胃肠病学。作者手稿；PMC 2014年8月12日提供。
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自噬降低小鼠乙醇诱导的急性肝毒性和脂肪变性
,1,2 ,1 ,1 ,1,2 ,1 ,1 ,三 ,4 ,5和1,*
丁文兴
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院病理学系，邮编15261
2堪萨斯州堪萨斯城堪萨斯大学医学中心药理学、毒理学和治疗学系，邮编66160
李敏（音）
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院病理学系，邮编15261
陈晓云
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院病理学系15261
红敏妮
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院病理学系，邮编15261
2堪萨斯州堪萨斯城堪萨斯大学医学中心药理学、毒理学和治疗学系，邮编66160
林智文
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院病理学系，邮编15261
高文涛
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院病理学系，邮编15261
陆滨丰
三匹兹堡大学医学院免疫学系，宾夕法尼亚州15261
唐娜·B·斯托兹
4匹兹堡大学医学院细胞生物学和生理学系，宾夕法尼亚州15261
达恩·L·克莱门斯
5内布拉斯加州大学内科和VAMC，奥马哈，NE 68105
尹晓明
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院病理学系，邮编15261
1宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学院病理学系，邮编15261
2堪萨斯州堪萨斯城堪萨斯大学医学中心药理学、毒理学和治疗学系，邮编66160
三匹兹堡大学医学院免疫学系，宾夕法尼亚州15261
4匹兹堡大学医学院细胞生物学和生理学系，宾夕法尼亚州15261
5内布拉斯加大学内科学系和弗吉尼亚大学医学院，奥马哈，东北68105
- 补充资料
1
GUID:83B3678D-B4B1-427F-83DC-1339D2BBA1D5
摘要
背景和目标
酗酒是肝损伤的主要原因。酒精性肝病的病理特征是长期发展的，但对酒精有害作用的细胞防御机制尚不清楚。我们研究了大自噬（一种进化上保守的细胞机制，通常在应激反应中激活）是否可以保护肝细胞免受乙醇毒性。
方法
小鼠急性灌胃给予乙醇。研究了乙醇对原代肝细胞和肝细胞系的影响。
结果
乙醇诱导小鼠肝脏和培养细胞的大自噬需要乙醇代谢，产生活性氧物种，并抑制mTOR信号。药物或小干扰RNA抑制大自噬显著增加肝细胞凋亡和肝损伤；因此，大自噬可以保护细胞免受乙醇的毒性作用。乙醇诱导的大自噬似乎对线粒体受损和脂质滴积聚的细胞具有选择性，但对长寿命蛋白质没有选择性，这可能是其保护作用的原因。大量自噬的增加在药理学上降低了与急性乙醇暴露相关的肝毒性和脂肪变性。
结论
大自噬可保护小鼠肝脏免受乙醇诱导的毒性。修饰大分子自噬的试剂可能被开发成为酒精性肝病患者的治疗药物。
关键词：GFP-LC3、bodipy染色、自噬通量、长期蛋白质降解
介绍
酒精在世界各地被广泛消费。虽然适度饮酒可能有益于人类健康，但过度饮酒，无论是狂饮还是慢性饮酒，都可能导致相当大的健康问题。酗酒除了会导致行为和心理上的改变外，还会导致急性糖原消耗、低血糖和酸中毒1在细胞水平上，酗酒会导致线粒体损伤、自由基生成、胰岛素信号抑制和脂肪变性，尽管细胞死亡通常很轻微，除非存在其他易感因素2–7在慢性酒精滥用中，肝损伤的组织学表现可以从脂肪变性发展为局灶性炎症、局灶性坏死、纤维化和肝硬化，从而导致酒精性肝病1,2,5.
