酸化水平很低，当这些细胞被BDNF刺激时，只观察到低水平的激活(图2a、b). 同样，当MAP2阳性的完全分化神经元的百分比增加到75%以上（E12，57.0±5.1%Pax6⁺和37.7±3.4%MAP2⁺; E15，7.5±3.0%Pax6⁺和78.9±3.5%MAP2⁺; 平均值±标准误差。；图2c).

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图2

EGF是皮层前体细胞TrkB的主要激活物。(一)EGF而非BDNF处理导致培养的前脑皮层前体细胞中Trk（Trk-PLCγ）和Erk1/2磷酸化。为了量化Trk的磷酸化水平，我们分析了免疫印迹的密度扫描。未刺激细胞中pTrk的水平定义为100%（平均值±标准偏差，一个样本t吨测试）。(b条)EGF处理导致培养的巢蛋白阳性前脑皮质前体细胞中pTrk-PLCγ免疫反应性快速升高。测量的强度以任意单位±s.e.m表示(*P（P）<0.001，单因素方差分析）。比例尺代表25μm。(c（c）)从神经球培养物中分离的皮层前体细胞（E12）主要由Pax6阳性前体组成，并显示出对TrkB磷酸化的强烈诱导，但对BDNF或NT-3没有实质性反应。在直接培养24小时的E11前脑小泡急性分离的皮层前体细胞中观察到对EGF、BDNF和NT-3的类似反应。生长24小时的来自E12前脑的急性电镀原代细胞显示出对EGF的强烈反应，也对BDNF及NT-3的强烈反应。在E15，对BDNF和NT-3的反应占主导地位，尽管EGF处理后仍可以检测到TrkB磷酸化。从E11到E15，Pax6阳性前体细胞的百分比下降，而MAP2阳性神经元的百分比增加。比例尺代表25μm。(d日)EGFR和TrkB在E13前脑的共表达。比例尺代表150μm（顶部面板）和50μm（下部面板）。有关全长斑点，请参见补充图10.

E11初级皮层前体细胞和来自E12前脑神经球的前体细胞对BDNF或NT-3的反应相对较低，这促使我们研究以前被确定为TrkB反式激活因子的其他效应器的作用^22–24.糖皮质激素受体配体(补充图3a)与EGF相比，EGF在5分钟内介导TrkB磷酸化的高度上调（EGF 5分钟：178.3±12.1%，n个=10个独立实验，t吨=6.460，df=9，P（P）= 0.0001; EGF 120分钟：164.4±15.5%，n个=8个独立实验，t吨=4.145，df=7，P（P）= 0.0043; EGF 360分钟：101.3±4.6%，n个=6个独立实验，t吨=0.2886，df=5，P（P）= 0.7845; 平均值±标准偏差，一个样品t吨测试；图2a、c). 这种对EGF的反应没有被BDNF-中和抗体阻断(补充图3b)在10ngml的作用条件下⁻¹BDNF在原代神经元培养中被阻断²³如Erk1/2磷酸化所示，EGF治疗导致MAPK通路的激活时间延长（EGF 5min:195.8±21.5%，n个=5个独立实验，t吨=4.467，df=4，P（P）= 0.0111; EGF 120分钟：196.7±31.3%，n个＝4个独立实验，t吨=3.089，df=3，P（P）= 0.0538; EGF 360分钟：130.0±41.6%，n个=3个独立实验，t吨=0.7222，df=2，P（P）= 0.5452; 平均值±s.e.m.，一个样品t吨测试；图2a). 用染色培养的皮层前体的抗体也可以看到TrkB的激活。与BDNF或NT-3相比，EGF处理在5分钟内导致培养的巢蛋白阳性皮层前体细胞pTrk免疫反应性的大量上调（pTrk-PLCγ：对照，15.6±0.8；EGF，93.7±4.3；BDNF，18.0±0.9；NT-3，21.2±1.2任意单位±s.e.m。；F类= 274.1,R（右）²= 0.9904,n个= 3; ≥每个条件和实验55个细胞；图2b). 在胚胎前脑新制备的培养物中，BDNF和NT-3的反应都发生在随后的E12(图2c)当培养物中MAP2阳性神经元的百分比增加时，表明表达nestin和Pax6的E10和E11之间的早期皮质前体细胞对EGF的反应比对BDNF或NT-3的反应更强烈。

