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基因细胞。作者手稿；可在PMC 2014年8月7日获得。
以最终编辑形式发布为：
基因细胞。2011年1月；16(1): 46–57.
2010年12月9日在线发布。 数字对象标识：10.1111/j.1365-2443.2010.01466.x号
PMCID公司：PMC4124525型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院580771
PMID：21143560

硝基脂肪酸和环戊烯酮前列腺素共享激活Keap1-Nrf2系统的策略：一项使用绿色荧光蛋白转基因斑马鱼的研究

Tadayuki筑田,1,2,† 李丽,1,† 中岛喜美,1 岩本诺里子,三 中岛雅子,1 Ken Ohashi先生,1 川上光一,4 鸠山由纪夫,三 布鲁斯·弗里曼,5 山本正彦,2,6和小林诚1,2,*
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摘要

硝基脂肪酸是产生的亲电脂肪酸体内从具有多种生理活性的过氧化氮中提取。我们最近证明，硝基脂肪酸激活Keap1-Nrf2系统，该系统通过反式激活一系列细胞保护基因来保护细胞免受亲电或氧化应激造成的损伤，尽管其激活Nrf2的分子机制尚不清楚。据报道，许多具有不同结构的化合物可激活Keap1-Nrf2系统，根据其传感途径，该系统至少可分为六类。在这项研究中，我们发现亚硝酸（OA-NO）2)，一种主要的硝基脂肪酸，以与环戊烯酮前列腺素15-脱氧-Δ相同的方式激活Nrf212, 14-前列腺素J2（15d-PGJ2)使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼来响应Nrf2激活剂。在转基因胚胎中，通过OA-NO处理在全身诱导GFP2，15d-PGJ2或马来酸二乙酯（DEM），但不与过氧化氢（H2O（运行）2)当外源性Nrf2和Keap1共表达时。OA-NO诱导2或15d-PGJ2但没有观察到DEM，即使在Keap1中引入C151S突变。我们的结果支持OA-NO的论点2和15d-PGJ2具有类似的半胱氨酸编码作为电泳物，也具有类似的抗炎作用。

介绍

Keap1-Nrf2系统通过调控解毒酶和抗氧化酶的基因表达，在细胞防御亲电和氧化应激中发挥中心作用(小林和山本2006;Kensler&Wakabayashi 2010年). Nrf2是一种转录因子，与小分子Maf蛋白异源二聚体化，并在其靶基因的调控区域内与抗氧化反应元件（ARE）/电泳反应元件（EpRE）结合。Keap1是Cul3依赖性E3泛素连接酶复合物的底物特异性衔接蛋白，与Nrf2的ETGE和DLG基序同源二聚并相互作用。在基础条件下，由于Keap1依赖的泛素化和蛋白酶体降解，Nrf2维持在低水平。当暴露于电泳或氧化应激时，Nrf2稳定并积聚在细胞核中，在细胞核中反式激活ARE/EpRE调节基因。

已经报道了多种Nrf2激活剂(小林和山本2005). 其中一些活化剂对致癌、神经损伤和炎症具有保护作用，可作为膳食制剂摄入，用于预防和治疗癌症、心血管疾病、慢性炎症和神经变性疾病等与年龄相关的疾病(卡拉布里斯等. 2008). 然而，最近发现Nrf2在肿瘤发生和化疗耐药中的积极作用(海斯和麦克马洪2009;刘等. 2008). 了解Nrf2激活剂之间的差异非常重要，尤其是Keap1-Nrf2活化的机制、其他系统的活化以及它们诱导的Nrf2靶基因。

新领域的重点是识别激活Nrf2的传感器分子。这些活化剂具有通过烷基化、氧化或还原来修饰巯基的共同能力。这一观察表明，细胞具有Nrf2激活剂的初级传感器，该传感器配备有高活性半胱氨酸残基。小鼠Keap1的Cys-151是许多Nrf2活化剂（如马来酸二乙酯（DEM））的靶位点(小林寺等. 2009;谢卡尔等. 2010). 我们最近发现环戊烯酮前列腺素，15d-PGJ2和前列腺素A2（第页2)，Keap1中Cys-151以外的靶残基，可能是Cys-273(小林寺等. 2009). 此外，H的传感器蛋白2O（运行）2氯化镉和金复合物金诺芬不是Keap1或Nrf2(小林寺等. 2009). 各种Nrf2活化剂的靶向选择应进行全面研究。