乙醇发病是由多种因素引起的1,2,5,7,8线粒体损伤、活性氧生成和脂肪变性等早期事件似乎是乙醇代谢的直接结果，这是急性和慢性酒精暴露的共同特征。虽然人们在理解这些机制方面付出了更大的努力，但对乙醇有害影响的细胞保护机制知之甚少。我们假设，对乙醇暴露的细胞保护反应对于控制乙醇诱导的肝脏病理至关重要。
在潜在的保护机制中，我们研究了宏观自噬是否在限制乙醇诱导的肝损伤中发挥作用。大自噬（以下简称自噬）是一种负责大分子和亚细胞细胞器降解的大量细胞内降解系统9自噬包括形成双膜自噬体，其包裹底物并与溶酶体融合以降解。三十多岁Atg公司酵母中参与自噬的基因已被定义，其中许多具有哺乳动物同源物9在哺乳动物细胞中，Atg8/LC3、Atg7和Atg6/Beclin 1的功能最为典型。Atg6/Beclin 1与III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）复合物VPS34和VPS15形成复合物，导致磷脂酰肌糖-3-磷酸（PtdIns3P）的自噬特异性生成。PtdIns3P是一系列事件所必需的，这些事件最终导致Atg8/LC3在自噬体膜上与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，这也需要Atg7。PE-结合的Atg8/LC3，也称为LC3-II（与未液化的LC3-I相反），在自噬体形成中很重要9.
自噬现已广泛参与许多疾病的发病机制，并在各种应激条件下被激活。自噬似乎是一种有效的细胞防御系统，可以抵御多种病理损伤。因此，我们研究了乙醇暴露是否会激活自噬，以及自噬是否在减轻乙醇诱导的病理学中起关键作用。使用乙醇狂欢模型和原代肝细胞培养（其中乙醇诱导的早期病理事件已明确定义），我们确定乙醇可诱导原代肝组织选择性自噬过程，依赖于其代谢、ROS生成和mTOR抑制。此外，自噬可能通过清除受损的线粒体和积聚的脂滴来保护肝细胞免受乙醇的有害影响。
材料和方法
动物实验
野生型C57BL/6小鼠和GFP-LC3转基因小鼠10本研究中使用了。所有的动物都受到了人道的照顾。所有程序均由匹兹堡大学动物护理和使用委员会批准。
如前所述进行乙醇狂欢11该模型旨在达到与人类狂饮相当的血液酒精水平、行为效应和生理效应。禁食6小时后，雄性小鼠通过四次等分的灌胃，每隔20分钟给予33%（v/v）乙醇，总累积剂量为4.5 g/kg体重。对照组小鼠接受相同体积的水。为了抑制或诱导自噬，给小鼠注射氯喹（CQ，60 mg/kg）或雷帕霉素（2 mg/kg），然后再给小鼠注射乙醇。16小时后对小鼠进行分析。对于抑制小鼠肝脏中Atg7表达，siRNA（参见补充信息)使用流体动力学技术通过尾静脉注射（0.7nmol/g）。48小时后，小鼠接受乙醇治疗。
细胞培养
如前所述，分离并培养小鼠肝细胞12在含有10%FCS的William’s培养基E中进行初步培养后，细胞在治疗前在无血清William′s培养基中培养过夜。HepG2和VL-17A细胞13在DMEM中保留了10%的FCS和其他标准补充。如图图例所示，使用乙醇和以下化学品：3-MA（10 mM）、CQ（10µM）、雷帕霉素（10μM）、4-MP（4 mM），MnTBAP（1 mM）和NAC（20 mM）。
显微镜分析
电池（2×105/在其他治疗之前，用腺病毒GFP-LC3感染过夜或用MitoTracker Red（50 nM）加载15分钟。通过Hoechst 33342核染色或TUNEL染色确定凋亡细胞死亡。如前所述，对GFP-LC3转基因肝脏进行冷冻10分析前，用Bodypy 581/591-C11（1µM）或Bodypy493/503（0.1µM。所有荧光图像都是用Olympus Fluoview 1000共焦显微镜数字化采集的。使用JEM 1016CX电子显微镜按照标准程序进行电子显微镜检查。
生化分析
使用Biotron Diagnostics（加利福尼亚州Hemet）的试剂盒测定血清ALT水平。肝甘油三酯按参考值测定14用Ac-DEVD-AFC作为底物测定Caspase-3活性12对于抑制VL-17A细胞中Beclin 1的表达，siRNA（参见补充信息)以0.12µM/1×10的浓度转染到VL-17A细胞中6使用低聚体胺的细胞。36小时后对细胞进行其他处理。对LC3-II和p62条带进行密度测定，并将数值归一化为负荷对照（β-actin或LAMP1），然后将其转换为未处理对照的相对单位。自噬通量按照表S1如前所述进行长寿命蛋白质降解测定9,15.