Src激酶介导Trk受体EGFR反式激活

先前的数据表明，EGFR在心室下区的Pax6和巢蛋白阳性前体细胞中表达较高，并且当前体细胞开始作为早期神经元迁移到皮质板时，在分裂离开心室区和SVZ的前体细胞时，EGFR的表达是不对称的^25–27与这些结果一致，我们在E13前脑的神经细胞中发现TrkB和EGFR高度共表达(图2d).

EGF在新制备的皮层前体细胞中对TrkB的反式激活(图2c)来自神经球的巢蛋白阳性前体细胞(补充图2)不仅用PLCγ位点抗体观察到，而且用识别SHC/FRS2结合域的抗体观察到(图3)TrkB和其他Trk受体（pTrk-PLCγ：5分钟，1104.0±234.2%，15分钟，1115.0±258.4%，45分钟，1268.0±317.9%，90分钟，1195.0±238.7%，180分钟，623.5±52.6%，300分钟，154.0±19.7%；pTrk-Shc：5分钟、374.6±98.9%，15分钟、318.0±98.5%，45分钟、328。2±108.6%，90分钟，261.6±102.4%，180分钟，127.1±11.0%，300分钟，95.6±7.1%；平均值±标准误差。；图3a). 同时，长时间观察到Akt和Erk1/2的激活（pAkt:5分钟、284.5±17.4%、15分钟、372.3±17.3%、45分钟、362.1±17.4%，90分钟、387.0±28.7%、180分钟、476.1±39.4%、300分钟、278.9±15.1%；pErk1/2：5分钟，1116.0±104.7%，15分钟，1112.0±84.1%，45分钟，1141.0±84.2%，90分钟，1057.0±81.5%，180分钟，953.9±88.9%，300分钟，696.2±53.9%；平均值±标准误差。；图3a). 为了确认pTrk抗体识别的条带的身份，我们将HA标记的TrkB转染到培养的皮层前体细胞中，并用HA抗体免疫沉淀后测定磷酸化。在细胞裂解物的western blot中，HA抗体只识别在130kDa迁移的带(图3b). 用SHC位点特异性抗体检测TrkB的激活(图3a，b)和一种磷酸酪氨酸抗体(图3b).

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图3

EGFR信号对TrkB转录激活的表征。(一)通过EGF处理在PLCγ-和SHC结合结构域的Trk受体的磷酸化。激活与Akt（Ser473）和Erk1/2的磷酸化相关。通过测量三个独立实验的密度免疫印迹扫描强度，定量Trk、Erk1/2和Akt的时间依赖性磷酸化。用负荷控制标准化后，未处理细胞的值被设置为100%。数据表示平均值±标准误差(b条)Src家族激酶抑制剂PP1（1μM）和PP2（100 nM）以及EGFR抑制剂PD153035（100 nM）阻断了EGFR信号对TrkB的反式激活。(c（c）)用GFP控制慢病毒、dnSRC、dnFYN慢病毒或dnSRC和dnFYN组合处理的细胞培养物的Western blot分析。在dnSRC-和dnFYN处理的细胞中，Trk-PLCγ免疫反应带显著减少。下面的面板显示了来自三个独立实验的密度免疫印迹扫描的定量分析(*P（P）<0.05，平均值±标准偏差，一个样本t吨测试）。(d日)使用慢病毒将dnSRC-DsRed作为融合蛋白过度表达。与相同培养物中未感染细胞相比，EGF处理后阳性感染细胞的pTrk-PLCγ免疫反应性降低。对感染了编码dnFYN-GFP融合蛋白慢病毒的细胞进行了类似的观察。箭头指向阳性感染细胞。比例尺代表10μm。有关全长斑点，请参见补充图10.n.t.，未转染；n.inf，未感染；不另作说明，不重要(P（P）> 0.05).

