特殊氨基酸谷氨酰胺的膜转运蛋白：结构/功能关系及其与人类健康的相关性

摘要

介绍

谷氨酰胺在哺乳动物细胞代谢中的关键作用已得到公认。除了葡萄糖，谷氨酰胺是维持体内平衡的主要营养素（Bode，2001; Newsholme等人。，2003; McGivan和Bungard，2007). 因此，必须调节并保持谷氨酰胺血浆浓度恒定。谷氨酰胺是最丰富的氨基酸：胞内浓度为2至20 mM，胞外浓度为0.2至0.8 mM（Bode，2001; Newsholme等人。，2003). 它涉及许多细胞过程，其中最重要的过程如图所示​图1。1谷氨酰胺是不同组织中蛋白质、氨基糖、嘌呤和嘧啶合成的前体；它对肾脏的酸碱缓冲至关重要，是NH的最重要供体_三通过尿液排泄（Busque和Wagner，2009; Verrey等人。，2009). 有趣的是，在肾脏和肝脏中，谷氨酰胺的碳骨架进入参与糖异生的TCA循环。通过该途径产生的葡萄糖量占循环葡萄糖的25%，在糖尿病情况下会增加（Stumvoll等人。，1999; Curi等人。，2005; Daye和Wellen，2012). 谷氨酰胺也是肠道的燃料，在维持肠道完整性方面起着额外的作用。一些报告表明，谷氨酰胺的服用有助于从病理状态中恢复肠道完整性（Ziegler等人。，2000). 在肝脏中，谷氨酰胺为尿素循环提供氮原子，尿素循环是一种划分在细胞质和线粒体之间的代谢途径（Indiveri等人。，1994). 在大脑中，除了作为NH清除剂的作用外_三，谷氨酰胺参与谷氨酰胺/谷氨酸循环，谷氨酰胺是由突触间隙重新吸收的谷氨酸合成的（Broer和Brookes，2001; Bak等人。，2006; Conti和Melone，2006). 谷氨酰胺参与维持GSH/GSSG比值的氧化还原电位平衡。谷胱甘肽的合成需要甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸，后者通过谷氨酰胺酶作用从谷氨酰胺中获得（Shanware等人。，2011; Daye和Wellen，2012); 此外，谷氨酰胺进入TCA循环，产生还原当量NADPH，用于增加GSH/GSSG比率（Curi等人。，2005). 谷氨酰胺与胰岛β细胞分泌胰岛素有关，谷氨酰胺刺激葡萄糖氧化，从而增加ATP/ADP比率。这一事件导致膜去极化并导致细胞内钙的增加²⁺水平，从而胰岛素释放（Newsholme等人。，2003). 最后，谷氨酰胺的一个重要作用是调节参与信号转导、代谢、细胞增殖、细胞防御和修复的几个基因（Curi等人。，2005)（图​（图1）。1). 总之，这些信息强调了谷氨酰胺对细胞代谢和功能有急性和慢性影响。因此，即使谷氨酰胺可以内源性合成，也必须被视为“必需的”。事实上，患有严重疾病（艾滋病毒感染、肌肉疾病和化疗副作用）的患者可以利用谷氨酰胺补充剂。相反，最近人们对健康个体富含谷氨酰胺的饮食提出了一些担忧。因此，需要进一步研究来澄清这些观点（Holecek，2013). 谷氨酰胺对细胞代谢的重要性也通过其在病理状态中的作用得到了证明：事实上，癌细胞对氨基酸有特殊的需求，例如谷氨酰胺、精氨酸和亮氨酸，正如“谷氨酰胺转运体在人类病理学中的作用”一节所述，这些氨基酸是主要需要的从所描述的场景中可以看出，从饮食中吸收谷氨酰胺、肾脏再吸收和输送到不同组织的过程是至关重要的，必须很好地协调。因此，不同的运输系统应该协同工作，使这种特殊氨基酸发挥其所有功能。

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图1

谷氨酰胺在细胞途径中的作用涉及谷氨酰胺的细胞过程示意图。蛋白质，蛋白质合成；氨基糖，氨基糖合成；核苷酸、嘌呤和嘧啶的合成；pH稳态，维持酸碱平衡；糖异生，前体合成；能量，为TCA提供碳原子；尿素，NH释放_三在肝脏中进行尿素合成；Gln/Glu循环与GABA、神经递质调节；谷胱甘肽、GSH合成与氧化还原平衡调节；胰岛素分泌、葡萄糖浓度调节；基因表达，基因表达调控。

谷氨酰胺转运体：从功能到分子分类

谷氨酰胺转运过程由许多膜转运蛋白保证，这些膜转运蛋白对谷氨酰胺具有共同的特异性，但在转运模式上表现出差异。谷氨酰胺的多效性作用可能是谷氨酰胺转运体（属于几个蛋白质家族）冗余且普遍存在的原因（图​（图2）。2). 这些蛋白质通常对几种中性氨基酸具有特异性，因此它们的分类及其功能鉴定并不明确。这些转运蛋白的分类最初是基于功能特性，如底物特异性、离子和pH依赖性、动力学和调节特性。这种最初的分类导致了“系统”中的集群。系统A和系统L是第一个被如此定义的，分别表示“丙氨酸提呈”和“亮氨酸提呈，”（Oxender和Christensen，1963). 这些系统包括一个甚至多个转运蛋白，由于很难区分整个细胞中的单个功能，因此还没有被确定为特定蛋白质。

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图2

谷氨酰胺转运网络上皮极化细胞（顶端膜被描绘成刷状边界；基底外侧膜与血液接触）和其他细胞之间的相互作用。图中用不同颜色表示谷氨酰胺转运体。箭头表示谷氨酰胺从（红色）或流向（蓝色）血液或从内腔流向上皮细胞（蓝色）；黑色箭头表示钠通量；灰色箭头表示其他氨基酸和质子通量。描述了简化的细胞溶质和线粒体途径：谷氨酰胺的合成（在脑和其他组织中）、TCA、进入TCA（肠和肾小管）的谷氨酰胺、TCA中间体（大脑和其他组织）或谷氨酰胺（肝）的谷氨酸合成、尿素循环（肝）。