统计分析
定量数据受制于一种方式方差分析通过Holm-Sidak分析，学生t吨测试或z（z）适当时使用SigmaStat 3.5（Systat Software，Inc.，San Jose，CA）进行测试，
结果
急性乙醇暴露诱导的自噬
乙醇对自噬的激活首次在GFP-LC3转基因小鼠中进行了检测10.丙种酒精治疗导致肝脏中GFP-LC3点显著升高()，代表自噬体。免疫印迹分析证实乙醇处理的肝脏中膜相关PE结合型GFP-LC3（GFP-LC3-II）和内源性LC3（LC3-II(). 脂质化LC3特别富集于溶酶体所在的LAMP1阳性重膜部分，反映了自噬体与溶酶体融合形成降解自溶体时的目的地。重要的是，电子显微镜（EM）分析表明乙醇处理后自噬体明显积聚()，可通过siRNA-介导的Atg7敲除来抑制（见下文）。
急性乙醇暴露诱导肝脏自噬（A–C）。按照指示处理GFP-LC3转基因小鼠（n=3-5），并通过共焦显微镜（A）分析肝脏切片。对每只动物的GFP-LC3点数量（平均值+扫描电镜）进行量化（B）。用免疫印迹法（C）分析肝脏总溶解物（TL）和重膜分数（HM）。(D类)按指示处理野生型小鼠（n=3），并用免疫印迹法分析肝脏部分。对每个样品进行LC3-II和p62的密度分析（平均值+SEM）。(E类). 对野生型肝脏样本进行EM处理。箭头表示自噬体。N： 细胞核，LD：脂滴。(F类). 测定每个给定区域的自噬体数量（平均值+扫描电镜）（n=3-4）。比例尺：20微米（A），2微米（E）。*：p<0.05。
溶酶体抑制剂氯喹（CQ）预处理小鼠进一步增加了GFP-LC3点的水平()，LC3-II表格()和自噬体的数量()这表明，至少有一部分由这种升高引起的自噬体在溶酶体中被降解。单个GFP部分的外观()由于GFP-LC3的分解和p62/SQSTM1的减少()，一种选择性自噬适配器分子，将泛素化的自噬底物带到自噬体中进行降解9,16在乙醇处理的肝脏中，乙醇也会促进自噬降解。确实，详细的通量分析(表S1)表明不仅自噬体合成明显增加，而且基于GFP-LC3点的变化，自噬降解也增加()，自噬体数量()，和重膜中的LC3-II水平(). 对总裂解物中LC3-II的分析仍然表明合成增加，但降解没有增加，这可能是因为LC3-II在总裂解物的富集程度低于上述厚膜中的富集程度，这降低了分析的灵敏度。
接下来我们研究了乙醇对培养的原代肝细胞的影响。与体内观察结果一致，体外乙醇处理也导致GFP-LC3点的剂量依赖性增加()，LC3-II形成()以及更多更大的自噬体的形成(图S1). 3-MA抑制LC3穿孔()，III类PI3K抑制剂VPS34。相反，与CQ联合治疗可以增强这些变化(). 通量分析(表S1)表明基于GFP-LC3点和LC3-II水平的自噬体合成增加，尽管降解增加仅基于GFP-LCD点的水平，而不是基于总裂解物中LC3-II的水平，可能是由于上述相同的原因。
乙醇体外诱导肝细胞自噬(A–C). 将Ad-GFP-LC3感染的肝细胞按指示（A中80 mM乙醇）处理6小时，并通过共焦显微镜（A）或免疫印迹分析（C）进行检查。比例尺：20µm。每个实验（n=3）对GFP-LC3点（平均值+SEM）进行量化。(D–E型). Ad-GFP-LC3感染的肝细胞用乙醇（80 mM，D，40 mM，E–F）处理6小时，加入或不加入3-MA（D）或CQ（E，F）。每个实验（n=3）对GFP-LC3点（平均值+SEM）进行量化。对总裂解产物进行免疫印迹分析，并对LC3-II进行密度分析（平均值+扫描电镜）（n=3）。(F类). 肝细胞在William的培养基/10%血清中或在无乙醇或有乙醇的EBSS中培养15小时，并测定长期蛋白质降解（平均值+SEM，n=2-3）。*：p<0.001。