pTrk-SHC和pTrk-PLCγ抗体都识别出在170kDa左右迁移的更大分子量带。为了确定该条带是否代表TrkB，我们对TrkB进行了shRNA-介导的慢病毒敲除，这导致在130和170 kDa时TrkB和pTrk-PLCγ条带的强度降低(补充图4). pTrk-SHC抗体也观察到类似的减少，这些抗体对TrkB没有特异性，但也识别激活的TrkA和TrkC(补充图4). 为了排除该条带代表激活的EGFR的可能性，我们用EGFR抗体进行了下拉实验。与EGFR抗体相比，使用pTrk-PLCγ抗体在洗脱液中未检测到信号，EGFR抗体显示沉淀中有可检测的带(图4a). 磷酸化EGFR的存在通过用磷酸酪氨酸抗体探测来控制。鉴于shRNA-介导的TrkB敲除并没有完全消除代表170和130 kDa处TrkB磷酸化形式的带，我们分析了TrkB蛋白完全缺失的小鼠神经前体细胞²⁸130和170 kDa条带仍然可以用pTrk-PLCγ抗体检测到(补充图5a、b)在一些实验中(补充图4a)识别出的谱带强度更高。然后我们观察到TrkC免疫反应性和mRNA水平(补充图5)TrkB敲除的神经前体细胞中增加(补充图5a、c)表明TrkC也被pTrk-PLCγ抗体识别。鉴于细胞溶质PLCγ位点在Trk家族所有成员中高度保守，这并不意外。为了验证这一假设，我们设计了用于TrkC敲除的慢病毒shRNA构建体。在病毒感染72小时后，pTrk-PLCγ抗体识别的130和170kDa条带均高度减少，并且在病毒感染96小时后，用于TrkC敲除的shRNA结构的表达几乎消除了这些条带(补充图5a–c)表明pTrk-PLCγ抗体识别TrkC，但不识别其他酪氨酸激酶受体，包括EGFR。

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图4

pTrk-PLCγ抗体识别的170-kDa带的特征。(一)EGFR免疫沉淀后，用pTrk-PLCγ抗体检测沉淀中未检测到信号（左起第三个面板），表明pTrk-LCγ抗体与EGFR无交叉反应。带有磷酸酪氨酸和EGFR抗体的阳性对照显示，沉淀中存在EGFR，并在EGF刺激后激活。(b条)用pTrk-SHC抗体免疫沉淀后，当用pTrk-PLCγ抗体探测沉淀时，在沉淀中检测到170kDa和130kDa的两条带（左起第三个面板）。(c（c）)EGF处理的皮层前体细胞与PNGase F脱糖后，170-kDa Trk免疫反应带移到约145kDa。通常在细胞表面蛋白质中发现的其他裂解加工糖基侧链的脱糖基化酶无效。PNGase F的相对特异性表明，Trk受体在早期皮层神经前体细胞中严重N-糖基化。(d日)免疫染色显示TrkB位于未经处理的皮层前体细胞的细胞内。用衣霉素治疗后，在N-糖基化的第一步中特异性抑制N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸的转移，TrkB在细胞膜上被检测到。比例尺表示10μm（左）和3μm（右）。(e（电子）)用衣霉素处理皮层前体细胞12小时后，N-糖基化Trk的170-kDa带转移到130kDa。这种治疗也恢复了BDNF的反应性，表明衣霉素逆转了TrkB在细胞内室的滞留。

当识别TrkB和TrkC的pTrk-SHC抗体用于免疫沉淀时，在EGF刺激后，pTrk-PLCγ-免疫反应带均沉淀(图4b). 观察到130-kDa带和170-kDa带都与独立的TrkB抗体反应，但与EGFR抗体没有反应，这进一步证明170-kDa-带包括TrkB和TrkC，它们在添加EGF后被反式激活。

