Losartan Decreases Cardiac Muscle Fibrosis and Improves Cardiac Function in Dystrophin-Deficient Mdx Mice

Christopher F. Spurney; Arpana Sali; Alfredo D. Guerron; Micaela Iantorno; Qing Yu; Heather Gordish-Dressman; Sree Rayavarapu; Jack van der Meulen; Eric P. Hoffman; Kanneboyina Nagaraju

doi:10.1177/1074248410381757

心血管药物治疗杂志。作者手稿；可在PMC 2014年8月28日获得。

以最终编辑形式发布为：

心血管药理学杂志。2011年3月；16(1): 87–95.

数字对象标识：10.1177/1074248410381757

预防性维修识别码：项目经理4147941

NIHMSID公司：美国国立卫生研究院289794

PMID：21304057

氯沙坦减轻肌营养不良Mdx小鼠心肌纤维化并改善心脏功能

克里斯托弗·斯普尼，医学博士，^1,² Arpana Sali公司，理学硕士，² 阿尔弗雷多·D·盖伦，医学博士，² 米凯拉·兰托诺，医学博士，² 青玉、医学博士、博士，² 希瑟·戈迪斯·德雷斯曼，博士，² Sree Rayavarapu公司、DVM、，² 杰克·范德梅伦，博士，² 埃里克·霍夫曼，博士，²和Kanneboyina Nagaraju公司、DVM、博士²

作者信息版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

最近的研究表明，长期服用氯沙坦（一种血管紧张素II I型受体拮抗剂）可以改善营养不良蛋白缺乏型mdx小鼠的骨骼肌功能。在本研究中，C57BL/10ScSn-Dmd^{中密度纤维板}/在6个月的时间里，将J只雌性小鼠置于饮用水中，以600 mg/L的剂量进行氯沙坦（n=15）治疗或不治疗。通过体内高频超声心动图评估心脏功能，通过握力测试、Digiscan监测、Rotarod计时和体外力量测试评估骨骼肌功能。采用苦味酸红染色和图像J分析评估纤维化。使用实时聚合链反应（RT-PCR）评估基因表达。与氯沙坦治疗组（32.2%±4.2%；P（P）<.01）小鼠。氯沙坦治疗小鼠的收缩压显著降低（56±6 vs 69±7 mm Hg；P（P）< .0005). 氯沙坦治疗后的心脏纤维化百分比显著降低(P（P）<.05）以及隔膜(P（P）<.01），趾长伸肌(P（P）<.05）和腓肠肌(P（P）<.05）肌肉与未经治疗的mdx小鼠相比。治疗组和未治疗组之间的骨骼肌功能没有显著差异。氯沙坦慢性治疗可减少肌营养不良蛋白缺乏mdx小鼠的心肌和骨骼肌纤维化，并改善心脏收缩功能。

关键词：杜氏肌营养不良，肌营养不良蛋白，小鼠，心肌病，血管紧张素，超声心动图

介绍

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种遗传性X连锁疾病，每3500名男性婴儿中就有1例发生，这是由于缺乏肌营养不良蛋白（一种连接细胞内细胞骨架与细胞外基质的大蛋白）所致。¹骨骼肌损伤首先在临床上很明显，然后这些患者会出现呼吸和心肌损伤。随着骨骼和呼吸系统治疗的改善，更多DMD患者因心肌细胞死亡而死于心肌病。据估计，心肌病目前占DMD死亡人数的10%至20%。²

由于确切的分子病因尚不清楚，DMD心肌病的治疗方法与其他形式的心肌病相似。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEi）治疗DMD心肌病已经取得了一些成功。Ramaciotti等人对50例DMD患者的临床和超声心动图数据进行了回顾性分析。^三其中27名（46%）患者出现收缩功能障碍，其中10名（43%）患者在接受ACEi依那普利治疗后功能正常。值得关注的是，DMD基因突变的类型并不能预测依那普利的疗效。在另一项研究中，Jefferies等人表明，ACEi和/或β受体阻滞剂治疗改善了29名患者中的27名患者的心功能。⁴Duboc等人还表明，早期使用ACEi培哚普利治疗可延缓DMD儿童左心室功能障碍的发生和进展，并可降低10年随访期间的死亡率。^5,6

心肌病患者的心功能下降会刺激肾素-血管紧张素系统并导致血管紧张素II（ATII）的释放。在其众多作用中，ATII是促纤维化细胞因子转化生长因子β（TGF-β）的有力刺激剂，可刺激纤维化。⁷ACE通过阻止血管紧张素I转化为ATII来调节ATII的生成，并可能通过限制心肌内纤维化和瘢痕形成的数量来改善心脏功能。这些药物被广泛使用，并被美国心脏协会推荐用于预防和治疗心力衰竭。⁸

