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摩尔细胞。作者手稿；PMC 2015年7月17日发布。
以最终编辑形式发布为：
分子细胞。2014年7月17日；55(2): 253–263.
2014年5月29日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.molcel.2014.05.008
预防性维修识别码：项目经理4106038
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院598173
PMID：24882210

哺乳动物细胞胞浆和线粒体中NADPH分区代谢的追踪

卡罗琳·刘易斯,1,† 赛斯·J·帕克,2,† 布莱恩·菲斯克,1 道格拉斯·麦克洛斯基,2 丹·桂,1 考特尼·R·格林,2 娜塔莉·沃克斯,1 亚当·费斯特,2 马修·范德·海登,1,三，*和克里斯蒂安·梅特罗（Christian M.Metallo）2,4,*
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补充资料

总结

真核细胞将不同细胞器中的生化过程分隔开来，通常依靠代谢循环将还原当量穿梭于细胞膜上。NADPH是维持氧化还原稳态和还原性生物合成的电子载体，在每个位置有单独的细胞溶质和线粒体池提供还原力。这种细胞组织对许多功能至关重要，但使用可用的方法分析代谢途径却很复杂。在这里，我们开发了一种方法来解决细胞质和线粒体中存在的NADP（H）依赖性途径。通过在以NADPH为辅因子的分区反应中追踪氢，包括通过突变的异柠檬酸脱氢酶产生2-羟基戊二酸，我们可以在这些不同的细胞室中观察到代谢途径的活性。利用该系统，我们确定了线粒体和细胞质中丝氨酸/甘氨酸相互转化的方向，突出了该方法解决完整细胞中的分区反应的能力。

介绍

真核细胞代谢的定义特征之一是不同细胞器中反应的分区。尽管跨细胞器代谢通量的协调对细胞生理学至关重要，但无法清楚地观察存在于多个亚细胞位置的相同反应是理解细胞代谢的主要障碍。许多这些分区反应是氧化/还原（氧化还原）反应，利用吡啶核苷酸辅助因子在代谢物之间转移电子，以支持生物合成、氧化还原内稳态、信号转导和ATP生成(Pollak等人，2007a). 例如，NAD的减少+NADH从分解代谢反应中获取能量，通过线粒体氧化磷酸化驱动ATP合成，而NADPH通过不同的反应再生，以维持还原型谷胱甘肽（GSH）库并支持还原性生物合成(Lunt和Vander Heiden，2011年). 因此，NADPH被假设为在细胞应激反应中限制增殖、脂质生物合成和存活(Diehn等人，2009年;Jeon等人，2012年;Jiang等人，2013年;Schafer等人，2009年). 这些分隔的代谢过程影响许多细胞和组织功能；因此，了解跨隔室的生化网络是如何发挥作用的，对于确定新陈代谢是如何导致疾病病理的。

细胞中NADP（H）的池相对于利用该辅因子的途径的流量来说很小(Pollak等人，2007a). 因此，氧化态和还原态之间的相互转化必须在涉及该辅因子的所有反应中耦合，并且大量的变化可能无法为评估NADPH在特定途径中的使用提供信息。已知NAD（H）和NADP（H）都不能跨细胞膜转运(Nikiforov等人，2011年;Pollak等人，2007b)和涉及分区氧化还原反应的多步穿梭用于在线粒体和细胞溶质之间转移电子(Bissell等人，1976年;LaNoue等人，1974年;LaNoue和Schoolwerth，1979年). 该组织有助于维护不同的NADPH/NADP+每个亚细胞位置的比率，并允许执行特定于细胞室的代谢过程。经典地，细胞溶质NADPH被认为主要通过氧化戊糖磷酸途径（PPP）再生(Lunt和Vander Heiden，2011年;Pollak等人，2007a). 哺乳动物细胞中还存在其他可能的NADPH细胞质来源，包括异柠檬酸脱氢酶（IDH）、苹果酸酶（ME）、醛脱氢酶（ALDH）和亚甲基四氢叶酸脱氢酶的特定同工酶催化的反应(Pollak等人，2007a;Tibbetts和Appling，2010年). 然而，其中几种酶的亚型也能催化线粒体中的相同反应，并可能在线粒体和细胞质之间转移还原当量。例如，IDH2将α-酮戊二酸（αKG）还原羧基化为异柠檬酸盐会消耗线粒体NADPH，随后柠檬酸盐/异柠檬酸酯被运输到胞浆中，在胞浆中可以被IDH1氧化生成胞浆NADPH(萨扎诺夫和杰克逊，1994年;怀斯等人，2011年). 理论上，反向循环可用于产生线粒体NADPH。像这样的代谢循环利用了特定于细胞室的酶，而现有的跟踪代谢的方法依赖于分解细胞和汇集来自所有细胞室的代谢物，因此不可能可靠地区分通过每个酶或途径的净反应流量。