Src激酶抑制剂PP1（1μM）和PP2（100 nM）消除了激活，之前的研究发现，这些抑制剂具有特异性，足以阻断G蛋白偶联受体对Trk受体的反式激活^29,30(图3b). 通过使用c-Src（dnSRC）的显性负构念，证实了Src家族成员的参与³¹和Fyn（dnFYN）³²慢病毒基因转移实验(图3c、d). 两种结构的表达均导致pTrk-PLCγ免疫反应性显著降低（GFP对照，100%；dnSRC，63.3±8.7%，t吨=4.199，df=2，P（P）= 0.0523; dnFYN，53.2±12.8%，t吨=3.641，df=2，P（P）= 0.0679; dnSRC和dnFYN，48.1±7.7%，t吨=6.761，df=2，P（P）= 0.0212; PP1和PP2，10.6±4.2%，t吨=21.36，df=2，P（P）= 0.0022;n个=3个独立实验，一个样本t吨测试，），其与慢病毒的转导效率约40%相关，表明c-Src和Fyn对于EGF治疗后TrkB的反式激活是必要的。此外，EGFR信号的抑制剂³³完全消除培养的皮层前体细胞中TrkB的激活(图3b). 结合Src抑制剂实验的数据，这些结果表明c-Src和Fyn对于EGF处理后TrkB和TrkC的反式激活是必要的。

EGFR反式激活提高TrkB的细胞表面水平

为了研究EGF信号在早期E11皮层前体细胞或神经球衍生的皮层前体电池中激活TrkB和TrkC方面为什么比BDNF或NT-3更有效的细胞基础，我们首先研究了EGF治疗前后TrkB的亚细胞定位。未经处理的培养皮层前体细胞的TrkB染色局限于细胞内隔室(图4和​和5）。5). 这表明TrkB，也可能是TrkC，保留在这些早期皮质前体细胞的内质网和高尔基室中。为了找到这种保留的原因，我们研究了各种脱糖基化酶的作用，发现与肽N-糖苷酶F（PNGase F）孵育后，TrkB的高分子量带的大小变为145 kDa(图4c). 其他糖苷酶，包括β-1,4-半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。这些糖苷酶可裂解细胞表面暴露蛋白质中常见的加工糖基侧链³⁴，没有改变分子量。为了测试早期皮层前体细胞中发现的TrkB的高度N-糖基化是否影响其亚细胞分布，我们用衣霉素处理这些细胞12小时。这种治疗阻断了内质网中N-糖基化的第一步，导致TrkB的膜移位增强(图4d)在这些细胞中，TrkB的170-kDa形式转变为约130kDa(图4e). 当TrkB能够在这些条件下易位到细胞膜时，BDNF磷酸化了由糖基化减少引起的130kDa形式(图4e)，表示该波段反射TrkB。E11初级皮层前体或神经球衍生前体中TrkB的170-kDa形式中发现了高度的N-糖基化，也被发现与其他蛋白质的分选有关，例如闭塞素，到细胞膜顶端³⁵以及Na-K-ATP酶β1亚基的N-糖基化增加导致该蛋白分布到极化上皮细胞顶膜的比例增加³⁶因此，我们研究了通过EGFR信号激活N-高糖基化TrkB是否影响TrkB向细胞膜的转运。

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图5

TrkB在表皮生长因子作用下转移到皮层前体细胞的细胞表面。(一)TrkB免疫反应主要定位于培养的E12神经球源性皮质前体细胞的点样细胞内结构，并在EGF处理0.5分钟内转移到膜上。比例尺，3μm。(b条)高分辨率STED显微镜在未经处理的培养的E12神经前体细胞的囊泡状结构中鉴定出TrkB。EGF激发后，TrkB和pTrk-PLCγ的信号显示出向细胞表面样定位的快速移位。比例尺，3μm。(c（c）)细胞表面蛋白生物素化后的亲和素下拉鉴定了EGF处理后TrkB的快速细胞表面易位。同时用100 nM PD153035阻断EGFR，可降低细胞表面TrkB的量(*P（P）<0.05，三个独立实验的平均值±标准差，一个样本t吨测试；不另作说明，不重要）。(d日)TrkB主要在心室区和SVZ的神经前体细胞中的点状囊泡样结构中检测到，而其定位在皮质套区神经元中的细胞表面样分布更多。比例尺，50μm（顶部面板）和3μm（下部面板）。全长印迹补充图10.