氯沙坦是一种血管紧张素II 1型受体阻滞剂，通过调节TGF-β，被证明能有效预防纤维蛋白I等位基因杂合的小鼠主动脉瘤。⁹科恩等人¹⁰最近报道了氯沙坦在6至9个月治疗后对mdx小鼠的影响。在这项研究中，膈肌的纤维化和肌纤维直径显著降低。氯沙坦使mdx趾长伸肌（EDL）的体外用力频率恢复到野生型水平，并显示治疗小鼠的后肢握力增强。¹⁰松下等人¹¹观察氯沙坦对BIO14.6心肌病仓鼠20周的影响。氯沙坦通过抑制氧化应激降低心室扩张、心肌纤维化和心脏功能障碍，他们还发现仓鼠心脏中诱导型一氧化氮合酶（iNos/Nos2）上调。据推测，氯沙坦可以破坏NADPH活性氧（ROS）的生成，并可能保留由其他ROS源介导的心脏保护性氧化还原信号转导，如内皮细胞Nos（eNos/Nos3）的激活。¹¹

基于这些研究，我们检测了氯沙坦对运动性肌营养不良蛋白缺乏mdx小鼠心脏和骨骼肌功能的影响。与未经治疗的Mdx小鼠相比，服用氯沙坦6个月的Mdx鼠显著改善了心脏收缩功能，显著降低了心肌和骨骼肌纤维化。本研究支持氯沙坦在治疗DMD心肌病和骨骼肌纤维化中的潜在作用。

材料和方法

动物

所有小鼠均按照当地机构动物护理和使用委员会的指导方针，按照批准的方案DCVAMC#01079进行处理。一般来说，10至12周龄女性C57BL/10ScSn-Dmd^{中密度纤维板}/J（mdx）小鼠，体重20至30g，购自Jackson实验室（马萨诸塞州巴尔港）。所有小鼠都被安置在一个单独通风的笼子系统中，进行12小时的光-暗循环，并随意食用标准的小鼠食物和纯净水。实验组在饮用水中接受浓度为600 mg/L的氯沙坦（默克公司，新泽西州怀特豪斯站）。来自年龄匹配的未经治疗野生型对照组（C57BL/10ScSn）的肌肉组织用于组织学和实时聚合链反应（PCR）比较。

跑步机锻炼

跑步机运动使用了一种常见的商用器械（俄亥俄州哥伦布市哥伦布仪器公司），该器械使用了一条移动的皮带。小鼠在水平跑步机上以12 m/min的速度跑30分钟。在6个月的过程中，每周两次在早上进行测试。

Rotarod测试

如前所述进行了Rotarod试验。¹²每个试验每天进行两次，每次试验之间间隔2小时，连续进行3天。记录跌落潜伏期，并对每只小鼠的所有6个得分进行平均。平均数据表示为每只小鼠的下降延迟。

握力测试

如前所述进行握力测试。¹³记录两分钟内成功测量五次后肢和前肢力量。5天内每天的最大值用于后续分析。握力测量是在早上收集的，为期5天，数据根据体重进行标准化，并表示为千克力/千克（KGF/kg）。

行为活动测量

如前所述，使用开放场Digiscan仪器（Omnitech Electronics，Columbus，Ohio）测量开放场活性。¹⁴在实际数据收集之前，所有小鼠都要适应60分钟。连续4天，每天1小时内每10分钟收集一次数据。

体外骨骼肌用力收缩

实验在小鼠右后肢EDL肌肉上进行。肌肉被分离，6-0丝线牢固地固定在远端和近端肌腱上。从小鼠身上小心取出肌肉并垂直放置在含有哺乳动物林格缓冲溶液（以mmol/L:137 NaCl，24 NaHCO为单位）的浴缸中_三，11葡萄糖，5 KCL，2 CaCl₂，1 MgSO₄，1 NaH₂人事军官₄和0.025涡轮尿苷氯化物）保持在25°C，并在95%O的条件下起泡₂–5%一氧化碳₂将pH值稳定在7.4。肌肉的一根肌腱牢固地系在伺服电机/力传感器的杠杆臂上（305B型，加拿大安大略省Aurora Scientific），另一根肌筋系在浴缸的固定底板上。在2个不锈钢板电极之间刺激EDL肌肉。增加单个0.2 ms方形刺激脉冲的电压，直到达到肌肉的超最大刺激，并将肌肉长度调整为产生最大抽搐力的长度（即产生力的最佳长度）。当肌肉保持在最佳长度时，记录一连串刺激脉冲产生的力，并增加刺激频率，直到达到最大等长强直力。用卡尺测量肌肉长度，将最佳肌肉长度乘以0.45，即EDL肌肉的既定纤维长度/肌肉长度比，计算出最佳纤维长度。¹⁵将肌肉从浴缸中取出后，称重肌肉块。根据以下方程式，使用最大等长力、肌肉质量和纤维长度计算肌肉特定力（肌肉固有力产生的测量值）：

\begin{array}{l} 具体的 力 = 最大 等轴测的 力 / (肌肉 群众 \times \\ {[密度 属于 肌肉 组织 \times 纤维 长度]}^{- 1}) . \\ 肌肉 组织 密度 习惯于 是 1.056 公斤 / L（左） \end{array}