结果

使用跟踪NADPH2氢标记葡萄糖

因为涉及吡啶核苷酸的反应机制将电子作为氢化物（H−)离子、同位素标记的氢原子可用于跟踪这些反应中的电子运动(Katz等人，1965年;Rendina等人，1984年). 转让2H和三H还可以用于观察中心碳代谢中的氧化还原反应，这是一种用于深入了解真核细胞中NAD（P）H代谢的方法(Ben-Yoseph等人，1994年;Ruhl等人，2012年). 葡萄糖是哺乳动物细胞糖酵解和氧化PPP的主要碳源，后一种途径是胞浆NADPH的重要来源。通过氧化PPP酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGD）将特定葡萄糖碳（分别为1和3位）上的非活性氢原子转移到NADPH。在磷酸三糖异构酶（TPI）异构化为甘油醛-3-磷酸（GAP）的过程中，葡萄糖碳-3上的氢原子（在糖酵解中变成磷酸二羟丙酮的碳-1）可以与水交换(Katz等人，1965年). 这避免了下游代谢物（包括TCA循环中间产物）的混淆标记，表明追踪该氢原子可以提供量化6PGD对细胞NADPH库贡献的方法(图1A) (Katz等人，1966年;Katz和Rognstad，1978年). 为了测试这种可能性，我们在[3-2H] 葡萄糖和NADPH的LC/MS-MS观察标记(图1B). NADPH的快速周转允许从[3-2H] 葡萄糖在30分钟内达到同位素稳定状态，在有[3-2H] 葡萄糖24小时(图1B). NADPH有两个氢，当它作为电子供体时可以转移。一旦标记，根据下游NADPH利用酶的立体特异性，标记或未标记的氢原子都可以转移(你，1985年). 从标记的NADPH转移未标记的氢化物生成标记的NADP+(图S1A)以及随后在NADP上标记第二氢+在随后的时间点，NADPH重两个质量单位（M2）(图1B). 在后期也观察到一些核糖-5-磷酸和核酮糖-5-磷酸酯的标记，可能是通过非氧化PPP的通量(图S1B). 这种标记并入NADP（H）的核糖部分可以解释24小时观察到的同位素富集的一小部分，正如NADP的少量M+2标记所表明的那样+(图S1A)，但这些原子在利用NADPH作为辅因子的下游反应中不会发生转移。[3-2H] 葡萄糖不参与NAD（H）的合成，除非与核糖部分结合，并且在后期只有少量NAD（H）被标记(图S1C)，认为[3-2H] 葡萄糖反映氢化物转移。重要的是，低糖酵解中的代谢物，如丙酮酸和乳酸，在[3中没有标记-2H] 葡萄糖（见图1A)这意味着下游代谢物上的标记必须是由标记的NADPH的氢化物转移引起的。[1-2H] 通过氧化PPP中的G6PD标记NADPH(图S1D–E)，和类似于[3-2H] NADP上检测到葡萄糖+戊糖磷酸途径中间体(图S1E–F). 然而，[1的碳-1上存在氘-2H] 由于磷酸葡萄糖异构酶的可逆性，葡萄糖可能会丢失，导致来自[1的葡萄糖-6-磷酸标记减少-2H] 细胞内葡萄糖与[3]中的标记物的比较-2H] 葡萄糖(图S1G) (Ben-Yoseph等人，1994年;Hellerstein等人，1986年;Katz和Rognstad，1976年). 与[3相比-2H] 葡萄糖，葡萄糖碳-1的氘同位素，在任何糖酵解反应中都不与水交换，并保留在进入TCA循环的碳上(图S1D). 因此，氘来自[1-2H] 葡萄糖有可能通过NADPH的氢化物转移或葡萄糖在碳上的标记保留来标记下游代谢物。因此，使用[3-2H] 葡萄糖优选用于追踪由氧化PPP产生的NADPH。