在EGF处理的30 s内，细胞表面可检测到TrkB和pTrk免疫反应(图5a). 为了证实这一发现，我们进行了受激发射损耗（STED）显微镜检查(图5b). 在未经处理的皮层前体细胞中，STED显微镜仅显示出小泡状结构。EGF处理后，TrkB和pTrk的信号迅速从细胞内室移到细胞表面(图5b). 此外，对细胞表面蛋白生物素化的细胞进行亲和素下拉实验。同样，EGF处理导致细胞表面暴露的TrkB快速增加（178.3±20.4%，t吨=6.657，df=2，P（P）= 0.0218,n个=3个独立实验，一个样本t吨测试；图5c)EGFR抑制剂PD153035（120.5±19.2%，t吨=1.854，df=2，P（P）= 0.2049,n个=3个独立实验，一个样本t吨测试；图5c).

这种效应在生理上是相关的，因为从Egfr公司^−/−老鼠³⁷(补充图6a). 当细胞在EGF暴露后2 s立即固定时，使用pTrk-PLCγ抗体观察到细胞内TrkB的激活(补充图6b). 在EGF暴露后10 s，观察到TrkB移位到细胞膜(补充图6b)表明TrkB在细胞内的反式激活发生在转运到细胞表面之前。同样，对E13胚胎脑切片的共聚焦分析显示，心室区和SVZ中的大多数细胞在类似于囊泡和细胞内位置的细胞内部位表达TrkB，而已经到达皮质板的细胞在细胞表面显示出TrkB是一种相对连续的染色(图5d). 综上所述，这些数据表明，在发育中的皮层神经元中，TrkB的激活导致该受体从细胞内内质网样隔室转移到细胞表面，并且EGFR信号对开始迁移出皮层神经元的早期神经元中TrkB和TrkC的激活比内源性BDNF或NT-3更重要心室区和SVZ。

抗体和试剂

TrkB抗体（Santa Cruz，H-181，1:500）、TrkB（Millipore，#07-225，1:1000；BD Bioscience，#610101，1:500⁵¹，磷酸化-Trk-SHC（pTrkA^490日元，细胞信号传导，#9141，1:1000），TrkC（细胞信号传导，C44H5，1:1000），磷酸化Akt（Ser473，细胞信号传导，#9271，1:1000），Akt（细胞信号传导，#9272，1:1000），Erk1和Erk2（Santa Cruz，K23，1:1000），磷酸化-Erk1/2（Thr202/Tyr204，细胞信号传导，#9106，1:1000），绿色荧光蛋白（Santa Cruz，#sc-8334，1:2000），EGFR（Santa Cruz，#sc-03，#sc-81449，1:1000；R&D Systems，#AF1280，1:200），MAP2（Millipore，AB5622，1:1000），Doublecortin（DcX，Millipore，#AB2253，1:6000），Nestin（Millipose，rat-401，1:200，），GAPDH（Millibore，6C5，1:4000），Tuj1（Neuromics，#MO15013，1:1000，E7杂交瘤上清液，发育研究杂交瘤库，1:100），使用了Pax6（杂交瘤上清液，发育研究杂交瘤库，1:50）、HA-epitope（Covance，16B12，1:1000）、磷酸酪氨酸（Santa Cruz，PY99，1:100）和panCadherin（Abcam，CH-19，1:1000。荧光和过氧化物结合二级抗体来自Jackson ImmunoResearch Laboratories。Src家族激酶抑制剂PP1、PP2和EGFR抑制剂PD153035购自Calbiochem，蛋白酶抑制剂购自Roche Diagnostics，磷酸酶抑制剂和衣霉素购自Sigma，EGF和碱性FGF购自Cell Concepts。