超声心动图

如前所述，使用1%至2%吸入异氟醚麻醉进行超声心动图检查。¹⁶在尾部周围放置血压（BP）袖带，然后将尾部放置在传感器组件中，以便在麻醉期间进行无创血压监测（SC1000，Hatteras Instruments，Cary，North Carolina）。使用分析软件（VisualSonics，加拿大多伦多）离线进行定性和定量测量。基于心电图千赫的可视化（EKV）软件分析为模拟的250至1000 Hz静态和Cine循环图像生成了离线重建。超声心动图测量包括血管直径、心室壁厚度和心室大小，以及房室瓣和半月瓣的血流速度。改良胸骨旁长轴心电图环也用于通过Simpson法（Simp）测量射血分数（EF）。M型图像用于测量LV室尺寸和壁厚。使用前缘到前缘的方法，通过M模式测量计算缩短百分比，公式如下：

\begin{array}{l} % 缩短 分数 (% 旧金山) = 左边 心室的 内部的 直径 \\ (舒张期) [LVID（LVID） (d日)] - 左边 \\ 心室 内部的 直径 \\ (收缩) [LVID（LVID） (秒)] / LVID（LVID） (d日) \end{array}

组织学评估

将解剖的每一块肌肉（如腓肠肌、EDL、膈肌和心脏）的一部分保存在福尔马林中，以进行苏木精和伊红（H&E）染色和天狼星红染色。Histoserv公司（马里兰州杰曼顿）进行石蜡切片和H&E染色。在光学显微镜下以20×物镜对五个不重叠的代表性组织场进行成像，并使用计算机软件（Olympus C.a.S.T.体视学系统，Olympus America Inc，Center Valley，Pennsylvania）获得数字图像。数字图像被加载到图像J（NIH）中，并带有额外的插件来计数细胞。两名盲法研究者统计了纤维总数、集中核数、外周核数以及每个场集中核的细胞总数。如前所述，对每一区域出现变性（条纹消失/纤维内容物均匀外观）或再生（嗜碱性细胞质、大的外周或中央细胞核，核仁突出）和炎症灶的纤维进行评估。¹³

肌细胞横截面积

对于细胞膜小麦胚芽凝集素（WGA）染色，心室赤道的石蜡包埋组织切片首先通过标准程序脱蜡并重新水化。在柠檬酸缓冲液（10 mmol/L，pH 6.0）中提取抗原后，在室温下用Alexa Fluor 594-WGA（10μg/mL[加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）]和DAPI（4′-6-二氨基-2-苯基吲哚，二盐酸盐[加利福尼亚州卡尔斯巴德州Invitrogen]）在封闭溶液中培养切片1小时。在Leica DM4000B荧光显微镜下，以40×物镜和计算机软件（LeicaDM4000B，Leica Microsystems Inc，Exton，Pennsylvania）获得的比例尺数字图像，对7到10个非重叠随机选择的代表性场进行成像。使用图像J（NIH）测量大约65到85个细胞，以确定每个小鼠心脏样本的心肌细胞横截面积（CSA）。

纤维化的量化

心脏、EDL、腓肠肌和膈肌组织的石蜡切片用苦味酸红染色（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。在光学显微镜下以4倍物镜放大组织，并使用计算机软件（奥林巴斯C.a.S.T.体视学系统，奥林巴斯美国公司）获得数字图像。这些数字图像是使用Image J（NIH）处理的，带有额外的阈值颜色插件来处理jpeg图像。将对应于红色染色区域的像素归一化为组织图像的总像素区域，结果表示为胶原蛋白的百分比。

实时聚合酶链式反应

将未处理的mdx骨骼（腓肠肌）和心肌（心室组织）与年龄匹配的野生型（C57BL10ScSn/J）和氯沙坦处理的mdx组织进行比较。小鼠安乐死后，立即用液氮冷却异戊烷冷冻组织。将组织样品放入装有1mL三唑的试管中并均质。根据制造商的说明，分离总RNA，然后使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒进行清洗（加利福尼亚州巴伦西亚市Qiagen.）。在凝胶上检查总RNA的完整性，并使用Nanodrop ND-100分光光度计（Nanodrot Technologies，特拉华州威明顿）进行量化。总之，300 ng总RNA与ABI高容量互补DNA（cDNA）试剂盒（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）一起用于生成cDNA。将该cDNA添加到TaqMan 2×通用PCR混合物和所需的TaqMan-基因表达测定引物（应用生物系统）中。HPRT1作为对照探针。使用7900 HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）以相对定量ΔΔct模式进行实时PCR。使用制造商提供的SDS2.2软件分析数据。

统计分析

在分析之前确认每个定量测量值的正常性，不符合正常值的人进行数据转换（腓肠肌和心脏的纤维化百分比进行对数转换）。使用Student软件比较了接受治疗和未接受治疗的小鼠的身体和器官重量、握力、肌肉力量、纤维化百分比、回声、血压和行为测量t吨测试。由于非正态性，使用分位数回归分析垂直活动的行为测量。在适当的情况下，使用泊松或负二项回归分析组织学参数总纤维、具有集中核的纤维、外周核、中央核、变性和再生纤维以及炎症。采用Wilcoxon秩和非参数检验分析肌细胞CSA。这些差异在P（P）值<.05。实时PCR分析比较2^-ΔΔCt±SD（ΔCt）归一化为HPRT1控制探头。所有分析均使用Stata V10（德克萨斯州大学站）进行。