为了进一步研究乙醇促进自噬降解的能力，我们研究了它是否会影响长寿命蛋白质的清除，这些蛋白质通常与一般的非选择性自噬有关9值得注意的是，无论是在基础水平还是在饥饿条件下，乙醇都不会抑制长期蛋白质降解，也不会促进肝细胞中的这种降解(). 这表明，乙醇诱导的自噬体标记物和自噬小体的升高并不是由于抑制了一般的自噬降解。另一方面，缺乏增强的长期蛋白质降解，加上p62/SQSTM1的显著降低()，导致我们怀疑乙醇可能主要诱导选择性自噬过程，其靶向细胞器而非长寿命蛋白质（见下文）。
乙醇通过代谢中间产物、ROS和mTOR抑制诱导自噬
大多数乙醇介导的效应取决于其代谢。乙醇氧化的第一步主要由乙醇脱氢酶（ADH）催化，在较小程度上由细胞色素P450 2E1（CYP2E1）和过氧化氢酶催化。乙醇氧化导致活性氧的生成，特别是通过后两种酶反应。ROS的产生被认为是乙醇诱导病理的主要因素1,三,7我们发现，在ADH和CYP2E1抑制剂4-甲基吡唑（4-MP）或两种抗氧化剂MnTBAP或N-乙酰半胱氨酸（NAC）的存在下，乙醇诱导的GFP-LC3点状物显著减少()表明乙醇诱导的自噬需要乙醇代谢和ROS生成。为了进一步证实这一要求，我们使用了HepG2（一种代谢乙醇能力很弱的人肝癌细胞系）和VL-17A（一种来源于HepG2的细胞系），后者过度表达ADH和CYP2E1并有效代谢乙醇13我们发现乙醇处理显著增加了VL-17A细胞中GFP-LC3点的数量，但在HepG2细胞中没有(). 3-MA可以抑制这种效应()，但在溶酶体抑制剂的存在下进一步增强（数据未显示）。此外，VL-17A细胞中内源性LC3-II和GFP-LC3-II的水平以及游离GFP部分的水平均增加，但HepG2细胞中没有增加(). 因此，乙醇诱导的自噬需要肝细胞中的乙醇代谢和ROS生成。
乙醇诱导的自噬需要乙醇代谢、ROS和mTOR抑制(A类). 用含或不含4-MP、MnTBAP或NAC的乙醇（80 mM）处理Ad-GFP-LC3感染的肝细胞6小时。GFP-LC3点（平均值+SEM）从每个实验中进行量化（n=3）。(B–D类). Ad-GFP-LC3感染的HepG2（B，D）和VL-17A（B，C，D）细胞用乙醇（40 mM，除非另有说明）和其他试剂处理24小时。每个细胞的GFP-LC3点（平均值+SEM）从每个实验（B，C，n=3）和进行的免疫印迹分析（D）中进行量化。(E–F). 按指示处理原代肝细胞6小时，并对总裂解物进行免疫印迹分析。比例尺：10µm（A–B）。*：p<0.05。
mTOR通路是抑制自噬激活的主要调节通路。我们发现，在原代肝细胞中，乙醇导致mTOR的剂量依赖性抑制，表现为磷酸化的p70 S6激酶和4E-BP1（mTOR两个主要下游靶点）的减少(). 有趣的是，这些分子的总水平也降低了，可能反映了mTOR抑制蛋白质合成的结果。乙醇处理小鼠的肝脏中也观察到mTOR的抑制（数据未显示）。值得注意的是，4-MP或NAC的存在可以逆转乙醇对mTOR的抑制作用(). 总之，这些发现支持了乙醇可以通过ROS抑制mTOR活性从而诱导自噬的观点。
抑制自噬增强乙醇诱导的肝细胞凋亡和肝损伤
乙醇能够诱导肝细胞凋亡和肝损伤，但这是轻微的17,18,19自噬可能是限制乙醇毒性的主要保护机制。事实上，当单用乙醇处理时，只有约15%的肝细胞发生凋亡，而3-MA联合处理几乎使凋亡细胞的百分比增加了一倍(). 在乙醇处理的VL-17A细胞中，可以观察到3-MA或Beclin 1特异性siRNA对凋亡和caspase激活的增强作用更强(,S2系列). 另一方面，在这个模型中，乙醇似乎并没有明显促进坏死，尽管自噬可能有独立的作用(图S2).