Keap1-Nrf2系统在包括斑马鱼在内的脊椎动物中是保守的(小林寺等. 2002;高木（Takagi）等. 2004;锂等. 2008). 斑马鱼Nrf2的已知内源性靶点中，pi-类谷胱甘肽S公司-转移酶1基因(谷胱甘肽硫转移酶P1)在电泳处理的幼虫和Nrf2过度表达的胚胎中表现出最强的诱导作用。基因调控区谷胱甘肽硫转移酶P1通过向斑马鱼胚胎中微量注射绿色荧光蛋白（GFP）报告基因分析进行检测，发现位于转录起始位点上游30 bp的ARE/EpRE-like序列对于Nrf2的诱导是必要的和充分的(铃木等. 2005).

在这项研究中，我们试图利用一个3.5-kb的基因调控区，即谷胱甘肽硫转移酶P1开发一种快速简便的筛选和分类Nrf2活化剂的方法。分离出两个稳定的转基因株系，它们在幼虫嗅觉区表达GFP，以响应Nrf2激活剂。转基因胚胎中未检测到GFP诱导，但对DEM和15d-PGJ有较强的诱导作用2，但不是H2O（运行）2当Nrf2和Keap1均过度表达时观察到。使用该系统，我们将一种新发现的Nrf2激活剂OA-NO分类2，与15d-PGJ属于同一类别2.

结果

Nrf2激活剂诱导表达GFP的稳定转基因株系的建立

在瞬时检测中，p3.5gstp1 GFP构建物中的GFP表达，该构建物包含斑马鱼的3.5-kb启动子区域谷胱甘肽硫转移酶P1该基因在斑马鱼胚胎中被Nrf2强烈反式激活(图1A;铃木等. 2005). 通过对p3.5gstp1GFP注射者的F1胚胎进行基因分型，分离出携带该构建物的稳定转基因株系。虽然分离出三个稳定的株系，但在DEM处理后，三个株系均未表现出GFP表达，因此表明转基因的位置效应（数据未显示；支持信息中的表S1). 为了避免这个问题Tol2（公差2）转座子系统(川崎等. 2004)用于生成额外的稳定线。pT3.5gstp1GFP构造是通过引入Tol2（公差2）序列插入p3.5gstp1GFP，并将其与编码mRNA的斑马鱼胚胎共同注射收费2-特异性转座酶。注入型创始人(n个=104），并分离出12个在F1幼虫中显示GFP表达的转基因株系(支持信息中的表S1). 共12个Tg（-3.5gstp1:GFP）两个品系表现出对DEM的GFP诱导，其余品系仅表现出基本的GFP表达。在这两条线的幼虫中(it416a型和it416亿)，在嗅觉区域观察到强烈的GFP诱导谷胱甘肽硫转移酶P1而在晶状体、耳朵、鳍、心包和侧线也检测到构成性GFP的表达(支持信息中的图S1和S2). 我们使用了it416亿因为它表现出比it416a型行。

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DEM诱导的GFP表达Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b幼虫。（A） p3.5gstp1GFP构造的示意图。Ex1和ExII分别表示谷胱甘肽硫转移酶P1基因。（B） GFP在小鼠嗅觉区（箭头）表达的时间进程Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b100μl处理后4dpf下的幼虫米要求。星号和箭头分别表示晶状体和侧线中的构成性GFP表达。背视图。（C） 的影响编号2敲除DEM诱导的GFP表达。第4天幼虫Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b管线注入编号2单细胞期的MO用100μ米DEM处理12小时。DEM，马来酸二乙酯；绿色荧光蛋白。

在第4天的幼虫中，诱导内源性谷胱甘肽硫转移酶P1DEM处理后约3小时开始表达，约6-9小时达到最大表达水平（数据未显示）。GFP在小鼠嗅觉区的诱导作用Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b幼虫在DEM处理后6小时首次被检测到，随后变得更强(图1B;支持信息中的电影S1). 当编号2被击倒编号2-特异性反义吗啉寡核苷酸(编号2生产任务单）(小林寺等. 2002)表明GFP诱导是由Nrf2介导的(图1C).

