趋化因子受体CCR6依赖性积累γδ损伤肝脏中的T细胞抑制肝脏炎症和纤维化

老鼠

C57bl/6野生型（WT），同源CD45.1，肌动蛋白-eGFP，伊尔-17^−/−,¹⁶和抄送6^−/−老鼠⁹被安置在特定的无致病条件下。根据德国法律要求，在批准的道德条件下，在6-12周龄时对年龄和性别匹配的动物进行实验。

抄送6^−/−慢性肝损伤后小鼠发生更严重的肝纤维化

为了阐明CCR6/CL20与肝脏疾病进展的功能相关性，通过重复CCL20诱导肝纤维化₄WT和抄送6^−/−老鼠。常规组织学染色显示WT和抄送6^−/−小鼠肝细胞大面积坏死，门脉周围炎性浸润致密，血清转氨酶活性强烈升高(图2A、B). 天狼星红染色显示，细胞外胶原蛋白沉积在抄送6^−/−小鼠，与WT小鼠相比(图2A). 加速的纤维化发展抄送6^−/−羟脯氨酸（胶原蛋白基质中大量存在的一种氨基酸）在小鼠肝脏中的浓度增加，天狼星红染色的面积分数增加，以及胶原蛋白1A1在肝纤维化中抄送6^−/−与WT相比，小鼠(图2C).

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图2

CCR6缺乏促进小鼠肝纤维化。（A–C）重量和抄送6^−/−用CCl攻击小鼠₄每周三次，持续4周或不治疗。（A） WT和WT的代表性苏木精和曙红（H+E）和天狼星红（SR）染色抄送6^−/−老鼠。（B） 野生型和抄送6^−/−老鼠。（C） 羟脯氨酸（OH-Proline）测量、天狼星红染色基质沉积的定量（源自染色，如A所示）以及胶原蛋白1a1(第1a1列)WT和抄送6^−/−老鼠。（D–F）重量和抄送6^−/−用MCD饮食喂养小鼠8周，诱导脂肪性肝炎。（D） 代表性H+E和天狼星红染色。（E） 指定时间点的血清ALT水平。（F） WT和WT患者肝脏基质沉积的羟脯氨酸测量和定量抄送6^−/−老鼠*/#P（P）< 0.05; **/##P（P）< 0.01; ***/###P（P）< 0.001. #与控制条件相比。比例尺：500μm.数据来自每组7–10只小鼠，显示为平均值±标准误差。为了准确比较不同实验的纤维化结果，将数据归一化为来自同一实验的相应WT对照肝脏（=100%）。

为了证实CCR6/CCL20通路与肝纤维化的一般相关性，小鼠还接受MCD饮食作为慢性代谢性肝损伤的独立模型，导致严重脂肪性肝炎。¹⁷年肝损伤加重抄送6^−/−与WT相比，MCD饮食期间的小鼠，组织学和肝酶证明(图2D，E和数据未显示）。此外，抄送6^−/−与WT动物相比，MCD饮食8周后，小鼠表现出更严重的肝纤维化(图2D，F). 总的来说，这些结果表明CCR6/CCL20代表了慢性肝损伤和肝纤维化发生过程中的保护性趋化因子途径。

白细胞在受损肝脏中的渗透增强抄送6^−/−老鼠

的生平抄送6^−/−CD45的IHC证明，与WT小鼠相比，损伤后小鼠的肝内白细胞积聚显著增加(图3A). 通过荧光激活细胞分选（FACS）分析肝内免疫细胞亚群(图3B)，我们无法观察到中性粒细胞或巨噬细胞的差异，而肝脏中的所有主要淋巴细胞亚群（T、B和自然杀伤细胞）均显著增加抄送6^−/−CCl公司₄-与野生动物相比，接受治疗的小鼠(图3C、D). 重要的是，WT和抄送6^−/−老鼠(图3B和支撑图3).