结果

身体和器官重量

试验结束时，未经治疗和氯沙坦治疗的mdx小鼠的体重没有显著变化。在氯沙坦治疗的小鼠中，我们没有发现EDL、腓肠肌、比目鱼肌和脾脏重量的标准化差异，但心脏重量的标准值有显著差异(P（P）与未治疗组相比，<0.04）显示出较低的正常体重（eTable 1）。

骨骼肌功能测量

试验结束时，各组之间的正常前肢或后肢握力没有发现显著差异。各组间RotaRod跌倒延迟时间或Digiscan行为测量值（包括水平和垂直活动、总距离和休息时间）也没有显著差异（eTable 2）。

体外骨骼肌用力收缩

mdx小鼠组之间的肌力和比肌力没有显著差异。未经治疗的小鼠最大力为418±65 mN（毫牛顿），氯沙坦治疗的小鼠的最大力为395±34 mN(P（P）= .48). 对于比力，未经处理的小鼠肌肉横截面的最大力标准化为200±32 mN/mm²和氯沙坦治疗小鼠的测量值为178±22 mN/mm²(P（P）= .28).

肌肉纤维化、心肌细胞CSA和肌肉组织学的量化

心脏纤维化明显减少(P（P）< .05;图1，面板A和B），隔膜(P（P）<.01），EDL(P（P）<.05）和腓肠肌(P（P）<.01）氯沙坦治疗的mdx小鼠与未治疗的mdx对照组的肌肉(表1). 使用3个月龄mdx和野生型小鼠的独立样本，我们发现心脏纤维化的数量没有显著差异（0.37±0.21%vs 0.32±0.24%[非转换数据]；P（P）= .69). 我们还发现，与未经氯沙坦治疗的心脏相比，氯沙坦处理的心肌细胞的CSA小而显著地降低（241±5μm²vs 269±16μm²;P（P）< .04;图1面板C和D）。骨骼肌的组织学分析在各组之间没有显著差异，包括每个场的总纤维数、每个场具有中央核的纤维数、每场的总外周核和中央核数、每个场内退化或再生纤维数以及每个场内的炎症面积（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图1

与未经治疗的mdx小鼠相比，氯沙坦治疗的mdx小鼠的心脏纤维化和心肌细胞横截面积显著降低。图A显示了未经治疗的mdx心脏的横截面，标记了左心室（LV）和右心室（RV）。切片用苦味酸红染色，将胶原蛋白染成红色。图像对应12.5%的纤维化（非对数转换数据）。B组显示了与a组水平相似的氯沙坦治疗的mdx心脏的横截面。图像对应于5.6%的纤维化（非对数转换数据）。C组是WGA染色的未经处理的mdx左心室组织的代表性图像。与氯沙坦处理的mdx左心室组织相比，心肌细胞横截面积（标记为*的代表性细胞）的测量显示面积增加（图D）。

表1

与未经氯沙坦治疗的9个月龄mdx小鼠相比，氯沙坦处理的mdx小鼠的心肌和骨骼肌纤维化百分比显著降低

纤维化百分比	未处理（N=8）平均值±标准偏差	氯沙坦（N=8）平均值±标准偏差	P（P）价值
心脏^一,^b条	2.12 ± 0.20	1.51 ± 0.42	.044
膈膜	38.07 ± 7.88	26.91 ± 6.31	.007
老挝国家电力公司	10.47 ± 1.70	8.03 ± 2.62	.041
腓肠肌^一	2.45 ± 0.26	1.98 ± 0.29	.003

在单独的窗口中打开

注：EDL=趾长伸肌。

^一由于测量值的非正态性而执行的数据对数转换。

^b条未处理N=5。

心脏超声心动图测量和计算

使用无创性高频超声心动图图像，未经治疗的mdx小鼠通过缩短百分率测量心脏功能显著下降(P（P）<.01）和射血分数百分比(P（P）<.03）与氯沙坦治疗的mdx小鼠相比(图2;表2). 在心室大小、壁厚或多普勒速度测量方面没有显著差异。

在单独的窗口中打开

图2

未经治疗（A）和氯沙坦治疗（B）心脏的高频超声心动图M型图像。每个面板左侧的箭头显示舒张时的左心室内径（LVID），右侧的箭头显示收缩时的LVID。图A对应24%的缩短百分比（%SF），图B对应31%的%SF（%SF=LVID舒张期-LVID收缩期/LVID舒张期）。

表2

高频超声心动图显示氯沙坦治疗可显著防止9月龄mdx小鼠缩短百分比和射血分数的降低

参数	未处理（N=11）平均值±标准偏差	氯沙坦（N=9）平均值±标准偏差	P（P）价值
%部分缩短	26.86 ± 3.49	32.23 ± 4.22	.006
%喷射分数	52.25 ± 5.35	59.46 ± 7.42	.021
LVID（d；mm）	3.72 ± 0.23	3.68 ± 0.32	.705
LVPW（d；mm）	0.76 ± 0.10	0.72 ± 0.20	.551
MPI公司	0.77 ± 0.24	0.67 ± 0.15	.285
心率（bpm）	413.4 ± 39.4	389.3 ± 39.6	.190
Ao Vmax（毫米/秒）	888.7 ± 79.4	813.4 ± 139.4	.155
PA Vmax（毫米/秒）	676.5 ± 63.7	674.4 ± 33.8	.930
MV Vmax（毫米/秒）	628.5 ± 55.6	588.9 ± 89.0	.240
电视最大电压（mm/s）	373.4 ± 37.1	388.4 ± 56.4	.483