多年来，采用了一种广泛的分类方法，将Na与⁺-依赖和Na⁺-独立系统（Bode，2001). 基于对其他氨基酸、抑制剂和转运模式（如对谷氨酰胺、组氨酸和天冬酰胺表现出窄特异性的系统N）的特异性，描述了几种共享谷氨酰胺特异性的转运蛋白（Schioth等人。，2013)系统ASC对丙氨酸、丝氨酸和半胱氨酸具有特异性，系统B0对中性氨基酸具有广泛特异性。在Na中⁺-依赖性转运体，最好描述的是属于系统A和N的转运体、属于系统ASC的ASCT2转运体和属于系统B0的B0AT1转运体。

在Na中⁺-独立转运体LAT1和LAT2属于系统L，是最具特征的。然而，其他一些鲜为人知的转运体与谷氨酰胺稳态的关系尚不明确。这些小型运输车将在以下章节中进行一定程度的讨论。用于区分不同转运体的另一个特征是对钠的替代耐受性高（如系统N）或低（如ASCT2）⁺作者：Li⁺然而，2003年，Mackenzie等人建议⁺公差不是就其本身而言这是对氨基酸转运蛋白进行分类的有用标准，因为在某些情况下，它取决于膜电位和实验中使用的参数（Mackenzie等人。，2003). 此外，转运蛋白可以通过对氨基酸的不同特异性和对抑制剂的敏感性来表征；例如，系统A和系统L可以分别通过对氨基酸类似物MeAIB和BCH的响应进行功能识别。尽管抑制剂允许跟踪特定蛋白质的转运反应，但不包括其他转运蛋白的转运反应。对于氨基酸转运蛋白，由于细胞中谷氨酰胺转运蛋白的冗余性和广泛特异性，这一标准并不明确。

随着氨基酸转运蛋白编码基因的鉴定和全基因组测序的进展，应考虑到序列相似性和与特定蛋白质家族对应的基序的存在，修订谷氨酰胺转运蛋白的分类。SLC命名法可能有助于对转运蛋白进行更结构化的聚类。一些评论已经提到了基于SLC的氨基酸转运蛋白分类（Mackenzie和Erickson，2004; Hagglund等人。，2011; Bodoy等人。，2013; El-Gebali等人。，2013; Fotiadis等人。，2013; Kanai等人。，2013; Pramod等人。，2013; Rask Andersen等人。，2013).

关于SLC，谷氨酰胺转运体的分类稍微复杂一些，因为在某些情况下，它们与具有不同化学性质的氨基酸的转运体同源。由于这些原因，由于功能相似性和氨基酸序列相似性之间存在一些差异，功能分类与序列相似性分类并不完全匹配。SLC之前被McGivan和Bungard用于谷氨酰胺转运体，以及与特定转运体相关的不同名称（McGivan和Bongard，2007). 表​表11恢复了谷氨酰胺转运体的两种分类。这些转运蛋白显示的不同转运模式决定了它们在不同组织和极化膜中的作用（图​（图2）。2). 因此，Na⁺-依赖性同向转运体利用电化学梯度在上皮细胞中高效吸收谷氨酰胺；这使得氨基酸的净积累可以对抗跨膜梯度。反转运蛋白发挥调节特定组织（如神经元亚型）中谷氨酰胺和其他氨基酸或质子库之间平衡的功能；这些转运蛋白还允许谷氨酰胺从特定组织流出。一些谷氨酰胺转运体与辅助蛋白的相互作用已被描述。就谷氨酰胺转运体LAT1和LAT2而言，似乎辅助蛋白是转运活性复合物的一部分，或者至少对稳定蛋白进入质膜很重要（Costa等人。，2013; Rosell等人。，2014). 我们期望有越来越多的证据表明谷氨酰胺转运体与其他蛋白质相互作用以达到调节目的。事实上，谷氨酰胺转运体的调节对于实现其体内平衡至关重要，同时也应对细胞内和细胞外谷氨酰胺水平的变化。然而，迄今为止，关于这一主题的信息相对较少。

谷氨酰胺转运蛋白的功能最初主要在过度表达转运蛋白的细胞系统中进行研究。谷氨酰胺转运体知识的重大进步源于人工系统的研究，该系统具有排除其他转运体和/或细胞酶干扰的重要优势。在这些系统中，首先重建了从模型动物中提取的天然转运蛋白（Oppedisano等人。，2004; Oppedisano和Indiveri，2008). 目前最有希望的方法是在微生物中异源表达人类转运体亚型。到目前为止，已有三种谷氨酰胺转运体在大肠杆菌或者在酵母中巴氏杆菌有趣的是，所有这些都同时发生（Costa等人。，2013; Galluccio等人。，2013; Pingitore等人。，2013)，制定基本战略（图​（图3）三)以进一步提高对谷氨酰胺转运体功能和结构的认识。

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图3

膜转运蛋白异源过度表达的工作流程不同质粒/细胞组合菌株（白点）筛选示意图：如果野生型基因筛选不成功，应采用密码子偏向策略。因此，通过优化高产表达条件来选择最佳质粒/细胞株组合（红点）。当达到这一结果时，应用纯化程序进行结构和功能研究。这些策略允许大规模筛选潜在药物或外源性药物。

在以下段落中，根据最近对谷氨酰胺转运体（Bode，2001; McGivan和Bungard，2007).

