一种战略性设计的小分子通过氧化还原过程攻击肿瘤细胞中的α-酮戊二酸脱氢酶

化学制品

如前所述，由D，L脂肪酸合成高纯度CPI-613和CPI-157[18]. N-乙酰半胱氨酸（NAC）、金诺芬、瑞沙唑啉、黄递酶、谷胱甘肽-1、还原型谷胱甘苷、Triton X-100、洋地黄苷、十二烷基麦芽糖苷、二硫苏糖醇（DTT）、NAD⁺ADP、焦磷酸硫胺、辅酶A（CoA）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。生物素-HDPD和凝胶过滤柱（PD10）来自Thermo Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCF）、二氢乙锭（DHE）和Amplex Red来自Life Technologies。Prx1、Prx3和还原脂肪酸的抗体购自AbCam（美国马萨诸塞州剑桥）。抗二氢硫酰胺脱氢酶（E3）抗体来自Rockland Immunochemicals（宾夕法尼亚州Gilbertsville，美国），KGDH二氢硫胺琥珀酰转移酶（E2）抗体来自Cell Signaling（马萨诸塞州Danvers，美国）。

ATP测定

根据制造商的指示，使用CellTiter-Glo发光分析（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）测量细胞总ATP水平。

不同碳源线粒体ATP生成的评估

H460细胞以每孔10000个细胞的速度接种在RPMI（11 mM葡萄糖，2 mM谷氨酰胺）培养基中的黑色、透明底部96 well板中，并生长过夜。然后将培养基改为不含葡萄糖的RPMI，并单独或与0.1 mM水溶性油酸（Sigma-Aldrich）一起含有10 mM丙酮酸和2 mM谷氨酰胺。24小时后，用不含葡萄糖、含有10 mM丙酮酸和2 mM谷氨酰胺或0.1 mM油酸和0.5 mM天冬氨酸的新鲜RPMI替换培养基（与过夜适应相匹配），并在处理样品中或在对照组中仅在溶剂中含有CPI-613（240μM），持续2小时，然后测量ATP水平。

在这些未经药物处理的最终培养基中，细胞保持稳定和强健的ATP生成（仅线粒体）超过6小时，丙酮酸加谷氨酰胺和油酸产生可比的ATP输出。

小干扰RNA

抗二氢硫酰胺脱氢酶（E3）的小干扰RNA（siRNA）双工体购自IDT（Coralville，IA，USA），序列如下：5'-CCUGUGAGAUAGCUA，5'-CAGACUCUAGCUAUCU。按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Life Technologies）将siRNA双链转染到NCI-H460细胞中。

一氧化碳₂碳源氧化释放

如中所述，通过过滤器捕捉分析谷氨酸中二氧化碳的碳氧化释放[4]稍作修改。我们将每孔100000个细胞接种在48个培养皿中，每孔0.5 ml培养基中。18-25小时后，用单独含有药物溶剂（二甲基亚砜）的新鲜培养基或用CPI-613替换培养基，时间间隔和药物浓度如图所示。在最后30分钟的培养中，添加0.3μCi的放射性标记底物。终止时，向每个孔中加入75μl 3M高氯酸，并立即用苯乙胺饱和的3mm圆盘覆盖孔，以捕获释放的CO₂24小时后，将圆盘转移到装有1毫升Biosafe-II闪烁鸡尾酒的闪烁瓶中（国际研究产品公司，伊利诺伊州展望山公司）并进行计数。

细胞内活性氧水平的定量

将H460细胞置于35 mm的组织培养皿中，密度约为300000个细胞，隔夜培养。16至20小时后，在指定时间内添加药物或溶媒对照。在药物治疗的最后15分钟，添加5μM DCF或二氢乙硫醚（DHE）。然后通过胰蛋白酶分离细胞，并使用CellQuest Pro软件在FACScalibur流式细胞仪（BD，Franklin Lakes，NJ，USA）上收集细胞进行荧光激活细胞分选（FACS）分析。

稳态代谢物水平测定

简言之，样品被提取并等分，以便在气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱平台上进行分析[27]. 使用专有软件将离子与代谢物鉴定和峰面积积分代谢物定量的内部标准库进行匹配[28].

提取物根据Metabolon（北卡罗来纳州达勒姆，美国）基于甲醇的标准提取方案制备[27]. 样品在使用电子碰撞电离的Thermo-Finigan Trace DSQ快速扫描单四极质谱仪（马萨诸塞州沃尔瑟姆）上进行分析。（有关细胞制备、技术和统计分析的更多技术细节，请参阅附加文件1).