在单独的窗口中打开

注：Ao=主动脉；bpm=每分钟心跳次数；LVID（d）=左心室舒张内径；LVPW（d）=舒张期左心室后壁厚度；MPI=心肌性能指数；MV=二尖瓣；PA=肺动脉；TV=三尖瓣。

无创血压测量

用氯沙坦治疗的Mdx小鼠血压显著降低。未经治疗的小鼠收缩压为69±7 mm Hg(n个=10）与56±6 mm Hg相比(n个= 9;P（P）= .0004). 未经治疗的小鼠的舒张压为43±10毫米汞柱，而接受治疗的小鼠为27±5毫米汞柱(P（P）= .0005). 因此，治疗组小鼠的平均血压也显著降低（52±8毫米汞柱vs 36±4毫米汞柱；P（P）< .0001).

心脏和骨骼肌RT-PCR

与野生型小鼠相比，未经治疗的mdx心脏心室组织TGF-β显著增加(P（P）=0.01），骨膜蛋白(P（P）<.0001），血小板反应蛋白1(P（P）<.0001）和TGF-β受体1(P（P）=0.04）信使核糖核酸（信使核糖核酸）表达(表3). 当比较未经治疗的mdx心脏组织和经氯沙坦治疗的mdx心脏组织时，TGF-β、骨膜炎素、血小板反应蛋白1或TGF-？受体1没有显著差异。NADPH氧化酶4（Nox4）的基因表达也没有显著差异；诱导型一氧化氮合酶（Nos2）；赖氨酰氧化酶；TGF-β受体2和3；类收费受体（TLR）2、4、7和8；结缔组织生长因子；或骨桥蛋白（Spp1）在未经治疗和氯沙坦治疗的mdx心脏组织中发现（eTable 3）。

表3

RT-PCR结果显示，与未经治疗的野生型对照组相比，未经治疗和氯沙坦治疗的mdx小鼠的心脏和胃网膜中TGF-β、Periostin和血栓反应蛋白-1 mRNA显著上调^一

	组	平均值±标准偏差	P（P）价值	组	平均值±标准偏差	P（P）价值	组	平均值±标准差	P（P）价值
心脏
转化生长因子-β	重量	1.0 ± 0.52	.01	重量	1.0 ± 0.52	.005	Mdx untx公司	1.0 ± 0.78	.98
	Mdx untx公司	2.74 ± 0.78		Mdx洛杉矶	2.72 ± 0.60		Mdx洛杉矶	0.99 ± 0.60
骨蛋白酶	重量	1.0 ± 0.82	<.0001	重量	1.0 ± 0.82	.04	Mdx untx公司	1.0 ± 0.87	.74
	Mdx untx公司	7.83 ± 0.87		Mdx洛杉矶	2.43 ± 0.76		Mdx洛杉矶	0.80 ± 0.76
血小板反应蛋白-1	重量	1.0 ± 0.88	<.0001	重量	1.0 ± 0.88	<.0001	Mdx untx公司	1.0 ± 1.09	.18
	Mdx untx公司	16.3 ± 1.10		Mdx损失	46.3 ± 2.15		Mdx洛杉矶	2.84 ± 2.15
TGF-β受体-1	重量	1.0 ± 0.16	.04	重量	1.0 ± 0.16	.2	Mdx untx公司	1.0 ± 0.34	.69
	Mdx untx公司	1.49 ± 0.34		Mdx洛杉矶	1.9 ± 1.3		Mdx洛杉矶	1.28 ± 1.32
腓肠肌
转化生长因子-β	重量	1.0 ± 1.39	.0004	重量	1.0 ± 1.39	.0004	Mdx untx公司	1.0 ± 0.28	1
	Mdx无	5.91 ± 0.28		Mdx洛杉矶	6.09 ± 0.44		Mdx洛杉矶	1.03 ± 0.44
骨蛋白酶	重量	1.0 ± 1.83	<.0001	重量	1.0 ± 1.83	<.0001	Mdx无	1.0 ± 0.39	.3
	Mdx untx公司	10.9 ± 0.39		Mdx洛杉矶	16.6 ± 0.89		Mdx洛杉矶	1.52 ± 0.89
血小板反应蛋白-1	重量	1.0 ± 1.25	.04	重量	1.0 ± 1.25	.05	Mdx untx公司	1.0 ± 0.66	.8
	Mdx untx公司	2.88 ± 0.66		Mdx洛杉矶	2.62 ± 0.40		Mdx洛杉矶	0.91 ± 0.40
TGF-β受体-1	重量	1.0 ± 2.79	.7	重量	1.0 ± 2.79	.9	Mdx untx公司	1.0 ± 1.89	.17
	Mdx untx公司	0.37 ± 1.89		Mdx洛杉矶	0.97 ± 0.73		Mdx洛杉矶	2.6 ± 0.73

在单独的窗口中打开

注：Los=氯沙坦；RT-PCR=实时聚合链反应；untx=未经处理；wt=野生型（C57BL10/ScSnJ）。

^一氯沙坦治疗和未治疗的mdx小鼠之间没有显著差异。平均值等于2^-ΔΔCt.