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图3

WT和CCR6缺陷小鼠损伤肝脏中的白细胞浸润和Th亚群组成。重量和抄送6^−/−小鼠每周接受三次CCl治疗₄4周或不治疗。（A） 野生型和野生型小鼠肝脏中泛白细胞标志物CD45的IHC抄送6^−/−老鼠。比例尺：200μm.（B）肝白细胞（CD45⁺，Hoechst-33258阴性）被细分为中性粒细胞（Ly6G⁺)、巨噬细胞（CD11b⁺80层/四层⁺)、T细胞（CD3⁺CD4细胞⁺，CD3⁺CD8（CD8）⁺)、NK细胞（CD3⁻第1.1节⁺)和B电池（B220⁺). CCl肝脏的典型FACS图₄-治疗小鼠。（C） 量化（A）。（D） 肝内白细胞亚群的绝对数量如（B）所示。（E） 通过定量聚合酶链反应测定全肝CD4 Th细胞亚型的标志性细胞因子的表达，即：，Ifnγ（Th1），伊尔-4（Th2），伊尔-10（Treg），以及伊尔-17和伊尔-22（第17页）。（F） 通过酶联免疫吸附测定法测量肝脏中细胞因子的浓度，并将其标准化为肝脏提取物中的总蛋白质含量。由于细胞因子的绝对浓度不同，数值显示为纤维化肝的%*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. 数据来自每组6–10只小鼠，显示为平均值±标准误差。

CCR6在不同的CD4 T细胞亚群，特别是Th17和Treg细胞上表达。¹⁸因此，我们分析了肝脏中Th1、Th2、Th17和Treg细胞的标志性细胞因子干扰素（IFN）的表达-γIL-4、IL-17和IL-10。干扰素无差异-γ或白介素-10基因表达和蛋白浓度在WT和抄送6^−/−老鼠(图3E、F).伊尔-4CCl患者肝脏中的基因表达显著降低₄-处理过的抄送6^−/−小鼠，与野生型小鼠相比(图3E)，但不在蛋白质水平上(图3F).

更令人惊讶的是，IL-17的表达在抄送6^−/−与野生型相比，小鼠的mRNA和蛋白质水平(图3E、F). 尽管如此，我们还检查了Th-肽特异性转录因子T-bet（Th1）、Gata3（Th2）、FoxP3（Treg）或Ror的基因和蛋白表达γt（Th17；支撑图4A-C)表明肝内Th细胞的分化在CCR6缺失时没有改变。因此，尽管我们的研究结果表明抄送6^−/−CCl后小鼠出现更严重的肝脏炎症₄与WT小鼠相比，免疫细胞浸润程度更高的治疗似乎与CD4Th细胞室的改变无关。

IL-17产生的渗透γδ没有CCR6时T细胞减少

为了确定限制损伤肝脏炎症反应的CCR6依赖性细胞室，我们通过FACS分类从小鼠肝脏中分离不同的原代细胞类型，以分析抄送6表达式。我们无法检测到抄送6在肝细胞和HSC等肝细胞中的表达抄送6损伤后巨噬细胞和CD4 T细胞的诱导(图4A). 然而，最值得注意的是抄送6在上检测到上调γδCCl后的T细胞₄处理(图4A). 此外，两种细胞类型均上调伊尔-17CCl后₄治疗，但再一次，表达γδT细胞远远高于CD4 T细胞(图4B).伊尔-22CD4 T细胞和γδT细胞，在γδT细胞(图4B).