皮层前体细胞培养

如前所述分离皮层前体细胞²¹用20 ng ml的bFGF和EGF培养⁻¹每个。脂质体2000（Invitrogen）用于转染。当细胞达到70-80%的融合时，提取bFGF和EGF，并将细胞培养24小时。在指定的时间内进行因子处理；用药物抑制剂进行1h的预处理或按照个别实验的指示进行。

蛋白质分离、免疫沉淀和蛋白质印迹

采集经过电镀的皮层前体，用冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，并用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在免疫沉淀缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，2 mM EDTA，2 mM-EGTA，10%甘油（vol/vol），0.1%NP-40（vol/vol），2 mMNaVO，50 mM NaF）中直接溶解。解剖的前脑在液氮中冷冻，在免疫沉淀缓冲液中均质，20800离心克在4°C下保持20分钟。使用Bio-Read蛋白质分析评估澄清上清液的蛋白质含量。我们使用200μg总蛋白免疫沉淀皮质前体细胞中过度表达的HA-TrkB，使用250μg总蛋白质免疫沉淀脑组织中内源性TrkB。蛋白质裂解物在4°C下用蛋白质-G–琼脂糖（罗氏）预处理1 h。使用1–4μg一级抗体（HA或TrkB抗体）在4℃下过夜，然后在4℃与蛋白-g琼脂糖（罗氏）孵育2 h，进行蛋白质下拉。用免疫沉淀缓冲液将沉淀的复合物洗涤四次，然后再悬浮在SDS-PAGE加载缓冲液中。对样品进行SDS PAGE和免疫印迹²¹.

皮质前体细胞慢病毒感染

为了将DNA构建物慢病毒转导到皮层前体细胞中，使用了来自Clontech的Lenti-X慢病毒表达系统。对于荧光标记的显性负性c-Src的过度表达，来自c-Src（K296R/Y528F）的突变cDNA³¹将含有表达载体（Millipore）的基因亚克隆到pLV-X-DsRed-Monomer-C1（Clontech）中。通过亚克隆Fyn（K299M）获得显性负性Fyn³²将片段编码为pLV-X-AcGFP-N1。使用GFP控制病毒。GFP和DsRed染色被用作细胞培养物同等感染率的对照。用EGF对细胞进行脉冲处理，并进行western blot或免疫荧光分析。

shRNA对皮层前体细胞TrkB和TrkC的敲除

为了敲低皮层前体细胞中的TrkB和TrkC，我们选择^13,52TrkB的靶序列5′-TTGGGATTCCGGCTTAA-3′，TrkC1的靶序列为5′-GCAGAGACTGAGATC AA-3′和TrkC2的靶序列是5′-GGACGAGAGAACCTTC-3′，并将其克隆到pSIH-H1 shRNA载体（系统生物科学）中：shTrkB top-oligo，shTrkC1顶寡头（5′-GATCCGCAGCAAGACT GAGATCCTGTCAGATTGATCTCTTGCTTTTTTG-3′），shTrkC2顶寡头。分离的皮层前体细胞在悬浮液中被感染，在96小时后被镀上并收获。细胞裂解产物通过western blot分析进行分析。

皮层前体细胞TrkB糖基化分析

体外根据制造商的说明，使用Sigma的E-DEGLY酶解试剂盒对来自皮层前体细胞的蛋白裂解物进行脱糖。简言之，将15μg总蛋白在37°C下用所提供的去糖基化酶进行酶消化3小时，并如上所述通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。以1μg ml的浓度对皮层前体进行12 h的衣霉素（Sigma）治疗⁻¹.