与未经治疗的mdx腓肠肌小鼠和野生型小鼠相比，TGF-β显著增加(P（P）<.001），骨膜炎(P（P）<.0001）和血小板反应蛋白1(P（P）=0.04）mRNA水平(表3). TGF-β受体1 mRNA表达比较无显著差异。当比较未经治疗的mdx腓肠肌和经氯沙坦治疗的mdx腓肠肌时，TGF-β、骨膜炎素、血小板反应蛋白1或TGF-？受体1 mRNA水平没有显著差异。

讨论

这是首次研究慢性氯沙坦治疗对营养不良蛋白缺乏小鼠心脏的影响。与未经治疗的mdx小鼠相比，用氯沙坦治疗mdx小鼠6个月后，我们发现它显著降低了血压水平，防止了未经治疗mdx鼠心脏功能的下降，并显著减少了心肌和骨骼肌中的纤维化数量。

使用高频超声心动图，我们发现氯沙坦治疗的小鼠保持了32%的缩短率，而未经治疗的mdx小鼠减少到27%(P（P）= .006). 这些测量结果通过使用心内膜边界追踪法评估胸骨旁长轴收缩和舒张时的射血分数得到验证(P（P）= .021). 9个月大的mdx小鼠出现这种轻度心肌病，之前我们的实验室已经证实，并且与其他组的数据一致。^16,17氯沙坦6个月以上的慢性治疗可防止心脏收缩功能下降。

无创血压测量显示后负荷显著降低(P（P）<.0006）。ATII I型受体拮抗产生的后负荷显著降低可能是心功能改善的主要机制。由于缺乏肌营养不良蛋白，mdx心肌对应激更敏感，后负荷增加。6个月的氯沙坦治疗可减少慢性后负荷，从而间接减少心肌损伤和随后的纤维化。Bauer等人之前的一项研究表明，血管紧张素转换酶卡托普利治疗8周后，通过使用体内心室导管减少后负荷，间接改善了心脏收缩力。¹⁸氯沙坦治疗也显著降低了心脏纤维化、心脏重量和心肌细胞CSA。氯沙坦治疗的mdx小鼠的纤维化百分比为2.1%，而未治疗的小鼠为1.5%（对数转换数据；P（P）= .04). 众所周知，mdx小鼠的心脏纤维化会随着时间的推移而增加，以前的研究已经证明，从9个月大的时候起，心脏纤维化就会增加。^{16,17,19–21}氯沙坦降低了其他扩张型和肥厚型心肌病小鼠模型的心脏纤维化。^22,23在以前的细胞培养、小鼠和大鼠模型中，氯沙坦还降低了心肌细胞CSA。^24–26本研究中的治疗从3个月大时开始，在这个年龄段，mdx和野生型小鼠之间的心脏纤维化没有显著差异。因此，这项研究没有阐明氯沙坦是否改变了启动纤维化的途径，减少了持续纤维化的途径或调节了其他可能导致纤维化的因素，如后负荷。

我们研究了mRNA表达水平，以确定mdx心脏中是否有任何特定的纤维化途径被激活。我们发现，与野生型相比，mdx心脏组织中TGF-β、CTGF、TSP1和骨膜炎素mRNA的表达显著增加，但在氯沙坦和未经治疗的mdx小鼠之间没有发现差异。我们还询问了氯沙坦治疗可能改变的其他途径。我们发现TLR2、4、7、8或Spp1的表达水平没有差异。^27–30我们发现，在治疗和未治疗的mdx小鼠之间，Nox4或Nos2的mRNA表达没有显著差异，Nos2或Nos3的蛋白质水平也没有显著差异（数据未显示）。还有其他途径涉及转化生长因子-β信号传导，我们没有对此进行询问。其中包括TAK1、有丝分裂原活化蛋白（MAP）激酶、Rho-like GTPase和PI3K/AKT通路。³¹需要进一步研究以充分了解心脏TGF-β基因途径和肌营养不良蛋白缺乏心脏组织中发生的翻译后修饰。

在这项研究中，在6个月的时间里，使用mdx增加肌肉病理学。运动可以增加心脏与体重的比率和组织病理学标志物，包括间质纤维化、脂肪组织和炎症细胞。³²我们的研究表明，氯沙坦降低了运动小鼠的正常心脏重量和心脏纤维化，但在治疗和未治疗的mdx小鼠之间，炎症细胞浸润没有任何显著差异（eTable 1）。药物对锻炼肌肉的影响非常重要。Townsend等人表明，与未转基因的mdx小鼠相比，转基因的微囊藻毒素mdx小鼠增加了运动量，并在较年轻时出现心肌病。³³作者推测，增加运动可能导致心肌压力增加，心肌病恶化。这是一个重要的考虑因素，因为研究人员专注于骨骼肌治疗，而没有充分了解骨骼肌功能改善对营养不良患者心肌的影响。

