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国际临床实验医学杂志。2014; 7(7): 1721–1727.
2014年7月15日在线发布。
预防性维修识别码：项目经理4132134
PMID：25126170

叶精油及其成分的抗菌活性油樟

李丽,1,* 李正文,1,* 钟琼银,1,* 秦伟,2,* 任永佳,1 周立军,2 焦旭,1 徐松,1 一周,1 杜永华,2 莲子鹏,1 帅康,1和王宇2
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠杆菌ATCC 25922和肠炎沙门菌CMCC（B）50041用于抗菌试验油樟叶精油及其五种化学成分。1,8-桉叶素对细菌超微结构的影响(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)还用透射电镜进行了研究。这个长柄梭菌叶挥发油和五种化学成分表现出不同程度的抑制作用。除γ-萜品烯外，它们的MIC（最小抑菌浓度）和MBC（最小杀菌浓度）值分别在0.781µL/mL~6.25µL/mL和0.781μL/mL~12.5µL/mL范围内。γ-松油烯的MIC值大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均高于50µL/mL，但γ-松油烯的MIC和MBC值肠炎沙门氏菌其中α-松油醇的抗菌活性最好。在透射电镜下，处理后的细胞大小大肠杆菌减少，细胞壁和细胞膜破裂，核质减少并聚集在一侧。在金黄色葡萄球菌用1,8-桉叶素处理后，细胞大小和形状受到破坏，细胞核细胞质浓缩或减少或聚集在一侧。这些结果表明长柄梭菌叶精油及其成分具有良好的抗菌活性，1,8-桉叶素的抗菌机理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌可能是由于它的疏水性。

关键词：油樟，精油，1,8-桉叶素，抗菌活性，透射电镜

介绍

肉桂（甘蓝）N.Chao是中国特有的树木。抗菌活性油樟叶精油引起了众多研究者的极大关注。一系列研究表明，精油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金杆菌、微生物链霉菌、卡他双球菌和沙门氏菌[1,2]对植物病原真菌和皮肤癣菌也有抑制活性[三,4].

为了探索长叶蝉叶精油，了解其化学成分很重要。已发表的报告表明油樟叶片精油为1,8-桉叶素（58.55%）、黄樟素（0.04%）、γ-松油烯（0.37%）、α-松油烯醇（15.43%）、松油烯-4-醇（4.84%）等[5-9].

1，8-桉叶醇，也称为桉树醇或卡杰普托，是一种萜烯氧化物，是大多数桉树油（75%），长柄梭菌叶精油（8.55%）、迷迭香（40%）、，番石榴属（40~60%）和许多其他精油[10-12]. 它经常被制药行业用作药物制剂，作为经皮渗透促进剂，具有减充血和镇咳作用，并在芳香疗法中以皮肤浴的形式作为皮肤兴奋剂[13-16]. 此外，它还被认为对治疗支气管炎、鼻窦炎和风湿症有用[17].

虽然长柄梭菌经研究，其成分的潜在抗菌活性尚未评估。在本研究中长柄梭菌提取并分析了其化学成分，然后对精油及其化学成分的抗菌活性进行了研究金黄色葡萄球菌,大肠杆菌和肠炎沙门氏菌体外研究。研究了1，8-桉叶素对细菌超微结构的影响，以帮助理解抗菌机理。

材料和方法

精油蒸馏

本地肉桂叶(长柄梭菌)无性系采自四川实验林。香精油长柄梭菌水蒸馏6h得到叶子。

GC分析

使用配备FID的岛津14B型进行GC分析。所用的色谱柱长50 m，内径0.22 mm，玻璃毛细管涂有二氧化硅。GC以2°C/min的速率从60°C编程到220°C。通过与标准品的比较以及加标，确认了本地肉桂叶油主要成分的鉴定。化合物的数量是通过对光谱图的峰面积进行积分得到的。

细菌菌株

本抗菌研究中使用的三种细菌菌株是金黄色葡萄球菌ATCC 25923，大肠杆菌ATCC 25922和肠炎沙门氏菌CMCC（B）50041，来自中国雅安四川农业大学兽医药理学实验室。

抗菌活性试验

使用国家临床实验室标准委员会（NCCLS，20002008）中描述的肉汤稀释法评估精油及其化学成分的抗菌活性。将试验样品溶解在最终浓度为50µL/mL至0.195µL/mL的2%吐温-80中。使用2%吐温80作为阴性对照。在37°C下培养24小时后，检测抗菌活性。MIC被定义为能够完全抑制肉汤中可见生长的测试样品的最低浓度。MBC被估计为琼脂继代培养中未检测到可见生长的样品的最低浓度。整个实验一式三份，并对结果进行平均。