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的使用2葡萄糖标记细胞溶质NADPH

A）描述氘转移模型的原子转移图-2H] 葡萄糖通过糖酵解和戊糖磷酸途径。打开的大圆圈表示碳，小的红色圆圈表示[3中的氘标签-2H] 葡萄糖。如测量，显示亲本H1299细胞中糖酵解中间产物的M1同位素丰度（%）。B）[3中NADPH的标记-2H] 随着时间的推移，亲代H1299细胞中的葡萄糖含量。C）饱和脂肪酸标记（肉豆蔻酸；C14:0，棕榈酸酯；C16:0和硬脂酸C18:0）来自[3-2H] 孵育72小时后亲代H1299细胞中的葡萄糖。D）胆固醇标签来自[3-2H] 培养72小时的亲代H1299细胞中的葡萄糖。E）增脂[2H] -NADPH由[3-2H] 用示踪剂孵育72小时后，通过亲代H1299和A549细胞中饱和脂肪酸合成（ISA）模型估算葡萄糖。a-d中绘制的数据表示至少三个生物重复的平均值±SD。对于e，给出的数据是至少三个生物重复的平均±95%置信区间。

我们观察到的NADPH标记是整个细胞池的一个子集。为了深入了解特定于细胞室的氧化还原反应，我们接下来对其进行了量化2NADPH依赖反应下游特定代谢物中的H富集。例如，脂肪酸和胆固醇的合成具体发生在胞浆中，需要NADPH。当H1299细胞与[3-2H] 葡萄糖72小时以允许新的脂质分子的积累，我们在新合成的脂肪酸上检测到显著的标记；包括肉豆蔻酸酯（C14:0）、棕榈酸酯（C16:0）和硬脂酸酯（C18:0）；以及胆固醇(图1C-D). 重要的是，没有来自[3]的标签-2H] 在柠檬酸盐中检测到葡萄糖（参见图1A)表明脂质的同位素富集来自NADPH池，该池被氧化PPP标记。我们还检测到[1-2H] -葡萄糖(图S1H); 然而，G6PD-衍生NADPH的追踪因[1中的氘而变得复杂-2H] 葡萄糖保留在柠檬酸盐和脂肪生成乙酰辅酶A上(图S1D). 接下来，我们应用同位素光谱分析（ISA）来估计[3-2H] 葡萄糖进入脂肪生成NADPH池，用于棕榈酸合成，因为生产一个棕榈酸分子时需要十四个NADPH分子(Kharroubi等人，1992年;Metallo等人，2012年). ISA模型包括两个参数，分别表示NADPH池的氘富集度和合成棕榈酸酯的百分比从头开始(图S2). 使用该方法，我们估计了脂肪生成NADPH在[3-2H] A549和H1299细胞的葡萄糖含量为12-20%(图1E). 对其他饱和脂肪酸（例如肉豆蔻酸和硬脂酸）的ISA建模得出了对脂肪生成NADPH富集的类似估计-2H] 葡萄糖(图1E).