蛋白质印迹分析

对于western blot分析，向样品中添加2X十二烷基硫酸锂（LDS）负载缓冲液（500 mM Tris（pH 8.5）、4%LDS、20%甘油、1 mM EDTA、0.44 mM SERVA Blue G250、0.35 mM酚红，加上100 mM DTT，除非另有说明），然后在70°C下加热10分钟。蛋白质通过SDS-PAGE分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，并使用WesternBreeze检测试剂盒（Life Technologies）通过化学发光进行检测。

谷胱甘肽酰化蛋白的检测

谷胱甘肽酰化蛋白如前所述进行了修饰[21]. 简单地说，用CPI-613处理细胞3小时，用PBS洗涤，然后用含100 mM NEM的冰镇N缓冲液（40 mM HEPES（pH 7.4）、50 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM-EDTA和Pierce蛋白酶抑制剂混合物）处理5分钟，以烷基化游离巯基。然后如前所述纯化线粒体[29]并用0.05%的Triton X-100渗透。用1 mM NAC清除未反应的NEM，然后用2.0单位/ml的谷胱甘肽和1.4 mM的还原谷胱甘苷处理，使其脱谷胱甘氨酸蛋白半胱氨酸。然后用1.6 mM生物素-HPDP标记游离半胱氨酸5分钟，然后添加2 mM NAC以清除未反应的生物素-HDPP。生物素-HPDP-NAC通过凝胶过滤去除，并使用链霉亲和素结合Dynabeads（Life Technologies）按照制造商的说明捕获生物素化（谷胱甘肽化）蛋白质。然后将小球与含有100 mM DTT的2X LDS负载缓冲液混合，以释放捕获的蛋白质，然后进行蛋白质印迹分析。

脂肪酸保护试验

细胞在暴露于含有10 mM NEM的冰镇N缓冲液之前，用冰镇PBS清洗两次，以阻断非衍生化脂肪酸。在冰上培养5分钟后，将CHAPS以最终浓度1%添加到裂解细胞中。将裂解液转移到1.5 ml微型离心管中，并在冰上再培养5分钟，偶尔出现漩涡，然后在15000 x g下离心10分钟，使不溶性物质颗粒化。然后将上清液与最终浓度为100 mM的含有DTT的2X LDS负载缓冲液1:1混合，以逆转脂肪酸的氧化修饰（包括去除谷胱甘肽残基），并通过SDS-PAGE和western blot分析非衍生脂肪酸抗体。

过氧化氢生产分析

纯化猪KGDH（Sigma-Aldrich）生产过氧化氢在体外根据制造商的说明和[22].

过氧化物酶原测定

过氧化物酶原氧化状态如前所述进行分析[30]稍作修改。处理后，用冰镇PBS清洗细胞两次，然后用含有100 mM NEM的冰镇N缓冲液在冰上培养10分钟。以1%的最终浓度加入CHAPS，并在冰上摇动再孵育10分钟。样品在15000x g下离心10分钟，以形成不溶性物质颗粒。将上清液与2X负载缓冲液（不含DTT）结合，并在氧化条件下通过SDS-PAGE解析蛋白质，并通过蛋白质印迹进行检测。

体外α-酮戊二酸脱氢酶活性分析

在固体基质上生长的细胞，采用与通量分析相同的48 well平板格式（使用CPI-613处理或未处理），在室温下用PBS中0.03%的洋地黄素溶解2分钟，以选择性地破坏质膜，释放细胞溶质烟酰胺辅酶和碳源。用线粒体裂解黄油（0.5%月桂基麦芽糖苷、50 mM Tris（pH 7.4）和1 mM MgCl替换初始裂解液₂)两分钟。通过向线粒体裂解物中添加10X缓冲液启动12分钟反应，产生以下最终成分浓度：0.6 mM或0 mMα-酮戊二酸；50μM CoA；225μM焦磷酸硫胺；250微米NAD⁺; 50μM ADP；15μM谷胱甘肽；15μM重苏林；0.5单位/ml黄递酶。北美⁺通过上述重苏林还原法测定还原度。在此反应时间内，反应速率呈线性。