抑制自噬促进乙醇处理的原代肝细胞和VL-17细胞凋亡(A–B). 原代肝细胞按指示处理（A中80 mM乙醇）并用Hoechst 33342染色。每个实验（n=2）对细胞核破碎或浓缩的细胞（A中的箭头）（平均值+扫描电镜）进行量化。比例尺：10µm。(C类). 按照指示处理VL-17A细胞24小时。细胞凋亡（平均值+扫描电镜）如（A）所示（n=2）。(D–F型). 按照指示处理VL-17A细胞（80 mM乙醇）24小时。用免疫印迹法（D）分析Beclin 1的表达。测定细胞凋亡水平（E）和caspase活性（F）（平均值+SEM，n=2）。*：p<0.05。
此外，通过血液ALT水平、肝脏caspase-3活性和TUNEL染色检测，CQ预处理小鼠显著增强乙醇诱导的肝损伤(,第3章). 为了证实CQ增强的肝损伤与自噬相关的特异性，我们用抗Atg7的特异性siRNA对小鼠进行预处理，这有效地降低了肝脏Atg7表达(). 随后的酒精狂欢暴露导致LC3-II水平降低和自噬体形成()、提高血液ALT和肝脏caspase活性(). 总的来说，虽然乙醇单独导致血液中ALT水平增加约3-5倍，但在乙醇治疗期间抑制自噬导致血液中的ALT水平额外增加3倍或更多()尽管实质发生了明显的改变，但细胞死亡的可能性很小(图S4–S5). 因此，这些发现表明自噬在限制乙醇诱导的细胞损伤中发挥了积极作用。
抑制自噬增强乙醇诱导的肝损伤(A–B). 按照指示处理野生型小鼠（n=4-6），并分析血液ALT水平（A）和肝脏caspase-3活性（B）（平均值+SEM）。(C–F类). 野生型小鼠被给予对照组或Atg7特异性siRNA 48小时，然后用乙醇再治疗16小时。对肝脏进行免疫印迹测定（C）、EM（D）和胱天蛋白酶-3活性测定（F），同时分析血液中的ALT水平（E）。数据（平均值+扫描电镜）由每只小鼠（n=3）测定。在C中，每条车道代表一个样本，星号表示非特定带。*：p<0.05。
乙醇诱导的自噬对线粒体和脂滴具有选择性
为了了解自噬对乙醇诱导的肝细胞损伤的保护机制，我们研究了乙醇诱导的自噬的性质。上述研究表明，乙醇主要能诱导选择性自噬(,). 我们通过EM观察到，肝脏中乙醇诱导的自噬体中有相当一部分含有线粒体，用CQ预处理后线粒体进一步增加(). 这些有丝分裂小泡在乙醇存在下培养的原代肝细胞中特别明显(). 被吞噬的线粒体似乎被破坏了()，并且看起来比未折叠的线粒体小得多()，这表明它们可能已经支离破碎。
乙醇诱导有丝分裂(A类). 野生型小鼠（n=3-4）按指示进行治疗。显示了含有线粒体的自噬体的典型肝脏EM图像，并对数据（平均值+SEM）进行了量化。(B类). 用载体对照（a）或乙醇（b）处理原代肝细胞6小时，并用EM进行检查。c组从b组的方框区域扩大。箭头表示含有碎片线粒体的自噬体。M：线粒体；N： 原子核。(C–F类). 按照指示处理Ad-GFP-LC3感染的原代肝细胞6小时并成像（C）。面板C-g和C-k分别从面板C-f和C-j的装箱区域扩大。箭头表示包含线粒体的选定GFP-LC3环结构，这些结构被量化（平均值+SEM）（来自每个实验（n=3）D–F）。比例尺：0.5微米（A）、1微米（B）、20微米（C）。*：p<0.05。除非另有说明，否则乙醇的用量为80 mM。