GFP诱导的量化

为了量化GFP表达水平，使用配备BZ-8000显微镜（Keyence）的成像分析仪测量嗅觉区域的荧光强度(图2A). 用3只、10只或30只幼虫测量了DEM诱导的嗅觉区GFP表达的平均荧光强度，所有这些都显示出相似的值(图2B). 因此，我们在进一步的分析中使用了三个人来量化GFP诱导。根据这种量化，DEM诱导的GFP表达减少编号2-击倒按三分之一计算(图2C).

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DEM诱导GFP表达的量化。（A） 对三角形包围区域的荧光强度进行了分析。（B） 样品数量的确定。指示的数量Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b用100μ米在4 dpf下进行12 h的DEM，并计算嗅觉区域的平均荧光强度。误差条表示标准偏差值。（C） 影响编号2击倒100μ米4 dpf时DEM诱导的GFP表达。三个个体嗅觉区域的平均荧光强度Tg（-3.5 gstp1：绿色荧光蛋白）it416b对幼虫进行分析：给幼虫注射或不注射编号2单细胞胚胎阶段的MO。（D） 4dpf时DEM诱导GFP表达的时间和剂量效应。三个个体嗅觉区域的平均荧光强度Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b对幼虫进行了分析。（E） 实时RT-PCR分析。DEM诱导内源性表达的时间和剂量依赖性效应谷胱甘肽硫转移酶P14 dpf。DEM，马来酸二乙酯；绿色荧光蛋白。

我们首先量化了DEM诱导的GFP表达的时间和剂量依赖性。GFP在小鼠嗅觉区的表达Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b在处理后3、6、10和14小时，对不同DEM浓度处理的幼虫进行了测量(图2D). 30μ以上的治疗可检测到GFP诱导米DEM，类似于检测内源性谷胱甘肽硫转移酶P1实时逆转录（RT）-PCR检测诱导(图2E)或者是整座就地杂交（数据未显示）。GFP诱导的开始时间（6小时）晚于内源性谷胱甘肽硫转移酶P1诱导（3小时），很可能是由于GFP蛋白积累所需的时间。总之，这些结果表明，使用嗅觉区域的荧光强度来测量DEM诱导的GFP表达的灵敏度与内源性GFP的灵敏度相当谷胱甘肽硫转移酶P1采用实时RT-PCR分析在全身诱导。

在它567突变幼虫

我们筛选并分离出了在谷胱甘肽硫转移酶P1Nrf2活化剂诱导(小林寺等. 2009). 其中一个突变体，它567，减少了诱导谷胱甘肽硫转移酶P1响应DEM。为了观察活幼虫数量的减少，我们进行了杂交它567用…捕鱼Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b鱼。正如预期的那样，DEM诱导的GFP在小鼠嗅觉区域的表达它567与同胞野生型幼虫相比，纯合子幼虫显著减少(图3;支持信息中的电影S2). 结果表明，通过监测DEM处理后的GFP诱导，纯合子突变幼虫很容易从野生型同胞中区分出来，尽管我们还没有确定导致这种突变的基因它567突变。

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的影响它567DEM诱导的GFP表达突变。（A） GFP在它5674dpf下的突变幼虫。Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b；it567/it567幼虫或野生型同胞用100μ米6小时的DEM。箭头表示嗅觉区域。（B） 分析了三只幼虫的平均荧光强度。误差条表示标准偏差值。DEM，马来酸二乙酯；绿色荧光蛋白。