为了进一步研究KGDH氧化还原修饰在药物诱导的KGDH抑制中的作用，在重复反应中向两种裂解缓冲液中添加10 mM DTT。

电子传递链复合物I和III不是CPI-613诱导的线粒体活性氧物种的来源

线粒体ROS传统上与电子传输链（ETC）复合物I和III的电子流扰动有关。为了研究ETC在CPI-613诱导的活性氧和代谢效应中的作用，我们生成了缺乏ETC几个必需线粒体编码成分的ρ°-H460细胞，从而从复合物I或III中既不生成线粒体ATP也不生成ETC相关的活性氧[33,34]. 我们通过检测线粒体DNA（mtDNA）编码蛋白的水平验证了ρ°-H460细胞。图三A显示在这些ρ°细胞中未检测到mtDNA编码的蛋白细胞色素c氧化酶亚单位I的水平，而核编码蛋白肌动蛋白和二氢硫酰脱氢酶（E3）的水平与亲本（ρ⁺)H460电池，如预期。此外，根据DHE氧化评估，这些细胞不再能够对ETC复合物III抑制剂抗霉素A产生ROS反应（图三B） ，进一步确认其ρ°状态。最后，ρ°状态也显著减弱了ETC复合物I抑制剂鱼藤酮产生的ROS，而通过相同的测定对CPI-613诱导的ROS没有相应的影响（附加文件2).

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图3

CPI-613诱导的线粒体活性氧物种来源于非电子传输链。（A）从H460（ρ⁺)如前所述[26]并通过western blot验证，证明不存在mtDNA编码的蛋白细胞色素c氧化酶亚基1（COX1），但含有核编码的线粒体蛋白二氢硫酰胺脱氢酶（E3）。细胞核编码的细胞溶质肌动蛋白作为负荷控制。（B）在240μM CPI-613或4μM抗霉素A处理后，使用超氧化物检测染料DHE对ROS水平进行量化，然后进行FACS分析。CPI-613诱导的活性氧的可比量（ρ°和ρ）⁺而复合III ROS诱导剂抗霉素A未能增加ρ°细胞中的DHE荧光。结果代表了三个实验。（C）对ρ°H460细胞进行线粒体Prx3蛋白氧化测定，与ρ⁺在图中2C.尽管缺乏关键ETC成分，但这些ρ°细胞通过本试验产生了高水平的线粒体ROS。（D）抗氧化剂NAC可保护ρ°细胞免受CPI-613诱导的细胞死亡，药物治疗20小时后通过全细胞ATP水平进行检测。误差条代表SEM。DHE，二氢乙锭；二甲基亚砜；线粒体DNA；NAC，N-乙酰半胱氨酸。

相比之下，经CPI-613处理后，ρ°–H460细胞的活性氧水平继续大幅增加。这种增加的幅度与ρ中所示的相似⁺-H460电池（图三B） ●●●●。此外，经CPI-613处理的ρ°细胞显示氧化线粒体Prx3水平增加（图三C） 对药物诱导细胞死亡的敏感性与父母相似（ρ⁺)H460细胞（结果未显示）。这些结果表明ETC复合物I或III在CPI-613诱导的活性氧生成和细胞死亡中很少或根本不参与。最后，NAC还保护ρ°-H460细胞免受药物诱导的细胞死亡（对比图2E和​和3D），三D） 表明，除复合物I或III外，来自某些线粒体来源的ROS依赖性效应有助于CPI-613诱导的细胞死亡。

E3是CPI-613刺激活性氧信号的主要来源

KGDH的二氢硫辛基脱氢酶（E3亚单位）已被确定为线粒体ROS的主要非ETC生成物[22,23]. 我们使用过氧化氢检测染料Amplex Red检测CPI-613对纯化猪心KGDH产生过氧化氢的影响。CPI-613处理导致过氧化氢生成增加，这表明KGDH可能是体内CPI-613线粒体ROS信号（图4A） ●●●●。注意图中所示的荧光变化4A不是药物对Amplex Red分析系统直接作用的结果，如无KGDH的对照组所示（附加文件三). 此外，相关的脂肪酸类似物CPI-157（图1C） ，在细胞中不会产生显著的ROS（图4B） 对肿瘤细胞的杀伤能力较差（图4C） ，未能增加在体外KGDH ROS生产。总之，这些观察结果证实了KGDH E3可能体内CPI-613诱导活性氧的来源。