在未经治疗的原代肝细胞中，感染腺病毒-GFP-LC3并负载线粒体追踪红（MTR）20，很少有GFP-LC3点状结构，线粒体呈正常的球形形态(,面板a–c). 乙醇处理显著增加了GFP-LC3阳性点状结构，其中一些与MTR信号共定位(). 更重要的是，被GFP-LC3环吞噬的线粒体似乎比未剥落的线粒体小，这意味着它们可能是碎片，这与EM分析一致(). 定量分析表明，乙醇处理的肝细胞中与MTR共定位的GFP-LC3点状物数量呈剂量依赖性增加()，并且可以通过CQ的存在进一步加强(). 事实上，通量分析表明，乙醇处理显著增加了含有自噬体的线粒体的合成和降解(,表S1). 总之，这些观察结果表明，乙醇促进线粒体的自噬降解，即有丝分裂。此外，4-MP或NAC可抑制该过程()支持乙醇代谢和活性氧在促进有丝分裂中的作用。
乙醇诱导的肝脏病理学的另一个重要特征是微泡脂肪变性1,2,5，被认为是致病性的。通过使用脂质结合化合物Bodipy 581/591-C11()或车身493/503(图S6)，我们证实了酒精狂饮治疗小鼠肝脏中脂质的积累。此外，发现GFP-LC3点状或环状结构与体阳性脂滴（LD）共定位()提示脂类吞噬的激活，或脂滴的自噬清除。虽然完全被GFP-LC3环（模式I）包围的LD很少见，但与一个（模式II）或多个（模式III）GFP-LC三点接触的LD更常见().
调节自噬影响乙醇诱导的肝脂肪变性(A类). GFP-LC3转基因小鼠按指示治疗16小时。肝细胞切片用Bodypy 581/591-C11染色。(B类). 放大的图像表示GFP-LC3和Body581/591-C11信号（箭头）的三种关系，如图所示。(C–D类). GFP-LC3转基因小鼠（n=3-5）按指示治疗16小时。肝脏冰冻切片用Bodypy 581/591-C11（C）染色。对每个细胞的GFP-LC3点（a）、每个细胞的体阳性脂滴（b）和肝甘油三酯水平（c）（平均值+扫描电镜）进行量化（D）。(E类). 野生型小鼠（n=3）按指示进行治疗。通过EM检查肝脏样品，并定量每个细胞的LD数量（平均值+SEM）。(F类). 野生型小鼠（n=3）用对照或Atg7-特异性siRNA治疗48小时，然后用乙醇治疗16小时。通过体染色（a）或EM（b）测定肝脏中每个细胞的LD数和肝甘油三酯水平（c）（平均值+SEM）。比例尺：20微米（A–C），2微米（E）。*：p<0.05
为了确定自噬是否在乙醇治疗后的肝脏脂质稳态控制中起到功能性作用，我们用雷帕霉素对小鼠进行预处理，并根据Bodypy染色发现这显著减少了乙醇治疗的肝脏中LDs的数量()和EM分析()以及肝细胞的微泡变化(图S4). 相反，CQ阻断溶酶体功能可显著增加LD的数量()和组织学改变(图S4). 因此，CQ预处理进一步增加了因乙醇处理而升高的总肝甘油三酯水平，但雷帕霉素预处理大大降低了总甘油三酸酯水平(). 我们通过敲低肝脏中的Atg7，证实了这些药理学调节在自噬调节方面的作用的特异性。这些小鼠的自噬体数量大大减少()，LD数量显著增加()和增加的微泡变化(图S5)酒精狂饮治疗后。与此相一致，肝甘油三酯水平显著升高(). 这些发现表明，通过选择性自噬过程去除脂滴在减轻乙醇诱导的肝脂肪变性以及由此引起的损伤方面发挥了重要作用2,5,8.