SLC1A5：ASCT2

结构方面

尽管哺乳动物的生理作用不同，SLC1家庭成员具有共同的结构特征。原始同源物的三维结构SLC1家族，Gltph来自P.horikoshii先生通过X射线晶体学（Yernool等人。，2004). Gltph的结构具有三体结构，形成水腔。2007年，同一小组在存在底物和竞争抑制剂的情况下解决了结构问题（Boudker等人。，2007)打开了与底物和抑制剂对接分析的可能性。每个原聚体是一个独立的转运单位，由八个跨膜结构域和两个发夹环（HP1和HP2）组成，被认为负责底物转运，是转运蛋白的活动部分（Boudker等人。，2007; Reyes等人。，2009).

2010年建立了大鼠ASCT2的第一个同源模型（Oppedisano等人。，2010)随后，其他人证实了谷氨酰胺转运体的假定结构（Albers等人。，2012; Zander等人。，2013). 最近，对人类直系亲属进行了建模（Pingitore等人。，2013). 人类和大鼠ASCT2的同源模型如图所示​图4。4尽管两个同源蛋白质之间的序列同源性为79%，但如模型所示，在局部延伸（aa 200–229）中发现了极低的同源性（14%）（图​（图4A）。4A级). 预测该区域的定位在底物结合位点附近（Oppedisano等人。，2010). 同源模型中报告了两个推测的糖基化位点（人类为N163、N212，大鼠为N164、N215），这两个位点被保守并暴露在细胞外表面，与膜中蛋白质的建议方向一致（图​（图4B4B类).

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图4

ASCT2人和大鼠转运体的同源模型通过Modeler 9.13软件（Sali和Blundell，1993)使用谷氨酸转运体同源物的结构（PDB1XFH）作为模板P.horikoshii先生（Glpth）。为了运行该软件，ClustalX2软件使用.pir输出格式对齐序列。通过Spdbv 4.1.0计算模型比较的RMSD。VMD 1.9.1对大鼠和人体结构模型进行叠加。（A）人类蛋白质（透明）在bleu中包含一个可变环，大鼠蛋白质（紫色）包含一个红色的可变环。CXXC金属结合基序的Cys残基仅存在于大鼠蛋白质中，以黄色突出显示。（B）人类蛋白质呈灰色；老鼠在布鲁。这两种蛋白质的假定糖基化位点以红色突出显示。两种同源蛋白质共同的半胱氨酸残基以浅绿色突出显示。仅存在于大鼠蛋白质中的其他Cys残基以黄色突出显示。大鼠和人类蛋白质的N端和C端几乎一致，并以单个N和C突显。

两个直系图之间的另一个相关差异是半胱氨酸的数量。8个Cys残基在这两种蛋白质中都是保守的，而大鼠亚型含有额外的8个Cy残基。其中两个残基（C207和C210）在大鼠ASCT2中形成人类亚型中缺失的CXXC金属结合基序。蛋白质脂质体的功能/结构关系研究强调了Cys残基在底物转运中的重要性，而底物转运被特定的Cys试剂有效抑制。有趣的是，ASCT2包含两个发夹，即HP1和HP2，它们对底物易位很重要（Pingitore等人。，2013). 这一发现表明，尽管ASCT2通过反转运模式发挥作用，但其转运机制可能与Glpth相似。因此，需要额外的约束来耦合反向的基板传输。

SLC6A19:B0AT1型

结构方面

根据蛋白质相似性，B0AT1显示LeuT折叠。影响底物亲和力的主要性质包括：带电荷的氨基和羧基的存在、α-碳的L构型（而非D-）、净中性电荷、尺寸，以及在较小程度上侧链的疏水性（Yamashita等人。，2005). 由于预测的与疏水囊相互作用，无电荷氨基酸受到青睐。B0AT1具有与LeuT相似的底物特异性，但色氨酸除外，色氨酸仅由B0AT1弱转运（Camargo等人。，2005; Yamashita等人。，2005; 布罗尔，2006; O'mara等人。，2006). 另一个区别是2Na的共转运⁺在LeuT的情况下，只有1 Na⁺由B0AT1共同运输。秒秒Na的作用⁺-B0AT1中的结合位点尚不清楚。同源模型强调了与功能相关的结构不对称性，并解释了一些突变体功能丧失的结构基础（Broer，2008,2009).

最近，多巴胺转运体黑腹果蝇（PDB 4M48）已结晶并在2.95℃分解（Penmatsa等人。，2013). 与LeuT转运体（18%）相比，B0AT1与多巴胺转运体的比对具有更高的同源性（33%），因此可以获得更准确的建模。大鼠和人类结构模型的叠加（0.43ºRMSD）表明，这两个直系图非常相似（图​（图5），5)正如预期的那样，人类和大鼠蛋白质之间87%的一致性与ASCT2不同（图​（图4A）。4A级). 这种相似性与两个直向同源物的相似功能特性密切相关。

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图5

B0AT1人和大鼠转运蛋白的同源模型如图所示，构建了大鼠（灰色）和人类（蓝色）B0AT1的同源结构模型​图44以多巴胺转运体的结构为模板D.黑腹果蝇（PDB 4M48）。通过Spdbv 4.1.0计算模型比较的RMSD。VMD 1.9.1对大鼠和人体结构模型进行叠加。假定的糖基化位点以红色突出显示；金属结合基序的半胱氨酸残基以黄色突出显示；PKC磷酸化位点以绿色突出显示。大鼠和人类蛋白质的N端和C端几乎一致，并以单个N和C突显。

数据库分析（ExPASy PROSITE，http://www.expasy.ch/prosite)SLC6A19氨基酸序列中的调控位点预测为5个N个-糖基化位点。同源模型中报告了三个（N158、N182、N258）（图​（图5）。5). 其他的不存在，因为含有这些残基的区域332-377无法建模。根据预测的方向，糖基化位点向细胞外侧突出。SLC6A19序列还包含一个用于磷酸化的保守细胞内共识位点（S100）（图​（图5）5)众所周知，它可以调节各种渠道和运输工具（Bohmer等人。，2010). 此外，图​图55强调了转运蛋白中间存在两个保守的金属结合基序，CXXC（含C200/C203）和CXXXC基序（含C45/C49）。第一个位置靠近膜面，远离假设的底物结合位点；秒秒位于蛋白质核心，靠近底物结合囊。金属结合位点与重金属与转运蛋白的相互作用密切相关，如下所述（Oppedisano等人。，2011).