多种Nrf2活化剂诱导GFP

阐明是否Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b可以监测多种Nrf2活化剂的诱导作用，对不同类别的五种Nrf2活性化合物进行了检测(小林寺等. 2009). 第4天幼虫Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b鱼被莱菔硫烷，15d-PGJ处理2，H2O（运行）2、金诺芬或氯化镉2在三名受试者的嗅觉区监测GFP的表达(图4A). 在所有测试的Nrf2活化剂处理的幼虫中都观察到了GFP的诱导，尽管用H诱导时GFP的作用较弱2O（运行）2和氯化镉2结果表明：Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b可用于分析Nrf2激活剂传感机制，也可用于筛选新的和未识别的激活剂。

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各种Nrf2活化剂诱导的GFP。（A） GFP在小鼠嗅觉区的诱导作用Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b萝卜硫烷（SF），15d-PGJ在4 dpf下的幼虫2H（H）2O（运行）2、金诺芬（AF）和氯化镉2.Ctr表示未经处理的对照幼虫。误差条表示三个幼虫的标准偏差值。（B） GFP诱导Tg（-3.5gstp1:GFP）it416bDEM胚胎，15d-PGJ2和H2O（运行）2.Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b联合注射野生型（WT）或C151S Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA的胚胎用Nrf2活化剂处理6h。

我们最近根据这些激活剂对Nrf2反应的要求，将11种Nrf2激活剂分类(小林寺等. 2009). 使用过度表达Nrf2和Keap1的斑马鱼胚胎进行分类。用每个Nrf2激活剂处理胚胎，并诱导内源性谷胱甘肽硫转移酶P1基因通过整体分析就地杂交或RT-PCR分析。如果Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b可以用于此分析。为了测试这种可能性，通过mRNA注射在杂合转基因雄性和非转基因雌性杂交获得的胚胎中过表达Nrf2，并在原肠胚形成阶段分析GFP的表达(支持信息中的图S3). 在注射Nrf2 mRNA的胚胎中观察到GFP的稳健表达，而在未注射的胚胎中没有发现GFP的表达。

然后我们生成纯合转基因系，使所有注射的胚胎对GFP呈阳性。从纯合转基因雄性和非转基因雌性获得的胚胎用于进一步分析，因为在转基因雌性胚胎中观察到母体GFP表达（数据未显示）。当野生型或C151S突变型Keap1用Nrf2过度表达时，未观察到GFP表达，表明Keap1抑制了Nrf2的GFP诱导活性(图4B). DEM治疗抵消了野生型Keap1但C151S Keap1对Nrf2的抑制，而15d-PGJ则没有2从两者中释放了Nrf2活动。H（H）2O（运行）2治疗没有任何效果。这些结果表明Keap1是DEM和15d-PGJ的传感器2，但不适用于H2O（运行）2，并且需要Cys-151用于DEM，但不需要15d PGJ2传感。所有这些结果与之前使用内源性进行的分析的情况相同谷胱甘肽硫转移酶P1诱导(小林寺等. 2009).

OA编号2将Nrf2激活为15d-PGJ2

OA编号2然后使用Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b.OA编号2是一种最近被证明能激活Nrf2的硝基脂肪酸(弗里曼等. 2008). 硝基脂肪酸是产生的亲电脂肪酸体内一氧化氮具有多种生理活性，如cGMP依赖性血管舒张、抑制炎症细胞功能、诱导血红素氧化酶1表达、抑制NFκB、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）激活和Nrf2激活。GFP在小鼠嗅觉区的表达Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b用OA-NO处理后的幼虫进行分析2受精后4天（dpf）(图5A、B). 在OA-NO的嗅觉区域观察到显著的GFP诱导2-经处理的幼虫，注射后Nrf2击倒后减少编号2OA-NO也观察到MO。GFP诱导2过度表达Nrf2和Keap1的胚胎的治疗(图5C). 值得注意的是，Keap1 C151S突变不能消除这种诱导，这表明Cys-151不是OA-NO的敏感位点2在Keap1-Nrf2系统中。当内源性谷胱甘肽硫转移酶P1通过RT-PCR分析(图5D). 我们还发现，Cys-288（Keap1的另一个关键反应性半胱氨酸）中的Cys-to-Ser突变对OA-no反应没有影响2(支持信息中的图S4). 必须注意，这些结果与15d-PGJ的结果相同2(小林寺等. 2009).