氯沙坦先前被证明可以改善mdx骨骼肌功能。¹⁰我们的结果显示没有显著差异。该试验包括强迫运动，这可能导致骨骼肌功能改变，而这种改变无法通过这种氯沙坦剂量得到改善。尽管氯沙坦的剂量和治疗时间在这两项研究中相似，但科恩等人报告说，氯沙坦治疗小鼠的骨骼肌和膈肌纤维化程度显著降低。¹⁰这项研究还发现腓肠肌和EDL肌肉显著减少。这些减少小于Cohn等人的发现，可能无法显著改善骨骼肌强度和力量测量。

本研究受到一些分析中样本数量少的限制。虽然我们使用的氯沙坦剂量和治疗持续时间与之前的研究一致，但本试验中的小鼠在纤维化结果中没有表现出类似程度的显著性，并且我们也没有发现骨骼肌功能有任何显著差异。也许，这些小鼠摄入的实际药物量低于前一次试验，或者给药不太理想，尽管试验前评估表明小鼠摄入了等量的氯沙坦（+）和氯沙坦水。需要进一步研究，以更好地了解运动和纤维化对骨骼肌功能评估的影响。虽然这项研究证实了氯沙坦降低纤维化的能力，但我们无法证实纤维化途径中mRNA水平的分子变化。

结论

这项研究表明，氯沙坦治疗降低了肌营养不良蛋白缺乏小鼠的后负荷、肌肉纤维化，并预防了心肌病。需要进一步测试以更好地了解氯沙坦治疗的机制，但这项临床前试验支持对杜氏肌营养不良患者氯沙坦疗法的进一步研究。

脚注

转载和许可：sagepub.com/journalsPermissions.nav

利益冲突声明

作者声明在本文的作者身份和/或发表方面没有利益冲突。

财务披露/融资

提交人透露，获得了以下资助，用于研究和/或撰写本文：国家儿童健康与人类发展研究所/儿童健康研究职业发展奖（授予C.F.S.编号K12HD001399-04）；美国国防部陆军医学研究采办活动（授予KN和EPH编号W81XWH-05-1-0616）；消灭杜兴公司基金会；肌肉营养不良协会；国家儿童健康与人类发展研究所韦尔斯通肌营养不良中心（EPH赠款编号1U54HD053177-01A1）；和美国国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（KN授权号R01-AR050478）。

工具书类

1Hoffman EP、Brown RH，Jr、Kunkel LM。肌营养不良蛋白：杜氏肌营养不良位点的蛋白质产物。单元格。1987;51(6):919–928.[公共医学][谷歌学者]

2.Gulati S、Saxena A、Kumar V、Kalra V、Duchenne肌营养不良：心脏受累的患病率和模式。印度儿科杂志。2005;72(5):389–393.[公共医学][谷歌学者]

三。Ramaciotti C，Heistein LC，Coursey M等。duchenne肌营养不良患者在生命的第二个十年中的左心室功能和对依那普利的反应。Am J Cardiol公司。2006;98(6):825–827.[公共医学][谷歌学者]

4Jefferies JL、Eidem BW、Belmont JW等。肌营养不良扩张型心肌病的遗传预测因子和重塑。循环。2005;112(18):2799–2804.[公共医学][谷歌学者]

5Duboc D，Meune C，Lerebours G，Devaux JY，Vaksmann G，Becane HM.培哚普利对Duchenne型肌营养不良患者左心室功能障碍发生和发展的影响。美国心脏病杂志。2005;45(6):855–857.[公共医学][谷歌学者]

6Duboc D，Meune C，Pierre B等。培哚普利预防治疗对Duchenne型肌营养不良症患者死亡率的影响：10年随访。美国心脏杂志。2007;154(3):596–602.[公共医学][谷歌学者]

7Khan R，Sheppard R.心脏病中的纤维化：了解转化生长因子-β在心肌病、瓣膜病和心律失常中的作用。免疫学。2006;118(1):10–24. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

8Hunt SA、Abraham WT、Chin MH等。ACC/AHA 2005年成人慢性心力衰竭诊断和管理指南更新：美国心脏病学会/美国心脏协会实践指南工作组的报告（更新2001年心力衰竭评估和管理指南的写作委员会）：与美国胸科医师学会和国际心肺移植学会合作开发：由心律学会认可。循环。2005;112（12）：e154–e235。[公共医学][谷歌学者]

9Habashi JP、Judge DP、Holm TM等。AT1拮抗剂氯沙坦可预防马凡综合征小鼠模型的主动脉瘤。科学。2006;312(5770):117–121. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

10.Cohn RD、van Erp C、Habashi JP等。血管紧张素II 1型受体阻滞剂可减轻TGF-β在多种肌病状态下诱导的肌肉再生失败。自然医学。2007;13(2):204–210. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

11Matsuhisa S、Otani H、Okazaki T等。N-乙酰半胱氨酸消除了氯沙坦对心肌病仓鼠左心室重构的保护作用。抗氧化氧化还原信号。2008;10(12):1999–2008.[公共医学][谷歌学者]

12Raben N，Nagaraju K，Lee E，Plotz P.通过靶向破坏酸性α-葡萄糖苷酶基因对小鼠疾病严重程度的调节。神经肌肉疾病。2000;10(4–5):283–291.[公共医学][谷歌学者]