的使用2葡萄糖对NADH代谢的示踪作用

通过糖酵解细胞溶质NAD维持流量+水池主要由三种酶再生：乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）和/或甘油磷酸梭（Gly3PDH）(Lunt和Vander Heiden，2011年;Metallo和Vander Heiden，2013年). 葡萄糖上不同的氢原子转移到NAD+通过甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）进行糖酵解。理论上，通过GAPDH转移到NADH的氢有一半来自葡萄糖的碳四；然而，醛缩酶和TPI反应中与水的交换减少了该氢原子对NADH的净贡献(Go等人，2009年) (图2A). 用[4-2H] 葡萄糖、乳酸、苹果酸和3-磷酸甘油的显著标记(图2B). A549细胞GAP上检测到标记物；然而，H1299细胞的GAP水平低于检测极限。此外，在低糖酵解代谢产物（包括PEP、3PG和丙酮酸）上未检测到标记。这种模式符合已知的在中心碳代谢中使用NADH的反应(图2A)并表明[4]-2H] 葡萄糖可用于标记细胞糖酵解产生的NADH池。与这些发现一致，我们观察到[4-2H] NADH上的葡萄糖(图2C)以及NAD+上的标签(图S3A)来自M+1标记NADH的未标记氢化物的捐赠。

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的使用2葡萄糖标记NADH

A）描述氘转移模型的原子转移图-2H] 葡萄糖通过糖酵解和NAD+依赖的穿梭系统（苹果酸脱氢酶中密度脂蛋白，甘油3-磷酸脱氢酶甘氨酸3PDH，和乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶). 打开的大圆圈表示碳，小绿色圆圈表示氘标签来自[4-2H] 葡萄糖。B）[4中糖酵解中间体的标记-2H] A549（左侧面板）和H1299（右侧面板）细胞中的葡萄糖。3-磷酸甘油醛（GAP）低于H1299细胞的检测限，用*表示。C）[4中NADH的标签-2H] 随着时间的推移，亲代H1299细胞中的葡萄糖含量。D）棕榈酸标签来自[4-2H] 用示踪剂培养72小时后A549和H1299细胞中的葡萄糖。E）[4中NADPH的时间历程标记-2H] 亲代H1299中的葡萄糖。给出的数据是至少三个生物重复的平均值±SD。

有趣的是，我们从[4-2H] 葡萄糖(图2D)表明NADH的一些标记通过未知机制转移到胞质NADPH(图S3F). 而氘标签来自[4-2H] 由于富马酸盐的对称性，在天冬氨酸、柠檬酸和异柠檬酸盐上检测到葡萄糖(图S3B–D)，以这种方式标记的碳不会促进脂肪生成乙酰辅酶A，这表明观察到的脂肪酸标记是从NAD（H）到胞浆NADP（H）的氢化物转移而来的。我们还观察到NADP上有一些同位素富集+和NADPH来自[4-2H] 葡萄糖(图2E和图S3A); 然而，核糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸也被标记自[4]-2H] 葡萄糖(图S3E). 此外，这些直接测量细胞NADP（H）总量的方法无法区分细胞溶质和线粒体池，这突出表明需要采用方法来阐明特定于细胞室的NADP（H）池。

追踪NADPH分区来源的报告系统

上述数据表明，我们可以观察到完整细胞中NADPH和NADH的胞浆生成。尽管我们能够量化氧化PPP酶对脂肪生成NADPH库的贡献，但仅用氘追踪无法区分NADPH的其他分区来源。因此，我们试图开发一种报告系统，可以检测不同亚细胞隔室中路径特异性NADPH的产生。为了实现这一点，我们利用了产生(D类)来自αKG的2-羟基戊二酸（2HG）。该反应通过从NADPH转移氢化物形成2HG来减少αKG。因为2HG是一种异种代谢物，在大多数细胞中只存在非常低的水平(Matsunaga等人，2012年)，它可以用作最终产品读数。通过应用特定的代谢2细胞H-示踪物和测量外显突变型IDH1（胞浆）或IDH2（线粒体）产生的2HG的富集度，我们推断可以获得每个隔室中NADPH代谢的路径特异性信息(图3A).