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OA编号2-诱导GFP表达Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b幼虫和胚胎。（A，B）通过1.5μ米OA编号2在的嗅觉区域（箭头）Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b幼虫在4dpf。使用编号2MO.误差条表示三个幼虫的标准偏差值。（C） OA编号2-诱导GFP表达Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b胚胎。Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b胚胎联合注射野生型（WT）或C151S Keap1 mRNA，Nrf2 mRNA用2.5μ米OA编号2持续6小时（D）OA-NO的RT-PCR分析2-诱导内源性谷胱甘肽硫转移酶P1表达式。联合注射野生型（WT）或C151S Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA的胚胎用2.5μ米OA编号2持续6小时GFP，绿色荧光蛋白。

确定OA-NO修饰的Keap1中的位点2，经或不经OA-NO处理的小鼠Keap1蛋白2用胰蛋白酶消化并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。通过MALDI-TOF MS对本地小鼠Keap1的胰蛋白酶片段进行分析，绘制肽质量图，从而可以识别肽，因此约占蛋白质序列的80%（参见支持信息中的表S2). 与未改性肽的计算质量相比，改性肽P-1至P-6的质量增加了+327.4Da，因此对应于OA-NO的单一当量的添加2(图6). 肽的序列和质量如下：P-1（CHAL-TPR，米/z=1124.8），P-2（SGVGVAVTMEPCR，米/z=1632.7），P-3（LNSAECYYPER，米/z=1671.7），P-4（LSQQLCDVTLQVK，米/z=1802.1），P-5（SGLAGCVVGGLLYAVGGR，米/z=1976.2）和P-6（QEEFFNLSHCQLATLISR，米/秒=2463.3），表明小鼠Keap1被OA-NO修饰2Cys-77、Cys-226、Cys-233、Cys-368、Cys-489和Cys-613。需要注意的是，Cys-273包含在15d-PGJ的氨基酸中2和PGA2在我们之前的分析中显示为绑定(图6B;小林寺等. 2009).

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OA-NO传感器半胱氨酸的鉴定2（A）小鼠Keap1多肽经胰蛋白酶消化后与或不与OA-NO孵育后的MS分析2将小鼠Keap1（3μg）在25°C下孵育60分钟，不存在（顶部）或存在（底部）100μ米OA编号2总体积为10μL，含20 m米Tris–HCl（pH8.5）。（B） 通过MS分析确定小鼠Keap1中Nrf2激活化合物的修饰位点。15d-PGJ的改性位点2和PGA2已经过分析(小林寺等. 2009).

分类的另一个标准是对it275号基因。it275号是一种斑马鱼突变体，对某些但不是全部Nrf2激活剂的反应存在缺陷。例如，内源性的诱导谷胱甘肽硫转移酶P1年减少it275号幼虫对15d PGJ的反应2、金诺芬和氯化镉2与野生型幼虫对DEM、萝卜硫烷和H的反应相似2O（运行）2.谷胱甘肽硫转移酶P1表达分析it275号带有或不带有OA-NO的幼虫或同胞野生型幼虫2在4dpf下通过就地杂交(图7). OA编号2-从属的谷胱甘肽硫转移酶P1鳃或嗅觉区的诱导作用在it275号幼虫与野生型幼虫相比。在用DEM处理的幼虫中没有观察到这种减少。这一结果表明，OA-NO介导的Nrf2活化2需要it275号基因，也类似于15d-PGJ2.