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图4

产生IL-17的肝内积聚γδT细胞受损抄送6^−/−慢性损伤小鼠。（A） 肝细胞（Hepa）、HSC、巨噬细胞（MΦ）、CD4⁺T细胞（CD4TC），和γδT细胞(γδTC）通过FACS分类从CCl处理的WT小鼠肝脏中分离₄或控制小鼠。抄送6用定量聚合酶链反应检测其表达。（B） CD4细胞⁺T细胞和γδT细胞是从WT肝脏中分离出来的FACS。伊尔-17和伊尔-22定量聚合酶链反应表达。（C） 的绝对数γδT细胞（CD3⁺CD4细胞⁻γδTCR公司⁺)WT或抄送6^−/−CCl治疗小鼠₄或控制小鼠。CCl肝脏的典型FACS图₄-治疗小鼠。（D和E）与（C）相同，在用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐PMA/离子霉素重新刺激后，对NK1.1和IL-17进行额外染色以区分γδT细胞亚型。（D） 肝脏NK1.1表达的代表性直方图γδT细胞（CCl₄-经处理的小鼠，CD3门控⁺CD4细胞⁻γδTCR公司⁺)和NK1.1的量化⁺和NK1.1⁻ γδT细胞。（E） IL-17的定量⁺ γδ肝脏中的T细胞（CCl₄-通过细胞内FACS染色测定IL-17的表达）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001. 数据来源于每组n=6-10只小鼠，显示为平均值±标准误差。

这些分析提示CCR6依赖性的肝脏募集γδ慢性肝损伤中的T细胞。事实上，γδTCR公司⁺CCl后T细胞增加₄WT和抄送6^−/−老鼠(图4C). 然而，抄送6^−/−小鼠肝内胆汁明显减少γδCCl后与WT小鼠相比的T细胞₄处理(图4C).

γδ根据NK1.1或CCR6的表面表达，T细胞可分为两大亚群。NK1.1标准⁺ γδT细胞主要产生干扰素-γ，而CCR6⁺ γδT细胞主要产生IL-17，并与Th17细胞具有某些共同特征。¹²在健康肝脏中，大约一半的γδT细胞为NK1.1⁺WT中，但只有25%抄送6^−/−老鼠(图4D). CCl后₄治疗，NK1.1的相对量⁺ γδ由于CCR6的流入，WT小鼠的T细胞显著减少⁺ γδT细胞(图4D). 相比之下，NK1.1⁺子集在抄送6^−/−CCl后₄治疗，将两种亚型的平衡转向NK1.1⁺ γδ肝损伤后的T细胞抄送6^−/−老鼠(图4D). 重要的是，在抄送6^−/−小鼠，IL-17的数量⁺ γδCCl后T细胞显著低于WT小鼠₄处理(图4E). 综上所述，这些结果强烈表明IL-17产生的浸润γδT细胞进入受损肝脏依赖于趋化因子受体CCR6。

IL-17生成γδT细胞需要CCR6转运到肝脏

因此，我们检验了以下假设：γδT细胞利用CCR6迁移至受损肝脏。因此，脾脏γδ从增强型绿色荧光蛋白（eGFP）转基因WT小鼠和GFP中分离出T细胞⁻ 抄送6^−/−小鼠（均来自CD45.2背景），以1:1的比例混合，并静脉（IV）注射到曾用CCl治疗过一次的同源WT小鼠（携带CD45.1等位基因）中₄24小时前γδT细胞转移(图5A). 转移后20小时，γδ对肝脏和脾脏中的T细胞进行分析。在肝脏中，我们发现了大量的GFP⁺（=重量）γδT细胞，但只有极少数的GFP⁻(=抄送6^−/−)γδT细胞。脾脏中几乎没有转移细胞，WT和抄送6^−/−T细胞，证实CCl₄政府为调任人员发出了强烈的招聘信号γδT细胞进入肝脏(图5A). 这些结果表明γδT细胞确实需要CCR6在损伤后转运到肝脏。