SLC6A14:ATB0型^,+

SLC6A14型是ATB的分子对应物^0,+属于系统B⁰⁺.hATB0^,+是B系统第一个克隆的氨基酸转运蛋白^0个+（斯隆和马格尔，1999). 在结肠、肺中表达（Sloan等人。，2003)眼睛（Ganapathy和Ganapathi，2005)和乳腺（Nakanishi等人。，2001)（表​（表1）。1). 这是一种广泛的特异性转运体，可识别亲和力相对较低的谷氨酰胺（Bode，2001)Km 0.6 mM（斯隆和马格尔，1999)以及其他中性和阳离子氨基酸，也包括肉碱和肉碱衍生物。因此，它可以被认为是一种次要的谷氨酰胺转运体。ATB催化的运输^0,+依赖于钠⁺和Cl⁻跨膜梯度，对膜电位敏感。2钠⁺和1 Cl⁻参与运输（Nakanishi等人。，2001). 与ASCT2、ATB0相同^,+可能在癌症中上调，以满足日益增长的精氨酸需求（Gupta等人。，2005,2006)代表了癌症治疗的潜在目标（Karunakaran等人。，2011). 在这个意义上，选择性阻滞剂甲基-DL-色氨酸（α-MT）或BCH酸可能是药物设计的重要化学支架（Sloan和Mager，1999).

SLC6A15:B0AT2型

2006年证明小鼠v7-3基因由于与B0AT1的高度相似性而编码中性氨基酸的转运蛋白B0AT2（Broer，2006)（表​（表1）。1). 结果表明，B0AT2介导Na⁺-依赖性摄取亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸和具有极低亲和力的谷氨酰胺。化学计量为1 Na的输运是电生的⁺：1氨基酸。除肾脏外，在小脑和大脑中也有高表达。这种定位表明B0AT2可能主要参与向神经元提供神经递质前体。事实上，来自亮氨酸的氮被转移到氧戊二酸盐中形成谷氨酸；异亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸可以代谢为succynil-CoA，用于谷氨酸的生物合成。因此，B0AT2在谷氨酰胺稳态中的作用微乎其微。

SLC7家族的谷氨酰胺转运体

重要的谷氨酰胺转运体属于SLC7系列由13个成员组成的家族分为两个亚组：阳离子氨基酸转运蛋白（CATs）和异二聚氨基酸转运蛋白的氨基酸转运蛋白轻亚基（LATs）。这里将提供一些一般信息，以强调属于该家族的谷氨酰胺转运体的特性。HAT和CAT起源于一个具有12个跨膜结构域（TMD）的共同祖先，其复制了最后两个TMD，形成了14个TMD结构（Verrey et al。，2004; Hansen等人。，2011; Fotiadis等人。，2013). 只有HAT组包括谷氨酰胺转运体。它们介导广泛底物的强制性反转运（Fotiadis等人。，2013). HAT出现在后生动物中，是由两个不同亚单位组成的转运蛋白的少数例子之一。HAT的轻亚单位LAT被称为糖蛋白相关氨基酸转运蛋白，因为它们通过保守的二硫键与属于SLC3家族的重亚单位结合（Broer和Brookes，2001; Wagner等人。，2001; 帕拉辛和卡奈，2004). 这是一个非常小的II型膜糖蛋白家族（细胞外有C-ter），分别由SLC3A1和SLC3A2组成，命名为rBAT和4F2hc。SLC3蛋白的主要功能是将转运体传递到质膜，形成HAT复合物。4F2hc（细胞表面抗原重链4F2）是一种多功能蛋白质，除了运输外，还参与免疫系统调节、细胞活化、生长和粘附（帕拉辛和卡奈，2004; 康托和金斯伯格，2012; Fotiadis等人。，2013). 此外，4F2hc被认为在将该蛋白与人类恶性肿瘤联系起来的整合素信号传递和激活中发挥作用（Cantor和Ginsberg，2012).

到目前为止，已有6个人类光亚基被鉴定为4F2hc的伴侣：LAT1、LAT2、y+LAT1，y+LAT2，asc1和xCT，均属于SLC7系列家庭。这种广泛的相互作用证明了4F2hc的普遍表达以及与其完全丧失相关的病理学缺失是合理的，这实际上与生命不相容（帕拉辛和卡奈，2004). 有趣的是，已经报道了与葡萄糖转运蛋白GLUT1形成的异二聚体复合物，证实了4F2hc在一般转运机制中的调节作用（Ohno等人。，2011). 如上所述，LAT和重链之间的主要相互作用是通过二硫键形成的；然而，这并不是必需的，因为Cys突变并不能完全消除膜中HAT的存在（Pfeiffer等人。，1998; Broer等人。，2001; 帕拉辛和卡奈，2004; Franca等人。，2005; Rosell等人。，2014). 以下段落涉及参与谷氨酰胺处置的SLC7成员。