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的影响it275号OA-NO突变2-诱导内源性谷胱甘肽硫转移酶P1表达式。安就地内源性的杂交分析谷胱甘肽硫转移酶P1纯合子的表达（箭头）it275号1.5μ米OA编号2或100μ米在4 dpf下DEM持续6小时。DEM，马来酸二乙酯。

总而言之，OA-NO2与15d-PGJ一样，被归类为4类Nrf2激活剂2和PGA2(小林寺等. 2009). 因此，我们假设硝基脂肪酸和环戊烯酮前列腺素具有激活Keap1-Nrf2系统的策略。

讨论

我们之前证明了亚硝酸（LNO）2)，一种类似于OA-NO的硝基脂肪酸2，还激活培养细胞中的Nrf2(维拉科塔等. 2007). 本研究证实硝基脂肪酸确实是活体动物中有效的Nrf2激活剂。OA-NO的共价结合2与反应性半胱氨酸和组氨酸结合，以前已在多种蛋白质中证明(巴提亚尼等. 2006). OA-NO很可能2直接结合Keap1，很可能位于Cys-273。重要的是，OA-NO2似乎与15d PGJ属于相同的Nrf2激活剂类别2正如我们在这里所描述的。引人注目的是，硝基脂肪酸（OA-NO）的化学结构2和LNO2)和环戊烯酮前列腺素（15d-PGJ2和PGA2)都很相似(图8A). 我们推测，这些化合物之间共同的独特结构对于靶向Keap1蛋白中的相同位点至关重要。除了激活Nrf2外，硝基脂肪酸还可以激活PPARγ作为与Cys-285共价结合的内源性配体(朔普费尔等. 2005,2010)通过与p65直接相互作用抑制NFκB-DNA结合(崔等. 2006). 有趣的是，15d-PGJ2通过在Cys-285与PPARγ直接结合，也表现出这些性质(新良贵等. 2006)Cys-38和NFκB的p65(斯特劳斯等. 2000). 似乎OA-NO2也能与NFκB p65的Cys-38结合。我们假设亲电信号化合物，例如硝基脂肪酸和环戊烯酮前列腺素，可以与一系列关键靶蛋白（例如Keap1、PPARγ和NFκB）结合，从而通过其靶蛋白的联合作用发挥其生理功能（例如抗炎作用）(图8B)（半胱氨酸密码假说，小林寺等. 2009).

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硝基脂肪酸和环戊烯酮前列腺素。（A） 硝基脂肪酸（OA-NO）的化学结构2和LNO2)和环戊烯酮前列腺素（15d-PGJ2和PGA2). （B） 半胱氨酸密码假说。OA编号2和15d-PGJ2共享类似的半胱氨酸代码作为亲核靶点，并发挥类似的抗炎作用。

这个Tg（-3.5 gstp1：绿色荧光蛋白）it416b目前研究中建立的细胞系可以监测电泳诱导的基因表达体内它在许多情况下都很有用，例如在基因分析、小分子筛选和突变鱼类筛选中。亲电试剂诱导的Nrf2激活的实时监测系统的产生已经研究了多年。可以监测Nrf2激活的稳定细胞系先前是使用多个ARE/EpRE序列作为转录驱动因子和GFP或萤光素酶作为报告基因产生的(Zhu&Fahl 2001年;王等. 2006). 使用这些细胞系获得的结果是可重复的，并且比依赖瞬时转染的实验更可靠。还产生了荧光素酶报告基因融合到多个ARE/EpRE序列的转基因小鼠(耶茨等. 2007;费希尔等. 2007). 这些转基因小鼠很有用，因为它们可以监测Nrf2激活的组织和发育阶段特异性特征。通过将这些小鼠与多种基因突变小鼠杂交，也可以分析疾病模型中Nrf2的实时激活。然而，该模型存在缺点，即需要将底物荧光素注入小鼠体内，其处置和副作用可能会影响结果的正确分析。使用GFP代替荧光素酶将有助于克服这个问题；然而，很难分析GFP在小鼠内部区域的表达。已经进行了实验，以产生携带ARE/EpRE驱动的GFP报告基因的稳定转基因斑马鱼(货车等. 2000;库西克等. 2008)但没有成功。Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b是第一个ARE/EpRE-GFP报告行，可用于在实际和生理相关水平上监测Nrf2激活。我们的成功归功于从大量稳定的转基因株系中筛选出有效株系。在这种意义上Tol2（公差2）转座子系统是一种重要的策略，极大地提高了转基因整合效率(川崎2007).