细胞表面蛋白质的生物素化

细胞生长在100毫米的培养皿中，用冰镇HBSS（PAA Laboratories）洗涤三次，并用皮尔斯表面蛋白分离试剂盒中的8毫升生物素标记溶液在4°C下培养30分钟。生物素化反应终止后，用冰镇Tris缓冲盐水（TBS）清洗细胞三次。EGF处理5分钟，PD153035预处理60分钟。在100μl免疫沉淀缓冲液（25mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，2mM EDTA，2mM EGTA，10%甘油，0.1%NP-40）中收获细胞。根据制造商的说明，将清除的上清液用于蛋白质分离和洗脱。用标准SDS-PAGE技术分析洗脱样品。使用AIDA软件（Raytest）定量TrkB免疫反应带的密度。将数值标准化为pan-cadherin的强度。未经EGF处理的未刺激细胞的数值在每个单独实验中设置为参考点（100%）。一个样本t吨检验用于统计分析。

皮层前体细胞的免疫细胞化学

将作为神经球培养物保存的皮层前体细胞研磨并镀在涂有聚-33-鸟氨酸和层粘连蛋白1的10-mm玻璃盖玻片上，每个盖玻片的密度为3000个细胞。在给定的时间点，用4%多聚甲醛（wt/vol）将细胞固定在0.15 M磷酸盐缓冲液中，pH值为7.4，温度为20–25°C，持续10分钟。用PBS冲洗细胞三次，用封闭缓冲液（7.5%正常血清（vol/vol）、1%BSA（wt/vol），0.5%吐温-20（vol/vol）和0.05%Triton X-100（vol/vo）在PBS中封闭并渗透1小时。初级抗体在4°C的封闭缓冲液中培养过夜。用PBS冲洗细胞三次，并用适当的荧光结合二级抗体和核染料4′，6′-二氨基-2-′-苯吲哚盐酸盐（DAPI，Sigma，最终浓度为5μg ml⁻¹)在20–25°C下保持1小时。细胞用PBS清洗三次，安装在MOWIOL的玻璃载玻片上，并保存在4°C下。

冷冻组织切片的免疫组织化学

对于冷冻切片，将胚胎在4°C、pH 7.4的0.15M磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛（wt/vol）中固定过夜，并在PBS中洗涤三次，然后在4°C下将组织在30%蔗糖（wt/vol）中脱水过夜。将头部埋入OCT化合物（Tissue-Tek）中，并在液氮冷却的2-甲基丁烷中冷冻。我们用冷冻器（徕卡）制备了25μm冠状冰冻切片。将带有冷冻切片的玻璃载玻片储存在−20°C下。用5%的正常血清和0.3%的Triton X-100在TBS中在20–25°C下风干30分钟并在20–250°C下封闭1小时，对切片进行免疫染色。在4°C的封闭缓冲液中在加湿室中过夜，用一级抗体进行标记。用TBS清洗切片三次，持续5分钟，并用适当的荧光结合二级抗体和最终浓度为5μg ml的核染料DAPI（Sigma）孵育⁻¹)在20–25°C下保持1小时。切片用TBS清洗三次5分钟，并用MOWIOL安装。

量化体内合并的BrdU

怀孕雌性小鼠腹腔内注射无菌0.9%氯化钠中的BrdU（100 mg/g体重，Sigma）。在E16处解剖胚胎，并按照上述方法处理25μm冷冻组织切片。在20–25°C下用2 M HCl孵育1 h后，用pH值为8.5的0.1 M硼酸盐缓冲液孵育切片，用PBS洗涤三次5 min，并在20–250°C下使用7.5%的驴血清（vol/vol）和0.3%的Triton X-100在PBS中封闭1 h。BrdU抗体（Abcam ab6326，rat，1:200 in blocking solution）在4°C下孵育过夜，然后在20–25°C下培养次级Cy3-偶联抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories#112-165-003，1:400，封闭溶液）1小时。细胞核用DAPI染色（Sigma，5μg ml⁻¹). 切片用PBS清洗三次，用MOWIOL贴装，在115×115μm的显微照相面积内计数BrdU阳性细胞。每四个部分进行计数，每个半球有两个位置匹配的区域（每个基因型3只动物，每个基因型12张图像）。使用Student’s对细胞总数进行统计分析t吨测试，并通过单因素方差分析和Bonferroni后测比较V层BrdU阳性细胞与皮质板和边缘区的相对分布。