13Spurney CF、Gordish Dressman H、Guerron AD等。多药耐药小鼠的临床前药物试验：可靠和敏感结果指标的评估。肌肉神经。2009;39(5):591–602. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

14Nagaraju K，Raben N，Loefler L，等。骨骼肌中MHC I类的条件性上调导致自我维持性自身免疫性肌炎和肌炎特异性自身抗体。国家科学院院刊。2000;97(16):9209–14. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

15布鲁克斯SV，福克纳JA。年轻、成年和老年小鼠骨骼肌的收缩特性。生理学杂志。1988;404:71–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

16Spurney CF、Knoblach S、Pistilli EE、Nagaraju K、Martin GR、Hoffman EP。小鼠肌营养不良蛋白缺乏型心肌病：Nox4和Lox的表达与心肌纤维化和功能参数改变有关。神经肌肉疾病。2008;18(5):371–381. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

17Quinlan JG，Hahn HS，Wong BL，Lorenz JN，Wenisch AS，Levin LS。mdx小鼠心肌病的演变：生理和形态学发现。神经肌肉疾病。2004;14(8–9):491–496.[公共医学][谷歌学者]

18Bauer R，Straub V，Blain A，Bushby K，MacGowan GA。类固醇和血管紧张素转换酶抑制剂在肌营养不良蛋白缺陷型心肌病小鼠模型中的对比作用。Eur J心脏衰竭。2009;11(5):463–471.[公共医学][谷歌学者]

19Spurney CF、Cha HJ、Sali A等。慢性给予胸腺肽β-4对营养不良蛋白缺乏小鼠骨骼肌和心肌功能的评估。公共科学图书馆一号。2010;5（1）：e8976。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

20Li W，Liu W，Zhong J，Yu X.使用3D CMR标记研究肌营养不良蛋白缺乏mdx小鼠心脏功能改变的早期表现。心血管医学杂志。2009;11:40. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

21Marques MJ、Oggiam DS、Barbin IC、Ferretti R、Santo Neto H。长期使用deflazacort治疗可降低mdx小鼠的心肌纤维化。肌肉神经。2009;40(3):466–468.[公共医学][谷歌学者]

22Kanda T、Araki M、Nakano M等。氯沙坦在扩张型心肌病小鼠模型中的慢性作用：与卡托普利的比较。药理学实验与治疗杂志。1995;273(2):955–958.[公共医学][谷歌学者]

23Lim DS、Lutucuta S、Bachiredy P等。血管紧张素II阻断剂逆转人类肥厚性心肌病转基因小鼠模型中的心肌纤维化。循环。2001;103(6):789–791. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

24.Fredj S、Bescond J、Louault C、Delwail A、Lecron JC、Potreau D。白细胞介素-6在心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖期间心肌细胞/心肌成纤维细胞相互作用中的作用。细胞生理学杂志。2005;204(2):428–436.[公共医学][谷歌学者]

25Goncalves G、Zornoff LA、Ribeiro HB等。阻断肾素-血管紧张素系统可减轻主动脉狭窄大鼠的心脏重塑。Arq Cardiol运动内衣。2005;84(4):304–308.[公共医学][谷歌学者]

26Oishi Y、Ozono R、Yoshizumi M、Akishita M、Horiuchi M、Oshima T。AT2受体介导AT1受体拮抗剂在心肌梗死后重塑中的心脏保护作用。生命科学。2006;80(1):82–88.[公共医学][谷歌学者]

27纪毅，刘杰，王忠，刘宁。血管紧张素II部分通过血管平滑肌细胞中的toll样受体4依赖性信号通路诱导炎症反应。细胞生理生化。2009;23(4–6):265–276.[公共医学][谷歌学者]

28Tang TF，Zhou QL，Zhu LL，Tang R，Ao X.福辛普利和氯沙坦对肾小管上皮细胞Toll样受体4表达的影响。中南大学医学报一学版。2008;33(10):958–965.[公共医学][谷歌学者]

29Xie Z，Pimental DR，Lohan S，等。血管紧张素Ⅱ刺激的骨桥蛋白在心脏微血管内皮细胞中表达的调节：p42/44丝裂原活化蛋白激酶和活性氧物种的作用。细胞生理学杂志。2001;188(1):132–138.[公共医学][谷歌学者]

30Xie Z、Singh M、Singh K.ERK1/2和JNKs参与了活性氧物种介导的血管紧张素II和白介素-1β诱导成年大鼠心脏成纤维细胞骨桥蛋白基因表达，但不参与p38激酶。细胞生理学杂志。2004;198(3):399–407.[公共医学][谷歌学者]

31张晔。TGF-β信号转导中的非疯狂途径。细胞研究。2009;19(1):128–139. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

32Nakamura A、Yoshida K、Takeda S、Dohi N、Ikeda S。运动对mdx小鼠心脏营养不良特征的进展以及丝裂原活化蛋白激酶和钙调磷酸酶的激活。FEBS通讯。2002;520(1–3):18–24.[公共医学][谷歌学者]

33Townsend D，Yasuda S，Li S，Chamberlain JS，Metzger JM。营养不良骨骼肌靶向修复引起的急性扩张型心肌病。分子热学。2008;16(5):832–835. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]