讨论
急性乙醇治疗激活选择性自噬过程
本研究表明，急性乙醇暴露强烈诱导自噬体合成，并促进选择性自噬过程，以清除受损线粒体和肝脂滴。合成增加的证据基于自噬体数量和大小的增加，以及自噬标记LC3的阳性变化。3-MA抑制GFP-LC3斑点水平的增加，Atg7 siRNA抑制LC3-II的形成和自噬体数量的增加，表明这些事件是响应上游自噬信号而诱导的。
一些证据也支持乙醇处理导致通过溶酶体的自噬降解增加，而不是减少。乙醇不能抑制肝细胞在基础状态或饥饿状态下的一般自噬()或在VL-17A电池中(图S7). CQ联合治疗可进一步促进乙醇促进LC3-II和LC3点的形成以及自噬体的生成。尽管并非没有其自身的局限性，通量分析(表S1)证实乙醇存在下自噬降解增强，基于LC3点、重膜部分LC3-II形成和自噬体数量。值得注意的是，当分析与线粒体相关的一组更为特殊的自噬体时，乙醇引起的降解更为明显。
最后的观察结果表明，乙醇可以特别激活针对特定底物的自噬，即选择性自噬过程。一直以来，乙醇没有促进长期蛋白质降解，这在非选择性全身自噬中常见(,第7部分). 相反，乙醇确实促进了p62/SQSTM1的降解()与选择性自噬相关的关键适配器分子16.p62/SQSTM1与LC3和泛素化自噬底物结合，因此它们可以被自噬体吸收降解。
选择性自噬的激活或失活可能不会影响非选择性自吞噬靶点的降解，例如长寿命蛋白质21亚细胞器是选择性自噬的主要靶点16它可以被激活以响应这些细胞器的变化。值得注意的是，乙醇毒性的一个主要靶点是线粒体。急性或慢性乙醇治疗后，肝细胞中观察到线粒体的功能和结构改变三,22受损的线粒体可能触发自噬，并成为自噬的靶点。事实上，基于荧光和电子显微镜，我们发现乙醇处理诱导了受损和碎片线粒体的显著自噬吞噬()表明有丝分裂激活。
另一种受选择性自噬影响的亚细胞器是脂滴，乙醇处理的肝脏中脂滴显著升高。最近发现，在脂质代谢异常的肝细胞中，自噬在控制脂质积聚方面很重要23我们证明了存在选择性自噬去除脂滴（脂吞噬），主要基于LC3和Bodypy的双重染色()脂滴和肝甘油三酯水平的定量()以及肝脏微泡变化的组织学观察(图S4–S5)在多种条件下调节自噬，包括药物和分子干预。在电子显微镜下，很少直接观察到脂滴被经典的自噬体完全吞噬。这可能是因为大尺寸的脂滴只能被自噬体部分吞噬23的确，如前所述，可以观察到自噬体/脂滴相互作用的几种模式23脂滴和自噬体膜之间相互作用的动力学在未来的研究中将是一个有趣的领域。
综上所述，我们的研究提供了强有力的证据，表明急性乙醇暴露会激活对受损线粒体和积聚的脂滴的选择性自噬，并通过溶酶体促进其降解。
乙醇诱导自噬需要乙醇代谢和活性氧
乙醇诱导的病理学需要乙醇代谢1,2我们发现乙醇诱导的自噬依赖于乙醇代谢，因为它可以被ADH和CYP2E1抑制剂4-MP抑制。一致地，乙醇诱导的自噬仅在用ADH和CYP2E1重组的VL-17A细胞中观察到，但在缺乏这些酶且无法有效代谢乙醇的亲代HepG2细胞中没有观察到。
乙醇处理产生的活性氧是自噬诱导的主要原因，因为抗氧化剂NAC和MnTBAP可以抑制自噬(). 乙醇诱导的活性氧可能来自多种来源，其中CYP2E1氧化乙醇是主要来源7此外，线粒体中乙醛的氧化导致NADH的增加，其再氧化也有助于急性乙醇诱导的线粒体ROS生成三此外，反复饮酒可导致线粒体DNA合成、呼吸障碍和活性氧生成发生显著变化22。在未来的研究中，进一步确定这些事件在自噬诱导中的个体重要性将是有益的，因为它们可能构成额外的监管检查点。