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图4

α-酮戊二酸脱氢酶产生过氧化氢及其影响的分析体内和在体外.（A）体外生成H₂O（运行）₂KGDH通过Amplex Red氧化进行定量。KGDH与CPI-613共注入增加了H₂O（运行）₂KGDH发电在体外CPI-157，一种缺乏脂肪酸类似物体内抗癌活性，用作阴性对照（见面板B类和C类). CPI-157未能增加在体外KGDH ROS生产。数据是三个独立实验的代表。(**P（P）与对照组相比<0.005，ns=与对照组相比不显著；学生t检验；n=3）。（B）CPI-157刺激线粒体H₂O（运行）₂根据Prx3氧化评估，处理细胞的生成较差。（C）CPI-157是一种非活性脂肪酸类似物，其杀灭肿瘤细胞的能力有限。（D）在siRNA介导的E3（二氢硫酰胺脱氢酶）亚单位敲除后，H460细胞暴露于240μM CPI-613中3小时，并检测Prx3氧化（左）。对siRNA处理的细胞中E3蛋白水平的评估显示了有效的敲除（右）。（E）二聚体：面板中单体比率的量化D类使用NIH Image-J软件**P（P）<0.005（学生t检验；n=3）***P（P）<0.0005（学生t检验；n=3）；ns=不显著。（F）使用Cell-TiterGlo试剂盒（Promega）检测E3 siRNA敲除后用240μM CPI-613处理16小时的H460细胞的ATP含量。在这些条件下ATP的丢失是细胞死亡的诊断[18]. 数据表示为DMSO控制的百分比**P（P）<0.005（学生t检验；n=3）。所有结果至少代表三个实验。误差线代表SEM。DMSO，二甲基亚砜；DTT，二硫苏糖醇。

为了直接验证这一假设，我们使用siRNA来敲低E3蛋白（图4D） ●●●●。在E3水平降低到内源性水平的10%以下后，我们观察到药物治疗后线粒体ROS显著下降（通过Prx3二聚体测定）（图4D、 在4E中量化）。这一观察结果有力地支持了以下假设：线粒体脱氢酶复合体的E3是CPI-613诱导的活性氧的重要来源。最后，E3敲除显著保护CPI-613诱导的细胞死亡（图4F） 药物治疗16小时后。

本实验中细胞死亡的部分保护与我们之前观察到的PDK被击倒时的类似部分保护[18]共同表明，CPI-613对PDH和KGDH的作用有助于H460细胞中药物诱导的细胞死亡。更具体地说，每一种保护作用都具有高度的重复性和统计显著性；然而，如果靶向KGHD和PDH都能部分促进CPI-613诱导的细胞死亡，那么更长的治疗时间或更高的药物剂量将克服保护作用。

CPI-613以氧化还原依赖的方式抑制肿瘤细胞α-酮戊二酸脱氢酶

活性氧已被证明可以调节许多细胞代谢酶[三,5,8]. 此外，一些研究表明，KGDH可能受到氧化还原调节（参见[35,36]). 这些观察结果表明，KGDH可能不仅是CPI-613诱导的ROS信号的来源，也是该信号的靶点。

为了研究CPI-613对KGDH活性的影响，我们通过监测CO来检测KGDH的碳通量₂细胞释放脉冲标记为1-¹⁴C-谷氨酸盐。谷氨酸在线粒体中转化为α-酮戊二酸，通过KGDH的氧化脱羧作用进入TCA循环，导致1-碳作为CO的释放₂用CPI-613处理细胞导致放射性标记的CO大量减少₂在1之后释放-¹⁴H460肺癌的C-谷氨酸脉冲（图5A） 和BxPC-3（图5B） 胰腺癌细胞，表明CPI-613抑制KGDH活性。注意，在这些短的治疗时间内，药物诱导的细胞死亡对KGDH活性的降低贡献微乎其微（图5A、 B）。

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图5

CPI-613选择性抑制肿瘤细胞中的α-酮戊二酸脱氢酶活性。（A、B）通过KGDH的通量在H460中进行了分析（A）和Bx-PC3（B）使用脉冲传递1的肿瘤细胞-¹⁴C-标记的谷氨酸，其标记的碳以CO形式释放₂由KGDH提供。每个通量面板在右侧与一个平行实验耦合，证明在用于通量分析的时间过后，细胞死亡（通过ATP水平测量，在药物治疗恢复3小时之前或之后）发生得很好。（C）与模拟处理的样品（开盒）相比，240μM CPI-613（阴影盒）处理2小时后BxPC-3肿瘤细胞的稳态代谢产物分析显示，TCA循环中间产物柠檬酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐和苹果酸盐减少，补体输入丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺增加。（D）TCA循环图，其两个主要碳进入点，以及支持丙氨酸和天冬氨酸分解代谢的补体转氨酶。（E、F）正常HBT细胞显示Prx3氧化没有增加（E）仅对KGDH通量有轻微的短暂抑制（F）在对肺癌细胞产生强大作用的条件下。面板中的车辆控制F类指肿瘤细胞；重型作战旅车辆控制系统的表现类似。所有结果均代表至少三个实验或（小组C类)数据点集合。误差条代表SEM，面板除外C类其中它们代表95%的置信限。方框图（面板C类)用于传递数据的分布，中间50%的数据由方框和胡须表示，用于报告数据的范围。方框中的实线表示测量值的中值，而+表示平均值。任何异常值都显示为图中胡须外的点。DTT，二硫苏糖醇；HBT细胞，原代人支气管/气管上皮细胞；KGDH，α-酮戊二酸脱氢酶。