体外迁移分析

用前面描述的方法研究了皮层前体细胞迁移^30,31有微小的变化。涂有聚-33-鸟嘌呤和Lamin1的20mm玻璃盖玻片接受了由EGF交替条纹组成的额外基质地毯（100 ng/ml⁻¹)，牛血清白蛋白（100纳克毫升⁻¹)和/或BDNF（20 ng ml⁻¹)，第一组条纹含有荧光结合IgG（2.5μg ml⁻¹)，如中所述图6皮质前体细胞以每100μl 2000个细胞的密度进行培养。在给定的时间点，细胞被固定，进行免疫细胞化学处理，并分别在第一组和第二组条纹上计数。每个实验和条件至少分析150个细胞。将三个独立实验的结果汇总在一起。

条纹试验中不对称pTrk-PLCγ免疫反应的定量

表皮生长因子条纹30μm范围内皮质细胞中激活的TrkB在体外通过设置一个与穿过细胞核的EGF条带平行的边界来量化迁移分析，从而确定避开EGF的区域和朝向EGF的面积。在这两个区域，测量并比较pTrk-PLCγ强度。使用Student’st吨测试。

定量实时逆转录酶PCR

使用RNeasy Plus-Mini-Kit（Qiagen）按照标准方案从培养的皮层前体细胞中分离RNA。定量PCR反应在Lightcycler 1.5（Roche）上进行，使用FastStart DNA主控SYBR green1试剂，使用动力学PCR循环。先前描述了计算效率控制的相对表达水平的离线分析⁵³用Oligo 6.0软件（MedProbe）选择内含子跨度引物。反应在20μl体积的玻璃毛细管中进行。引物和PCR靶点：Ntrk3号机组（410倍，5′-TGATCAAGAGTA-TGGTCGC-3′；1602转，5′-TTGTGACCCTGACGGAAGT-3′；211 bp）。四个部分的动力学循环条件：Ntrk3号机组（95°C，0 s，59°C，5 s，72°C，9 s，86°C，5s），3 mM氯化镁₂，30 pmol底漆，效率=2.00；Gapdh公司（NM_008084），205为5′-GCAAA-TTCAACGGCACA-3′；337-版次5′-CACAGTAGACTCCACG AC-3′；141个基点。四个部分的动力学循环条件：Gapdh公司（95°C，0 s，59°C，5 s，72°C，6 s，83°C，5s）3 mM氯化镁₂，30 pmol底漆，效率：2.00；嗯：252U18表示5′-AGTGGCA-CCCGTAAGAG-3′；350L20-版次5′-GTCTCCGTGGGACATAG-3′；118个基点。四个部分的动力学循环条件：嗯（95°C，0 s，59°C，5 s，72°C，6 s，85°C，5 s）4 mM氯化镁₂，30 pmol底漆，效率：2.00。

共焦显微镜

使用徕卡SP2系统，通过徕卡共焦软件获得数字显微照片。线性对比度和亮度增强同样适用于相应的图片组。图片是用Adobe Photoshop 7.0整理和标记的。

我们要感谢M.Sibilia（维也纳医科大学）提供Egfr公司^−/−小鼠，Y.A.Barde（巴塞尔大学）负责HA-TrkB构建，K.Walter提供了卓越的技术援助，W.Fouquet和S.Sigrist在STED显微镜方面提供了帮助。这项工作得到了德国联邦卫生研究院（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的支持，获得了SFB 487、C4（N.O.）和SFB 581、B4（D.P.和M.S.）、ForNeuroCell（M.S。