精油的时效曲线研究

使用药物和培养基，在三种不同浓度（1/2×MIC、1×MIC和2×MIC）下对每个样品进行两次时间杀伤曲线研究。含有不同浓度的Mueller-Hinton肉汤和生长对照组的试管接种约5×10的对数相接种物5CFU/mL至最终体积。接种的培养液在37°C下培养。在不同的时间间隔（0、1、2、4、8、12、24和36 h）从每个试管中取样0.1 mL接种的培养液，并进行10倍的连续稀释。然后，将每种稀释液的0.1 mL分散在Mueller Hinton平板上进行菌落计数，并在37°C下培养24小时。只对每个系列稀释液的计数在30～300之间的平板进行计数。最后，构建了生物体的时间杀伤曲线。

透射电子显微镜

为了研究1，8-桉叶醇对细菌超微结构的影响6CFU/毫升金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在Mueller Hinton肉汤中暴露于1，8-桉叶醇的MIC浓度，然后在37°C的培养箱摇床中培养3小时。对照组仅用溶剂治疗。然后在无菌塑料离心管中以8000 rpm在4°C下离心细菌悬浮液10 min。丢弃上清液，并用2.5%戊二醛在4°C的0.1 M二羧酸缓冲液（pH=7.4）中固定丸化细胞含量过夜。然后将样品在1%四氧化锇（OsO）中固定2小时4)在室温下溶于二甲氨基甲酸缓冲液中，在二甲氨基乙酸缓冲液中洗涤三次，每次15分钟。样品在乙醇中按40%、60%、75%、80%和95%的稀释度分级系列脱水，每次两次，每次15分钟。最后一个脱水步骤在100%乙醇中进行1h，每30min更换一次。使用环氧树脂（Epon-618）将固定后的样品在45°C下嵌入12h~16h。用LKB-II型超薄切片仪制备包埋样品的超薄切片，并用乙酸铀酰和柠檬酸铅双重染色。在透射电子显微镜上观察细菌细胞的形态。

结果和讨论

精油及其主要成分的抗菌活性

从香精油中分离出的五种化合物长柄梭菌叶片鉴定为：1，8-桉叶素、黄樟素、γ-松油烯、α-松油醇和松油烯-4-醇。的MIC和MBC值长柄梭菌叶精油及其五种重要成分对三种细菌的抑制作用(大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌)显示在中表1. The长柄梭菌叶精油具有明显的抗菌特性，油中的五种重要成分也表现出不同程度的抑制作用。除γ-萜品烯外，其MIC和MBC值分别在0.781µL/mL~6.25µL/mL和0.781μL/mL~12.5µL/mL范围内。

表1

的MIC和MBC值长柄梭菌叶精油及其五种重要成分对三种细菌的抑制作用

成分 大肠杆菌ATCC 25922型 肠炎沙门氏菌中国移动通信集团公司（乙）50041 金黄色葡萄球菌电话：25923
工业界集团MBC公司工业界集团MBC公司工业界集团MBC公司
香精油3.1253.1256.256.256.256.25
1，8-桉油脑3.1253.1256.256.256.256.25
α-萜品醇0.7810.7813.1253.1251.5623.125
松油烯-4-醇1.5621.5623.1253.1251.5621.562
萨弗罗12.512.512.512.512.512.5
γ-松油烯>50>503.1253.125>50>50

MIC和MBC，µL/mL。

五种重要成分的抗菌活性比较长柄梭菌叶油长柄梭菌叶油、1,8-桉油脑和长柄梭菌叶油也有同样的抗菌作用。同时，黄樟素的抑制作用小于长柄梭菌叶油、α-松油醇和萜烯-4-醇金黄色葡萄球菌,大肠杆菌和肠炎沙门氏菌另一方面长柄梭菌叶油含量低于α-萜品烯和萜品烯-4-醇金黄色葡萄球菌,大肠杆菌和肠炎沙门氏菌γ-萜烯具有较高的特异性抑菌作用。γ-松油烯的MIC值大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均高于50µL/mL，但γ-松油烯的MIC和MBC值肠炎沙门氏菌仅为3.125µL/mL。

在五种成分中，α-松油醇具有最好的抗菌活性。因此长柄梭菌叶油对这三种细菌的抑制作用不仅仅是由于1,8-桉叶素。这可能是由于长柄梭菌叶油赋予它如此强大的抗菌活性。

有几份报告指出，其他叶油（如泽兰Bl.）具有抗菌活性。希利和他的同事[18]已经检测了泽兰叶油对抗三种细菌和四种酵母菌株。他们的结果表明，叶油完全抑制了大肠杆菌,金黄色葡萄球菌、和铜绿假单胞菌浓度为500µg/mL。另一份报告发现泽兰反对大肠杆菌、和金黄色葡萄球菌分别为0.05%和0.04%[19]. Pitarokili和Sonboli证实油樟是一种有效的植物杀菌剂[20,21]. 然而，目前还没有关于长叶肉桂挥发油有效成分的报告，而且由于难以进行质量控制，几乎没有商业产品可供使用。一些研究人员报告说，精油的抗菌活性与其化学成分有关[22,23]，植物材料（提取物/精油）中发现的化合物的官能团（醇、酚、萜烯和酮）与其抗菌特性有关[24].