为了进一步证实CPI-613对KGDH活性的抑制作用，我们与Metabolon，Inc.合作在BxPC-3细胞中进行了稳态代谢组学分析。用CPI-612处理BxPC-2细胞导致KGDH下游的琥珀酸、富马酸和苹果酸、TCA循环中间产物、，如预期的那样，如果KGDH被药物治疗抑制（图5C、 D）。尽管在这些实验中底物α-酮戊二酸和丙酮酸的水平太低，无法测量，但谷氨酰胺（KGDH底物的替代物）在处理过的细胞中显示出25%的标度强度水平，证实了KGDH的抑制作用。作为TCA循环中间体减少的更一般的控制，我们观察到分解代谢取决于TCA循环的不同代谢物的预期升高（例如，丙氨酸升高33%，天冬氨酸升高28%）。注意，柠檬酸盐水平也降低了，这与CPI-613对PDH活性的已知抑制一致[18]. 考虑到谷氨酰胺通过KGDH的补充输入，柠檬酸盐水平的降低不太可能是琥珀酸、富马酸和苹果酸水平降低的原因。

我们之前证明了CPI-613效应的显著肿瘤细胞选择性，表明通过过度刺激调节性磷酸化对PDH的药物抑制对肿瘤细胞具有高度选择性，与肿瘤细胞中诱导细胞死亡的显著选择性相关（见图​图4B4B英寸[18]). 在这里，我们为CPI-613肿瘤细胞选择性添加了重要的新证据。具体而言，CPI-613对正常人原代支气管上皮细胞系HBT（H460肺癌细胞的非恶性对照）的反应中，CPI-633对Prx3的强烈氧化和KGDH通量的抑制作用不存在（图5E、 F）。

为了评估这些结果反映线粒体功能广泛丧失而非KGDH特异性抑制的可能性，我们研究了CPI-613对脂肪酸氧化产生能量的急性影响。该过程产生大量线粒体ATP，与TCA循环无关，其功能受到KGDH和PDH失活的影响。具体来说，脂肪酸的初始线粒体β氧化直接将还原当量传递到电子传输系统。由此产生的醋酸盐单元（乙酰-CoA）作为柠檬酸盐排泄，允许通过柠檬酸盐合成酶反应循环再生游离CoA。柠檬酸合成酶反应通过介质提供的天冬氨酸的转氨作用提供其其他必要底物草酰乙酸。

为了检测这些功能的状态，我们利用了我们之前的证明，即当细胞只提供线粒体碳源（不含葡萄糖）时，线粒体ATP合成可以直接检测[18]. 正如预期的那样，由TCA循环依赖性底物（丙酮酸和谷氨酰胺）维持的H460细胞线粒体ATP合成被CPI-613治疗迅速而灾难性地抑制（图6D） ●●●●。相比之下，当这些细胞被提供脂肪酸（油酸）作为唯一的主要碳源时，急性药物治疗对ATP合成几乎没有影响（图6D） ●●●●。