在本研究开始时，我们希望建立转基因株系，以分析通过各种Nrf2激活剂诱导后GFP诱导的组织特异性差异。不幸的是，这种方法没有成功。鳃和肝脏中的GFP诱导，其中内源性谷胱甘肽硫转移酶P1是诱导的（除了嗅觉区域），在目前的线路中没有观察到。我们是这么想的顺式-和反式-所需的激活因子谷胱甘肽硫转移酶P1不同组织的诱导作用不同。事实上，ARE/EpRE报告基因诱导水平的细胞特异性差异已在培养细胞系中得到证实(王等. 2006). 除ARE/EpRE序列外，鳃和肝脏中表达所需的基因调控元件可能不包括在3.5-kb中谷胱甘肽硫转移酶P1区域。Nrf2在人类健康中的消极和积极作用最近都得到了证实(海斯和麦克马洪2009;刘等. 2008). 阐明Nrf2靶基因的细胞特异性诱导的分子机制，特别是在癌细胞中，将是非常重要的。用于转基因的改良细菌人工染色体将有助于鉴定顺式-细胞特异性激活因子(杨等. 2009).

斑马鱼是分析基因表达谱的一个很有吸引力的模型，因为它有透明的胚胎和幼虫。此外，透明的成人线，称为卡斯珀，最近生成(白色等. 2008). 因此，利用GFP报告器将有助于可视化活体动物的各种应激反应。事实上，在GFP转基因斑马鱼中使用热休克促进剂监测细胞对镉、铜和砷酸盐等金属的反应(布勒兴格等. 2007;吴等. 2008;Seok公司等. 2007). 环境雌激素和二恶英对GFP的诱导作用也由GFP转基因斑马鱼使用雌激素反应元件进行分析+卵黄原蛋白发起人(陈等. 2010)和细胞色素P4501A1发起人(马丁利等. 2001)分别作为转录驱动因素。斑马鱼为加快药物发现进程提供了机会(Zon&Peterson 2005年). 这些GFP转基因株系，包括Tg（-3.5gspt1:GFP）it416b，将有助于药物开发过程的几个方面，包括通过基因和吗啉寡核苷酸筛选进行靶点识别，通过小分子筛选进行先导性发现，以及药物疗效和毒性测试。应用Tg（-3.5gspt1：绿色荧光蛋白）it416b因此，在未来的研究中将继续筛选新型Nrf2活化剂和抑制剂。

实验程序

斑马鱼

胚胎和幼虫是通过自然交配获得的。野生型菌株AB和突变菌株它567(小林寺等. 2009)使用了。稳定的转基因株系Tg（-3.5gstp1:GFP）it416a和Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b保持为纯合系。将纯合转基因系与AB株杂交，获得胚胎和幼虫进行实验。以基因组DNA为模板，引物5′-CCTCGTGCACCCTGAC-3′和5′-TGGCGGATC TTGAAGTTCAC-3′进行转基因株系的基因分型。

转基因系，Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b，可在日本斑马鱼国家生物资源项目的支持下根据要求获得(http://www.shigen.nig.ac.jp/zebra/index_en.html）。

化学处理

在诱导研究中，斑马鱼被放置在含有100μ米DEM（和谷，大阪，日本），40μ米萝卜硫烷（明尼苏达州圣保罗市LKT实验室），2.5μ米15d-前列腺素J2（开曼化学公司，密歇根州安阿伯），1μ米金诺芬（Enzo Life Sciences，Farmingdale，NY），1米米H（H）2O（运行）2（瓦科），20μ米氯化镉2（Wako）和1.5或2.5μ米OA编号2.OA编号2如前所述准备(贝克等. 2005).

质粒

pT3.5gstp1GFP是通过替换爪蟾pT2KXIG中EF1α增强子/启动子区域(川崎等. 2004)带有XhoI-不p3.5gstp1GFP的I片段(铃木等. 2005). 通过DNA测序验证了该结构。质粒pCS2nrf2、pCS2FLmKeap1、pCS2FLmKeap1C151S、pCS2FLmKeap1C288S、pKSgstp1N和pCS-TP已在前面描述(小林寺等. 2002,2009;川崎等. 2004).