SLC7A5:LAT1型

SLC7A8:LAT2型

LAT1和LAT2的结构方面

帽子似乎由一条轻链组成(SLC7A5-11型)有12个推测的TMD，N和C末端位于细胞内，C末端位于胞外的重链（Verrey等人。，2004; Costa等人。，2013). 如上所述，轻链的12 TMD与CAT转运蛋白的前12 TMD表现出相当大的相似性。重链4F2hc是一种具有一个跨膜结构域的N-糖基化蛋白质（4个假定的N-糖基化位点：N264280323405）。人类4F2hc胞外结构域的结构已通过X射线衍射（Fort等人。，2007). 相反，人类LAT的结构尚不清楚，但Cys扫描突变表明，TMD III和IV之间的Cys残基是保守的，负责与重链的亚单位二硫键之间的桥。LAT与精氨酸/胍基转运体AdiC、广谱氨基酸转运体ApcT和谷氨酸/γ-氨基丁酸转运体AdiC具有显著的相似性大肠杆菌其结构已通过X射线晶体学解决（Shaffer等人。，2009; Ma等人。，2012). 最近的一项研究证实了LAT1的这一假设，即Na的作用是一种易位机制⁺被具有交替传输机制的质子模拟（Forrest等人。，2011; 盖尔等人。，2013). 该模型的可用性允许筛选潜在抗肿瘤药物并进行分子对接，揭示了LAT1的新底物（Geier等人。，2013). LAT2的结构研究是在异源二聚体过度表达的情况下进行的巴氏杆菌随后进行大规模纯化（Costa等人。，2013; Rosell等人。，2014). 研究表明，通过不同的实验方法，4F2hc的胞外结构域覆盖了以AdiC转运体为模型的人LAT2的表面。对接模型拟合了交联实验得出的空间位阻，并强调了参与二硫化物形成的Cys残基是TMD III和IV之间的C154。有趣的是，所描述的相互作用模式为4F2hc在LAT2路径循环中的作用提供了新的线索：重链与LAT2的一个名为“散列域”的特定域的强相互作用使这部分异二聚体更为静态（接近TMD 11和12），而包括螺旋1、2、6、7、，环路7–8是在运输循环打开和关闭运输机期间移动的环路（Rosell等人。，2014). 其他HAT也可以共享此机制。

已经描述了LAT1和LAT2转运体的进一步结构特征：潜在酪蛋白激酶II依赖的磷酸化位点、PKC磷酸化基序、酪氨酸激酶依赖的磷酸化位点（Prasad等人。，1999; Segawa等人。，1999). 大鼠和人类LAT2序列的比对显示出较高的一致性百分比（92%，未显示）。通过使用ADiC转运体的结构作为模板（PDB 3OB6；图​图6）。6). 与其他谷氨酰胺转运体不同，扫描磷灰石分析预测缺乏糖基化位点。对于这些转运蛋白，靶向膜是由其结合伙伴保证的（Costa等人。，2013; Rosell等人。，2014). 这种相互作用由二硫键介导，涉及人类亚型的C154和暴露于蛋白质细胞外侧的大鼠亚型的C155（图​（图6）。6). 这两种亚型都含有11个Cys残基。没有发现金属结合基序。另一方面，人体模型包含3个丝氨酸残基（S179、S337、S487）、推测的PKC磷酸化位点和一个苏氨酸残基，推测的PKA磷酸化位点。这些位点朝向蛋白质的细胞溶质侧。大鼠和人类蛋白质显示出几乎重叠的预测结构（图​（图66).

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图6

LAT2人和大鼠转运体的同源模型如图所示，构建了大鼠（Chaudhry等人）和人类（紫色）LAT2的同源结构模型​图44以精氨酸/银杏碱反转运蛋白AdiC的结构为模板大肠杆菌（PDB 3OB6）。VMD 1.9.1对大鼠和人体结构模型进行叠加。与4F2hc二硫键有关的人类蛋白C154以黄色突出显示；假定的PKC和PKA磷酸化位点以绿色突出显示。大鼠和人类蛋白质的N端和C端几乎一致，并以单个N和C突显。

SLC7A6:y+LAT2

该运输工具与LAT1和LAT2一起属于SLC7系列家庭。编码y+LAT2人类亚型的基因于1999年被分离出来，并在染色体16q22.1上注释（Pfeiffer等人。，1999). 该蛋白由515个氨基酸组成，主要表达于大脑、小肠、睾丸、腮腺、心脏、肾脏、肺。y+LAT2与4F2hc一样作为异二聚体发挥作用SLC7系列家庭。它被确定为精氨酸/谷氨酰胺交换物：这种作用在大脑中尤其重要，因为大脑中的蛋白质可能为细胞提供重要的氨基酸。非常有趣的是，这种转运蛋白的催化机制是独特的：事实上，y+LAT2介导Na⁺-依赖方式，而阳离子氨基酸转运是Na⁺-独立（表​（表1）。1). 交换以1:1的化学计量进行。由于阳离子氨基酸的正电荷被钠补偿，因此反转运机制预计为电中性⁺伴随中性氨基酸的离子（Broer等人。，2000).

SLC7A15:ArpAT

编码这种转运体的基因被注释为生物信息学方法。BLAST分析在小鼠基因组上确定了一个包含假定ORF的区域，该区域满足属于SLC7系列家族：与b有64%的相似性^0,+AT、12个TMD结构域、2个推测的N-糖基化位点也存在于LAT1和参与二硫键的保守Cys残基中SLC3型成员。然后在HeLa细胞中克隆该小鼠转运体并进行功能表征；在rBAT或4F2hc存在下其过度表达增加了中性氨基酸的摄取。转运蛋白介导Na中丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和胱氨酸的摄取⁺-和pH-独立方式。与LAT类似，ArpAT表现出跨刺激性。这种转运体在肠道中表达，在大脑中表达的水平低得多。ArpAT发挥的主要生理作用可能与向调节肠钠的非神经元多巴胺能系统提供多巴胺有关⁺吸收（Fernandez等人。，2005). 关于这种转运体最有趣的发现是它的进化史：arpAT基因在大鼠、狗和鸡中是保守的，而在人类和黑猩猩中是沉默的。这表明，随着灵长类动物的进化，它的作用变得不重要了。鉴定该转运蛋白的小组推测，这可能可以从灵长类与其他脊椎动物的不同饮食中找到解释（Fernandez等人。，2005).