在其他情况下，氧化应激与自噬的诱导有关，其中线粒体被怀疑是ROS的来源24,25ROS如何触发自噬尚不完全清楚。一种可能性是ROS损害Akt/mTOR途径25.mTOR是一种定义明确的自噬负调控因子26我们的研究结果支持急性乙醇暴露通过ROS依赖的mTOR活性抑制诱导自噬。早期的一项研究确实发现，急性乙醇摄入抑制了Akt的激活6.Akt是mTOR的主要上游激活剂。因此，Akt活性降低可能导致mTOR活性降低，激活自噬26然而，我们的研究并不排除ROS可以通过其他机制诱导自噬，这应该在未来进行探索。
自噬可以通过清除受损线粒体和积累的脂肪酸减轻乙醇诱导的肝毒性
体内乙醇诱导的细胞死亡很轻微，导致大多数急慢性治疗模型的血液ALT适度升高，但没有明显的组织学改变，除非存在其他易感因素(,S4–S5系列)2,4,17–19,27我们的研究结果表明，自噬为乙醇诱导的损伤建立了一个重要的阈值，因为抑制自噬会显著增加肝细胞凋亡。似乎肝脏中的功能性自噬对于避免乙醇代谢的病理影响很重要，如果没有这种保护机制，酒精的有害影响可能会显著放大。自噬促生存作用的一般分子机制尚不完全清楚，但我们的研究表明，急性乙醇治疗期间的自噬保护可能通过去除受损线粒体和脂滴来介导。在营养剥夺和胰高血糖素治疗期间，线粒体的自噬降解在肝细胞中得到了很好的识别28然而，线粒体吞噬可能更可能参与抑制与受损线粒体相关的有害影响28有丝分裂的一个关键好处是清除活性氧的一个重要来源，活性氧与肝细胞对细胞损伤和死亡的敏感性有关2,三,5,22,28因此，可以想象，受损线粒体的自噬降解是乙醇毒性保护机制的一部分。
脂肪变性是急性或慢性乙醇治疗的常见特征1,2,5肝细胞脂肪变性虽然在乙醇戒断后是可逆的，但现在被认为对随后的ALD病理变化很重要，如细胞死亡、炎症和纤维化5,8我们的研究表明，自噬对乙醇诱导的脂肪变性有很大影响。因此，我们认为脂吞噬是自噬防御系统对抗乙醇诱导的肝损伤的一个组成部分。活性氧引起的细胞损伤的一个关键组成部分是脂质过氧化，它可以损伤细胞膜并产生自由基的脂质衍生物，如4-羟基壬醛和丙二醛，这些自由基反过来可以介导二次损伤，促进更多的活性氧生成和炎症1,2,5,7,8细胞多不饱和脂肪酸的水平影响脂质过氧化的水平，并且可能与通过甘油三酯水解和游离脂肪酸与甘油酯化的平衡在细胞中积累的脂滴（包含甘油三酸酯）的水平成比例。因此，脂类吞噬可以通过清除脂滴间接降低游离脂肪酸的水平。
总之，本研究证明自噬可以保护乙醇诱导的肝细胞凋亡和肝损伤。这种保护可以通过去除受损线粒体和积累的脂肪酸来介导，从而减少ROS的主要来源和主要靶点/放大器。这些发现表明，肝脏中适当的自噬能力可能对减少乙醇摄入的有害影响至关重要，增强自噬可能是减轻酒精性肝病相关病理的一种可能的治疗策略。
确认
作者感谢日本东京医学和牙科大学的N.Mizushima博士提供了GFP-LC3转基因小鼠，以及匹兹堡大学的M.Sun女士在EM方面的技术帮助。
赠款支持
NIH（X.-M.Y.：R01 CA83817，R01 CA111456；D.L.C.：R01 AA11291，W.-X.D.：R21 AA017421）和VA部门（D.L.C）提供部分支持。
缩写
| 3-MA公司 | 3-甲基腺嘌呤 |
| 400万像素 | 4-甲基吡唑 |
| ADH公司 | 乙醇脱氢酶 |
| CYP2E1型 | 细胞色素P450 2E1 |
| CQ公司 | 氯喹 |
| 相对长度单位 | 电子显微镜 |
| 劳埃德 | 脂滴 |
| 地铁 | MitoTracker红色 |
| NAC公司 | N-乙酰半胱氨酸 |
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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