与这些报告相比，从我们的结果中可以明显看出长柄梭菌叶油及其五种重要成分对细菌的抑制作用优于泽兰叶油、喜马拉雅樟科植物和土肉桂，其对菌株的MIC值在3.90μL/mL~31.25μL/mL和250μL/mL~500μL/mL之间[25,26]. 另一方面，细菌的菌株特性没有明显的抑制趋势：革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都受到影响。这得到了其他研究人员的支持，他们报告了油樟从精油中分离出的化合物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和一些食品腐败微生物有活性[20,21]. 这与台湾不同(台灣杉Hayata）心材精油，仅对革兰氏阳性菌有抑制作用[27]. 此外，结果表明长柄梭菌叶油及其五种重要成分对细菌具有协同作用，这与其在长柄梭菌精油。

因为长柄梭菌叶油为1,8-桉叶素，具有较强的抗菌活性，进一步测试了1,8-橄榄叶素对细菌超微结构的影响，以帮助理解抗菌机理。

计时终止曲线

的时间杀伤曲线长柄梭菌叶子精油显示在图1在0.5×MIC浓度下长柄梭菌叶挥发油的时效曲线与对照组基本相同，具有整体生长周期（滞后期、对数期、平稳期和死亡期）。但在1×MIC和2×MIC浓度下长柄梭菌叶挥发油、三种细菌直接进入衰退期，无需调整期、对数期和稳定期。所有的细菌细胞大肠杆菌,肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别于4h、8h、12h和2h在1×MIC下死亡。通过增加长柄梭菌叶子精油。的时间杀伤曲线长柄梭菌叶挥发油具有浓度依赖性效应。这将为确定抗菌治疗方案的最佳剂量提供更合理的依据。

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精油的时间杀伤疗法肉桂叶反对大肠杆菌（A） ，肠炎沙门氏菌（B） ，金黄色葡萄球菌（C） ●●●●。

细菌的超微结构变化

这个大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别用3.125μL/mL和6.25μL/mL纯化的1，8-桉叶素在37°C下处理细胞3h，在透射电镜上观察(图2和​和3）。三). 未经处理大肠杆菌细胞呈典型的健康杆菌形状，甚至出现细胞生长和分裂(图2A)和未经处理金黄色葡萄球菌细胞呈现连续的薄而光滑的细胞壁、细胞膜、核物质和细胞分裂(图3A). 但处理后的细胞在表面和内部结构上受到严重损坏和破坏。在透射电镜下，处理后的细胞大小大肠杆菌减少，细胞壁和细胞膜破裂，核质减少并聚集在一侧(图2B). 在金黄色葡萄球菌处理后，细胞大小和形状受损，细胞核细胞质浓缩或减少或聚集在一侧(图3B).

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EM图（×25000）大肠杆菌（未经处理）（A）。显微照片上的固定相细胞显示出典型的健康细菌形状，甚至显示出生长和细胞分裂（箭头指示）；EM图（×20000）大肠杆菌暴露于1，8-桉叶醇（B）的MIC。细胞变形，细胞壁和细胞膜破裂，细胞材料冷凝，这些都是从受损的细胞中观察到的大肠杆菌（箭头表示）。

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EM图（×30000）金黄色葡萄球菌（未处理）（A），细胞呈现连续的薄而光滑的细胞壁、细胞膜、核物质和细胞分裂（箭头指示）；的EM图（×20000）金黄色葡萄球菌暴露于1，8-桉叶醇（B）的MIC。细胞变得不规则，皱缩，细胞内容物泄漏（箭头指示）。

草药或香料中发现的天然化合物的抗菌机理已经讨论过[28]. 据报道，麝香草酚和香芹酚在类似浓度下对肠道细菌（大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门菌）的生长具有抑制作用，如上图所示。他们被认为具有显著的外膜解体，并增加了ATP通过细胞质膜的通透性。

与这些报道相比，我们的结果表明，1，8-桉叶素具有显著的外膜崩解和细胞质浓缩或减少。结果与nisin的作用类似，nisin通过诱导气孔和细胞质渗漏作用于细胞质膜[29,30].

总之，长柄梭菌叶精油及其组分具有良好的抗菌活性，而叶精油中主要化合物之一的α-松油醇具有最强的抗菌活性。1，8-桉叶素的抗菌机理是通过对其结构的改变来实现的大肠杆菌,肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌直接。这表明长柄梭菌叶子有可能用于医疗目的。在本研究中，我们研究了从中提取的主要成分的抗菌活性和抗菌机理长柄梭菌叶精油对抗大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌之前没有报道过。

致谢

四川省教育厅科研基金（No.14TD0031）和四川省长叶肉桂资源利用青年科技创新研究团队（2011JTD0035）资助的课题。

利益冲突的披露

没有。

工具书类

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文章来自国际临床与实验医学杂志由以下人员提供电子世纪出版公司