微量注射

对于Nrf2和Keap1蛋白的过度表达，使用SP6 mMESSAGE mMACHINE生成合成的capped mRNA在体外转录试剂盒（Ambion，Austin，TX）使用上述pCS2衍生物的线性化DNA，并使用IM300微注射器在单细胞阶段注射到蛋黄中（日本东京Narishige）。用于击倒斑马鱼Nrf2(编号2)，反义吗啉寡核苷酸（Gene Tools，Philomath，OR），针对编号2(编号2生产任务单）(小林寺等. 2002)在单细胞阶段注射到蛋黄中。为了获得稳定的转基因株系，将25pg的pT3.5gstp1GFP或p3.5gstpGFP与25pgTol2（公差2）-转座酶mRNA的合成不是如前所述的I线性化pCS-TP(健内等. 2010).

表达式分析

在配备600CL-CU数码相机的MZFLII显微镜（德国威兹勒州莱卡）的GFP2（480 nm激发，510 nm屏障）滤镜下检测不同胚胎阶段的GFP表达（加利福尼亚州皮克斯拉·洛斯加洛斯）。在Biozero BZ-8000显微镜（日本大阪Keyence）的GFP-BP BZ过滤器（470 nm激发，535 nm发射）下分析幼虫期GFP的表达。为了拍摄延时照片，用0.016%的3-氨基苯甲酸乙酯（西格玛-阿尔德里奇，密苏里州圣路易斯）麻醉幼虫，并将其放置在含有3%甲基纤维素（西格马-阿尔德里希）的多孔玻片上进行固定。为了量化GFP的表达，使用配备BZ-8000显微镜的图像处理系统测量嗅觉区域的荧光强度。内源性的基因表达谷胱甘肽硫转移酶P1由一名就地如前所述，杂交分析、RT-PCR分析或实时RT-PCR(锂等. 2008;小林寺等. 2001).

MALDI-TOF MS分析

表达的重组小鼠Keap1蛋白大肠杆菌孵育有或没有100μ米OA编号2在25°C下，在含有20 m的缓冲液中保持60 min米三重-盐酸，pH 8.5。将胰蛋白酶消化的小鼠Keap1与二硫苏糖醇和三氟乙酸混合。为了提高MS的电离效率，在MS分析之前用Zip-tipμC18（密立波，贝德福德，马萨诸塞州）纯化样品。将肽与含有50%乙腈和0.1%三氟乙酸的α-氰基-4-羟基肉桂酸（2.5 mg/ml）混合，并在室温下在不锈钢靶上干燥。使用AXIMA-TOF2（日本东京岛津）和氮激光器进行分析。所有分析都是在正离子模式下进行的，仪器在每一系列研究之前都会立即校准。

补充材料

补充数据Tsujita等人2011年

支持信息/补充材料：

图S1DEM诱导稳定转基因株系中GFP的表达。

图S2组织GFP表达Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b幼虫在6dpf。

图S3Nrf2诱导GFP表达Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b胚胎。

图S4Keap1基因C288S突变对OA-NO的影响2响应。

表S1携带p3.5gstp1GFP或pT3.5gstp1GFP结构的稳定转基因株系的产生

表S2小鼠Keap1经OA-NO处理后MALDI-TOF MS鉴定的肽2

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补充数据Tsujita等人电影1

电影S1实时监测DEM诱导的GFP表达Tg（-3.5gstp1:GFP）it416b幼虫。

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补充数据津田等电影2

电影S2DEM诱导的GFP表达它567和它的同胞野生型幼虫。

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致谢

我们感谢樱花电影有限公司在电影方面的帮助。我们还感谢T.Kinoshita、H.Niu、T.Shimokoube和Y.Terashita在鱼类养护方面的帮助，以及T.Suzuki、M.Takeuchi和K.Mukaigasa的帮助和讨论。我们也感谢T.Kudoh对手稿的批判性阅读。这项工作得到了日本科技公司（ERATO）（向M.Y.）和日本教育、文化、体育、科学和技术部（向M.K.和M.Y.提供）的资助。

脚注

沟通人：Kohei Miyazono。

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