SLC38:SNAT系统网络协议

结构方面

的结构SLC38型其特征是具有典型的细菌LeuT（Broer，2014). 最近，通过生物信息学和标记实验，SNAT4（建立在LeuT和AdiC上）的同源性模型得到了验证（Shi等人。，2011). 在这个模型中，蛋白质的N-和C-末端是细胞外的，还有三个含有两个N-糖基化位点的环（N260和N264）。有趣的是，连接C249和C321的二硫键对SNAT4功能至关重要，但SNAT4不是谷氨酰胺转运体。（Padmanabhan Iyer等人。，2013). SNAT7的结构模型是作为SLC38型谷氨酰胺转运体是最后一个特征化的，因此尚未建立同源模型（图​（图7）。7). 有趣的是，SNAT7与其他SLC38型会员的身份百分比最低，从19%降至21%（未显示）。此外，SNAT7具有与系统A和N相似的独特属性SLC1和SLC6型由于与可用的结晶细菌同源物（AdiC和ApcT）的低序列相似性，Modeler为人类和大鼠SNAT7蛋白构建的转运蛋白同源模型与其他模型的保真度不同。SNAT2模型已经建立在LeuT晶体结构的基础上（Zhang等人。，2009). SNAT7与之前为SNAT4描述的同源模型具有相同的拓扑结构（Shi等人。，2011)具有细胞外C-和N-末端。与SNAT4不同的是，生物信息学没有预测人类和大鼠SNAT7蛋白的N-糖基化位点。关于磷酸化位点，在人类亚型中发现了一个PKC结合位点（T174）和一个PKA结合位点（T179）。在一个残基移位的大鼠中发现了相同的磷酸化位点。

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图7

SNAT7人和大鼠转运体的同源模型大鼠（紫色）和人类（Chaudhry等人）SNAT7的同源结构模型如图所示​图6：。6大鼠和人类结构模型的叠加采用VMD 1.9.1。假定的PKC和PKA磷酸化位点以绿色突出显示。大鼠和人类蛋白质的N端和C端几乎一致，并以单个N和C突显。

线粒体谷氨酰胺转运体

线粒体成员仍然代表着谷氨酰胺转运体集合中的一个谜。由于来自肝外组织的谷氨酰胺释放氨发生在线粒体基质内，因此该转运蛋白在新陈代谢中至关重要，线粒体基质中定位了普遍存在的谷氨酰胺酶形式，即源自GLS1基因的谷氨酰胺（图​（图2）。2). 源自GLS1基因的谷氨酰胺酶存在于两种剪接变体中，均定位于线粒体（Katt和Cerione，2014). 有趣的是，与谷氨酰胺在癌细胞代谢中的作用一致（见“谷氨酰胺转运蛋白在人类病理学中”一节），GLS1在癌症中的表达发生了改变。这与通过c-myc和NFkB途径抑制miRNA23a和b有关（Gao等人。，2009; Rathore等人。，2012). 事实上，根据最近对胰腺癌细胞的研究，氨的代谢流量也已在线粒体中得到很好的证明，其中谷氨酰胺通过转运体转移到线粒体，假设是由于GLS1被敲除时细胞生长受损所致（Son等人。，2013). 尽管线粒体谷氨酰胺转运体非常重要，但对完整线粒体（Sastrasinh和Sastrasin，1989)然后从线粒体提取物中分离并纯化负责此功能的蛋白质（Indiveri等人。，1998). 此后，在鉴定编码线粒体谷氨酰胺转运体的蛋白质和/或基因方面没有取得其他进展。有趣的是，所述谷氨酰胺转运体的表观分子量为41.5 kDa，高于典型的线粒体载体，即28–34 kDa。因此，线粒体谷氨酰胺转运体可能属于或不属于线粒体载体家族。事实上，已经描述了一种N端延伸更长的线粒体载体（Palmieri，2008)以及不属于线粒体载体家族的线粒体转运体（Herzig等人。，2012).

谷氨酰胺转运体在人类病理学中的作用

已对谷氨酰胺转运体在人类病理中的参与进行了研究，除常染色体隐性遗传病Hartnup病外，唯一与谷氨酰胺稳态改变相关的病理学是癌症。谷氨酰胺在细胞增殖中起着关键作用，细胞增殖需要营养、能量和增加生物合成活性，从而导致整体代谢变化。在这种情况下，细胞转向高糖酵解率、乳酸生成和增加脂质生物合成。这些途径首先在淋巴细胞中描述，淋巴细胞是研究细胞增殖的有用模型（Debrardinis等人。，2008; 范德海登，2011). 有趣的是，类似的代谢变化是癌细胞的一个典型特征，需要葡萄糖和谷氨酰胺来维持高增殖率（Fuchs和Bode，2005; Ganapathy等人。，2009; Chen和Russo，2012; Daye和Wellen，2012; Son等人。，2013). 特定基因的差异表达，特别是那些编码质膜转运蛋白的基因，可以增加对这两种营养物质的吸收。正常增殖细胞需要整合来自细胞外生长因子的信号，而癌细胞则增强了自主性。癌症中发生的主要代谢变化统称为Warburg效应（Ganapathy等人。，2009; Vander Heiden等人。，2009; 党，2010; 哦，2012). 除了葡萄糖利用率增加外，这种现象还依赖于谷氨酰胺，谷氨酰胺通常被归类为“非必需”氨基酸，可产生截短形式的TCA，以苹果酸终止，并在底物水平产生ATP（图​（图8）。8). 苹果酸转化为丙酮酸和乳酸，使癌细胞产生合成代谢过程所需的ATP和NADPH（图​（图8）。8). 乳酸由MCT输出，MCT在肿瘤中也过度表达（Halestrap，2013). 此外，谷氨酰胺通过IDH1和脂肪生成（Metallo，2012)（图​（图88).