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图5

重组抄送6^−/−带有γδT细胞，但不含CD4⁺T细胞，减少肝纤维化。（A） 脾脏γδ从肌动蛋白-eGFP或抄送6^−/−小鼠，以1:1的比例混合并注射到CD45.1中⁺用CCl治疗过的B6-mice₄一次（T细胞注射前24小时）。T细胞注射后24小时CD45.2的绝对数量⁺GFP公司⁺WT和CD45.2⁺GFP公司⁻ 抄送6^−/− γδ检测肝脏和脾脏中的T细胞。（B–D）重量和抄送6^−/−用CCl处理小鼠₄4周内每周三次。同时，脾脏CD4⁺或γδ从CD45.1中分离出T细胞⁺小鼠，并每周静脉注射一次。小鼠接受任一重量γδT细胞（100000–150000个细胞），伊尔-17^−/− γδT细胞（100000–150000细胞），或WT CD4⁺CCl期间的T细胞（1000000–1500000细胞）₄治疗。（B） 从肝脏中分离出白细胞，并对其进行CD45.1、CD4和γδTCR以鉴定转移的细胞（所示为代表性图）。（C） 肝脏石蜡切片的天狼星红染色。比例尺：500μm.（D）肝羟脯氨酸测量和ECM沉积定量*P（P）< 0.05. 数据来自每组6只小鼠，显示为平均值±标准误差。为了准确比较不同实验的纤维化结果，将数据归一化为相同实验中未进行细胞转移（=100%）的相应WT肝脏。

WT的采用转让γδT细胞（而非CD4 T细胞）限制肝纤维化抄送6^−/−不依赖IL-17的小鼠

提供功能证据，证明CCR6的招募表达γδT细胞负责限制CCl₄-介导的肝损伤和纤维化，我们重建抄送6^−/−WT小鼠γδT细胞。因此，WT和抄送6^−/−用重复CCl治疗小鼠₄注射，小鼠额外接受WTγδ每周从同源小鼠（CD45.1）IV脾脏中分离一次T细胞（100000–150000个细胞）(图5B). CCl 4周后₄治疗，明确的CD45.1（转移）人群⁺在肝脏中可以发现表达γδT细胞受体（TCR），但不是CD4(图5B).抄送6^−/−接受wt的小鼠γδT细胞显示肝纤维化明显少于未转移的T细胞(图5C、D). 此外，每周的WT收养转移γδT细胞至抄送6^−/−小鼠能够将纤维化表型完全恢复到WT小鼠的水平(图5C、D). 值得注意的是γδ进入WT小鼠的T细胞对纤维化进程没有显著影响，这可能与转移到WT小鼠体内的T细胞数量总体较低有关γδT细胞，与内源性肝细胞相比γδ纤维化WT小鼠中已经存在T细胞池。

接下来，我们研究了CCR6表达的机制γδT细胞抑制肝脏炎症和纤维化。IL-17是肝脏CCR6产生的主要细胞因子⁺ γδ受损肝脏中的T细胞，但巨噬细胞和HSC中的IL-17信号被认为在小鼠肝纤维化中具有促纤维化作用。¹⁹测试CCR6是否表达γδT细胞通过IL-17限制肝纤维化的发生，我们重组了抄送6^−/−IL-17缺乏小鼠γδT细胞。肝纤维化表型抄送6^−/−小鼠注射伊尔-17^−/− γδT细胞完全恢复到WT水平，类似于过继移植伊尔-17⁺ γδT细胞(图5C、D).

确保加速纤维化抄送6^−/−老鼠是减少γδT细胞，但CD4 T细胞室没有改变，我们也转移了WT CD4⁺T细胞进入CCl₄-challengend WT和抄送6^−/−老鼠。正如预期的那样，²过继性转移CD4 T细胞增强了WT小鼠胶原沉积，但没有进一步增加WT小鼠的强纤维化抄送6^−/−老鼠(图5C、D)，证实CCR6对γδT细胞体内综合起来，我们的结果提供了实验证据γδT细胞调节肝脏炎症并限制纤维化进展，但这些作用与这些细胞分泌IL-17无关。

作者衷心感谢Aline Roggenkamp、Carmen Tag、Sibille Sauer-Lehnen和Christiane Esch提供的出色技术援助。

这项工作得到了德国研究基金会（DFG；Ta434/2-1，SFB/TRR 57）和亚琛跨学科临床研究中心（IZKF）的支持。作者感谢Ralf Weikirchen教授提供GRX细胞。