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图6

CPI-613诱导活性氧物种介导的谷胱甘肽酰化和抑制肿瘤细胞α-酮戊二酸脱氢酶。（A）使用生物素开关捕获谷胱甘肽化蛋白后，在CPI-613处理的细胞中富集的KGDH E2（文本）。通过与250μM NAC共同处理抑制KGDH谷胱甘肽酰化。（B）用240μM CPI-613处理细胞，然后暴露于100 mM NEM中，随后进行100 mM DTT，化学逆转氧化还原修饰。天然KGDH脂肪酸的Western blot分析表明CPI-613处理样品中NEM保护残留物的水平增加。因此，KGDH脂肪酸硫是药物诱导氧化还原修饰的靶点。（C）α-酮戊二酸产生强健在体外北美⁺在CPI-613处理的细胞中，这一过程被显著抑制。通过对裂解产物进行10 mM DTT处理，可以减轻这种抑制作用。因此，来自CPI-613处理细胞的KGDH被氧化还原修饰抑制。（D）CPI-613（240μM下2小时）选择性抑制由PDH和KGDH底物、丙酮酸和谷氨酰胺驱动的线粒体ATP生成，但不受脂肪酸氧化驱动。（E）500μM NAC增加了通过KGDH的碳通量，表明H的作用₂O（运行）₂KGDH对H460肿瘤细胞的调节。NAC处理强烈逆转CPI-613对KGDH活性的抑制。这种效应的幅度（4.7倍）大于未经处理细胞中碳通量的增加（2.3倍），表明NAC除了在无药物的情况下对KGDH调节的影响外，还可以逆转CPI-613对KGDH-活性的抑制。（F）提出了CPI-613对KGDH的作用机制模型。CPI-613可能会“误导”现有的肿瘤细胞KGDH氧化还原自动调节（阴影方框箭头），增加E3亚单位产生的ROS信号（包括反向反应、NADH氧化），导致E2-亚单位氧化还原修饰和KGDH抑制。所有结果都代表了至少三个独立的实验。误差线代表SEM。DMSO，二甲基亚砜；DTT，二硫苏糖醇；α-酮戊二酸脱氢酶；N-乙酰半胱氨酸；NEM，N-乙基马来酰亚胺。

这一结果表明，TCA循环外的线粒体能量代谢的大量片段仍然有功能（包括β-氧化机制、电子传输系统和ATP合成酶），这与CPI-613效应仅限于特定靶点（包括KGDH）一致。

CPI-613诱导活性氧介导的α-酮戊二酸脱氢酶失活和谷胱甘肽酰化

KGDH的二氢硫酰胺琥珀酰基转移酶（E2）亚单位含有具有氧化还原敏感靶点预期特征的硫，包括酶的脂肪酸（图1). 当暴露于活性氧中时，这些硫容易发生氧化修饰，包括那些最终导致谷胱甘肽酰化的硫。脂肪酸巯基的谷胱甘肽酰化与活性氧暴露引起的酶抑制有关[24]. 为了测试活性氧诱导的谷胱甘肽酰化是否发生在CPI-613处理的反应中，我们使用了一种改进的生物素开关分析来富集谷胱甘苷酰化蛋白[21]. CPI-613治疗后，我们观察到KGDH E2亚基的谷胱甘肽酰化水平大幅增加（图6A） ●●●●。值得注意的是，NAC治疗阻止了KGDH E2谷胱甘肽酰化的增加，为ROS直接参与CPI-613修饰KGDH活性提供了进一步证据。

除了脂肪酸的硫以外，E2亚单位还含有多个半胱氨酸残基，这些残基也可能容易被谷胱甘肽酰化。为了测试KGDH的脂肪酸残基是否可能是药物诱导氧化还原修饰的靶点，我们利用了识别天然脂肪酸而非化学修饰脂肪酸的抗体。谷胱甘肽酰化和/或其他氧化还原修饰保护脂肪酸硫免受烷基化剂NEM的化学衍生化。CPI-613处理导致NEM暴露后烷基化脂肪酸残余物显著减少（图6B） ●●●●。这一结果表明，由于CPI-613治疗，KGDH脂肪酸残基获得了可逆的、氧化还原敏感的修饰（包括谷胱甘肽酰化和/或其他衍生物），预期可以阻断KGDH E2活性。

为了证实CPI-613直接抑制KGDH，我们检测了处理细胞裂解液中的酶活性。虽然氧化还原蛋白修饰的不稳定状态足够高，但我们并不期望裂解物中的酶能够完全重演体内尽管如此，我们还是探索了是否可以保留可测量的KGDH修饰在体外如预期的那样，CPI-613对H460细胞的处理在所得裂解物中产生了KGDH活性的显著、可重复的降低（图6C） ●●●●。此外，通过用还原剂DTT处理裂解产物，这种药物诱导的KGDH抑制被消除（图6C） ●●●●。这一结果证实CPI-613效应包括以氧化还原依赖方式直接抑制KGDH活性。

在本研究中，DTT处理对KGDH活性的小超诱导是可重复的，具有启发性。我们在更稳健的体内环境。