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图8

癌症代谢开关相关的转运蛋白网络细胞膜内（红色），ASCT2和LAT1：谷氨酰胺质膜转运蛋白；MCT：单羧酸转运蛋白。在胞浆中（图的上部），Gln：谷氨酰胺，Glu：谷氨酸，αKG：α酮戊二酸，ICIT：异柠檬酸，IDH1：异柠檬酸酯脱氢酶1和简化脂肪酸合成反应；（图的下半部分）苹果酸：苹果酸，乳酸：乳酸和简化最终产物丙酮酸（Pyr）的糖酵解。在线粒体内膜中，假定的谷氨酰胺转运蛋白（？）。在线粒体基质中，含有酶的TCA（三羧酸循环），GLS：谷氨酰胺酶，GDH：谷氨酸脱氢酶，ALT：丙氨酸氨基转移酶。AA：氨基酸。虚线箭头表示癌症患者的代谢途径受到抑制。

因此，负责谷氨酰胺处置的质膜转运蛋白在几种人类癌症中发生改变也就不足为奇了。在上述章节所述的运输工具中，LAT1(SLC7A5型)和ASCT2(SLC1A5型)自2005年以来，有文献证明在几种肿瘤中过度表达的肿瘤（Fuchs和Bode，2005). 人类癌症的具体例子列于表​表2。2在几乎所有的病例中，ASCT2和LAT1的过度表达与这些肿瘤的高恶性程度相关。然而，ASCT2在向细胞提供谷氨酰胺方面的作用（Nicklin等人。，2009)鉴于评估良好的强制性反转运和功能不对称性，必须重新审视（Pingitore等人。，2013). 谷氨酰胺的能量供应并非来自整个谷氨酰胺分子（五个碳原子），而是来自作为谷氨酰胺的碳原子与作为较小氨基酸（如丝氨酸和苏氨酸）出口的碳原子之间的差异（图​（图8）。8). 这种差异解释了一个或两个碳原子在截断的TCA中被氧化的原因。膜转运蛋白SNAT1、SNAT3和SNAT 5也在一些癌症中过度表达（表​（表2），2)实现谷氨酰胺供应；这些发现打开了SNAT作为药理靶点的前景，尽管缺乏合适的实验工具使得这个问题仍然难以解决。值得注意的是，低亲和力谷氨酰胺转运体ATB^0,+在一些肿瘤中也上调，尽管这与其向细胞提供精氨酸的主要功能有关（Gupta等人。，2005).

只有一种遗传性病理学称为Hartnup病（OMIM 234500），与谷氨酰胺转运蛋白明显相关，即B⁰迄今为止，已有21个突变被描述为此类病理发病的原因。这种代谢综合征很复杂，以糙皮疹样皮疹、小脑共济失调、情绪不稳定和强烈的氨基酸尿为特征⁰AT1还负责谷氨酰胺的吸收和再吸收，在哈特努病中起作用的氨基酸主要是组氨酸和色氨酸（Broer，2009). 尿液中这种氨基酸的急剧丢失是血清素和褪黑素合成减少的原因，分别解释了神经和皮肤问题。

毒理学和药理学：ASCT2和LAT1以及药物相互作用

上述结果强调了谷氨酰胺膜转运蛋白在癌症发展和/或进展的代谢变化中的重要性。这揭示了多年来ASCT2和LAT1的药理相关性，它们成为药物发现的热点目标。此外，质膜转运蛋白在与药物相互作用中发挥的关键作用越来越重要，一些证据将这些蛋白质与组织之间和不同亚细胞区室之间的药物配置联系起来（Giacomini等人。，2010; Pochini等人。，2013; Scalise等人。，2013). 这一研究领域的发展所面临的挑战是设计出能够针对感兴趣的蛋白质的良好抑制剂的可能性。这些研究开始于几年前，不同的小组报告了设计和识别ASCT2特异性抑制剂的尝试（Grewer和Grabsch，2004; Albers等人。，2012)和LAT1（Geier等人。，2013). 特定和选择性分子的设计需要了解目标的三维结构。然而，到目前为止，由于难以处理人类二级膜转运蛋白的结构，并且缺乏过度表达和折叠的方法，因此几乎没有解决人类二级细胞膜转运蛋白结构的问题。直到最近，人类GLUT1转运体亚型才通过X射线衍射得到解决，尽管是通过定点突变获得的非活性形式（Deng等人。，2014). 因此，鉴定新化合物的可能性主要基于实验程序和生物信息学之间的集成，通过同源建模和分子对接。先前获得的同源模型结构（Oppedisano等人。，2010,2011; Pingitore等人。，2013; Pochini等人。，2014)现在有所改善（图​（图4，4,​,5)5)已用于几项毒理学研究（见下文）。同时，为了获得ASCT2和LAT1的人类亚型，人们做出了大量努力，通过在异源系统中过度表达它们，遵循图中所示的工作流程​图3。三这些程序有助于恢复功能和结构研究所需的纯化蛋白质的高产量。最近，两种氨基酸转运蛋白hASCT2和hLAT1/CD98被克隆并在酵母中过表达巴氏杆菌在细菌中大肠杆菌分别（Galluccio等人。，2013; Pingitore等人。，2013). 尽管这两种蛋白质都是谷氨酰胺转运体，但无法应用共同的策略。考虑到OCTN家族三名成员已经获得的经验，这并不奇怪（Indiveri等人。，2013).

纯化和天然形式的这些蛋白质的可用性为获得X射线结构以更好地定义或验证图中描述的现有同源模型提供了可能性​图4，4,​,6.6结合过表达系统和蛋白质脂质体重组程序，很快将有可能开发出高通量筛选化合物的分析方法，用于在动物实验之前进行药物发现和设计（Pochini等人。，2013; Scalise等人。，2013)，如图的工作流程所示​图3。三这些类型的研究也可以在稳定或瞬时过度表达感兴趣的蛋白质的细胞系统中进行；然而，鉴于谷氨酰胺的多效性和氨基酸转运体的广泛底物特异性，正如几位作者所建议的那样，允许研究人工膜中分离的蛋白质的策略是不可或缺的（McGivan和Bungard，2007; Scalise等人。，2013; Schioth等人。，2013). 通过蛋白质脂质体重组，已经对从肾脏中提取的天然形式的大鼠蛋白质进行了一些评估谷氨酰胺转运体毒理学方面的研究，这些蛋白质是当时不可用的人类亚型（见ASCT2和B0AT1部分）。这些研究也为确认基于图中所示同源模型推测的结构/功能关系提供了可能性​图4，4,​,5.5这些工作是从观察到一些氨基酸残基（例如Cys）在蛋白质进化过程中增加了它们的相对浓度开始的（Jordan等人。，2005). 这使得Cys成为不同SH-活性分子的潜在靶点；值得注意的是，谷氨酰胺转运体处理了本综述中的几个Cys残基。事实上，ASCT2和B0AT1被几种SH-受体抑制。从毒理学的角度来看，一类有趣的SH-受体是汞化合物。这些分子是来自对人类和一般哺乳动物具有高毒性的工业的潜在环境污染物，因为它们作为细菌新陈代谢的生物产物进入食物链（鲁尼，2007). ASCT2已完成第一项工作；这种蛋白质被氯化汞强烈抑制₂、甲基汞和其他重金属（Oppedisano等人。，2010). 这些化合物很可能与CXXC金属结合基序相互作用，该基序位于载体的大亲水环末端，位于疏水残基包围的盆地中（图​（图4A）。4A级). 汞化合物测得的IC50在毒性阈值范围内。这些结果从分子水平解释了脑中甲基汞的毒性作用（Boado等人。，2005). 在同一系统中对ASCT2进行了大规模药物筛选（Oppedisano等人。，2012). 特别是潜在的抗肿瘤药物，二噻唑类，专门为大鼠ASCT2设计，并经过测试以确定最有效药物的结构特征；该研究再次揭示CXXC基序与这些药物的共价相互作用有关。

对从大鼠肾脏中提取的B0AT1进行了蛋白质脂质体系统的另一项研究。尽管大鼠B0AT1的结构与大鼠ASCT2的结构无关，但转运体具有携带CXXC金属结合基序的共同特征。在B0AT1的情况下，CXXC基序定位在远离假定结合位点的地方，与汞化合物的非竞争性抑制有关（Oppedisano等人。，2011)（图​（图5）。5). 此外，B0AT1还包含一个CXXXC基序，该基序之前被描述为铜等金属的靶标²⁺，铅²⁺，汞²⁺，镉²⁺和锌²⁺（阿巴建和罗森茨威格，2006; Tonazzi和Indiveri，2011). 这第二个主题可能解释了汞试剂mersalyl原型的作用。事实上，在这种情况下，发现了抑制的底物保护（Oppedisano等人。，2011). 有趣的是，抗氧化剂能够逆转ASCT2和B0AT1蛋白的抑制作用（Scalise等人。，2013). 最近，对大鼠B0AT1进行了大规模药物筛选，描述了常见抗炎药尼美舒利的特定抑制作用（Pochini等人。，2014). 尼美舒利在大鼠B0AT1上的分子对接支持了实验数据，表明药物相互作用的位点与抗抑郁药在SERT和GABA转运体（Krishnamurthy和Goauux，2012; Penmatsa等人。，2013). 这一特点，再加上大鼠和人之间的高度一致性，使得重组B0AT1成为适用于人类的药理学和毒理学筛选的重要模型。相反，在本综述中描述的谷氨酰胺转运体中，ASCT2具有独特的特征，即大鼠和人类直系亲属之间存在局部差异，这使得人类过表达转运体的可用性对于人类健康应用至关重要。

结论

谷氨酰胺是一种“条件性必需”氨基酸，由于几种膜转运蛋白的不同转运方式，维持了体内平衡。因此，一方面，浓缩转运蛋白允许谷氨酰胺在肠道中从饮食中吸收，并在肾脏中从尿液中重新吸收。另一方面，共转运蛋白和反转运蛋白都允许谷氨酰胺在所有组织中传递，并与其他氨基酸平衡。具有重叠功能属性的转运蛋白的冗余很可能与避免体内平衡紊乱的需要有关，即使在一个转运蛋白发生故障的情况下也是如此。除了极少数例外，编码这些转运蛋白的基因缺乏已知缺陷，这在某些情况下证明谷氨酰胺稳态紊乱与生命不相容。尽管所有转运蛋白都处理谷氨酰胺的共享特异性，但它们显示出不同的三维结构。这与它们在不同蛋白质家族中的分类一致；然而，在同一家族中，从大鼠到人类，直系同源基因都非常保守。唯一的例外是ASCT2(SLC1A5型)这可能与后来进化中出现的转运体的某些特定信号作用有关。虽然几种转运体的功能已被广泛描述，但没有可用的结构，调控的分子机制仍未完全解决。因此，要全面了解谷氨酰胺通过组织的通量，还有很多工作要做。这不仅对谷氨酰胺稳态的生物化学知识非常重要，而且更重要的是，对于这种特殊氨基酸参与人类健康最热门的话题：癌症生物学。

作者贡献

洛雷娜·波奇尼（Lorena Pochini）、玛丽亚弗朗西丝卡·斯卡利泽（Mariafrancesca Scalise）在收集参考书目、准备图表和写作方面做出了贡献；米歇尔·加卢乔（Michele Galluccio）在绘画结构人物和写作方面做出了贡献；Cesare Indiveri为所有活动的写作和监督做出了贡献。

致谢

词汇表

参考文献