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诱导突变型IDH表达细胞系的建立和鉴定

A）演示通过突变IDH酶催化的反应将氘（红点）从NADPH转移到2HG的示意图。mtIDH1定位于细胞质，mtIDH2定位于线粒体。通过表达隔室特异性突变酶，并将其与氘化葡萄糖示踪剂结合，可以追踪2HG的生成，因此NADPH的来源是用来在细胞质或线粒体中生成2HG。B）突变体IDH1-R132H定位于胞浆（mtIDH1-C），突变体IDH2-R172K定位于H1299和A549细胞的线粒体（mtIDH2-M）。在多西环素诱导启动子的控制下，用包含编码C末端FLAG标记的IDH1-R132H或IDH2-R172K的cDNA的慢病毒构建物转导细胞。建立稳定的细胞系后，用0.1µg/mL多西环素处理细胞24小时。使用FLAG、细胞色素C（线粒体特异性标记物）和Hsp70（细胞质特异性标记）抗体，通过细胞分馏和Western blotting分析蛋白质表达。C： 上清液-100组分（细胞质）；M： 线粒体。水平方向斑点之间的白线表示单独的凝胶。C）表达诱导型IDH突变体的细胞株以强力霉素依赖的方式产生2HG。用多西环素（0.1µg/mL）处理稳定表达可诱导mtIDH1-C或mtIDH2-M构建物的H1299和A549细胞24小时。显示2HG（总离子计数：TIC）的量相对于用载体处理的GFP对照细胞。D）在IDH1（R132C/+，HT1080）和IDH2（R172S/+，SW1353）内源性突变的细胞系中，通过2HG/αKG比率测量的2HG生成量远高于表达mtIDH1-C和mtIDH2-M的细胞。E）戊糖磷酸途径（6PGD）产生的NADPH是细胞溶质。细胞培养于[3-2H] -葡萄糖（10mM）24小时，然后添加强力霉素（0.1µg/mL）24小时以诱导突变IDH表达和M1标记量（%）-2H] -测量加入2HG和αKG的葡萄糖。F）NADH支持线粒体中NADPH的生成。用10mM[4培养细胞-2H] -葡萄糖24小时，并按照E进行处理和分析。数据表示至少三个生物复制品的平均值±SEM。

我们生成了以强力霉素依赖性方式表达表位标记突变体IDH1-R132H（mtIDH1-C）或突变体IDH2-R172K（mtIDH2-M）的H1299和A549细胞系(图S4A). 我们使用弱启动子来最小化对内源性IDH代谢的影响。事实上，标记的mtIDH1-C在这些细胞中的表达水平是用识别野生型IDH1酶的抗体无法检测到的(图S4A). mtIDH1-C有望在细胞质中表达，mtIDH2-M有望在线粒体中表达，我们通过细胞分级和蛋白质印迹证实了每一种的定位(图3B). 我们还证实，在H1299和A549细胞系中，标记的突变IDH酶以强力霉素依赖的方式产生2HG(图3C). 有趣的是，mtIDH1-C在细胞中产生的2HG少于mtIDH2-M，这与体外表达的IDH2突变体比IDH1突变体产生更多2HG的观察结果一致，因为它们的线粒体定位(Ward等人，2013年). 在所有病例中，2HG水平均远低于表达IDH1（R132C/+，HT1080）或IDH2（R172S/+，SW1353）内源性突变的肿瘤细胞系中观察到的水平(图3D). 引入突变的IDH酶可能影响NADPH或TCA代谢；然而，在高水平表达IDH1突变的细胞系中观察到的2HG产生通量相对于其他αKG依赖性反应通量较小，表明突变IDH表达对αKG库的直接影响最小(Grassian等人，2014年). 此外，[3中没有重大变化-2H] 在表达mtIDH1-C或mtIDH2-M后，在A549细胞中观察到葡萄糖对胞浆NADPH的贡献(图S4G).

虽然强力霉素可以影响培养的一些哺乳动物癌细胞系的代谢和增殖(Ahler等人，2013年)，我们没有看到中心碳代谢产物丰度的dox依赖性变化(图S4B)或者在扩散速度上(图S4C)A549或H1299细胞。重要的是，表达dox诱导GFP的细胞在代谢物池大小或增殖率方面也没有变化(图S4B–C)这表明，在该浓度下添加多西环素不会显著影响该系统的代谢。此外，我们观察到NAD的池大小没有显著差异+、NADH、NADP+或在添加强力霉素24小时后H1299 mtIDH1-C和mtIDH2-M细胞中的NADPH，表明强力霉素依赖性生成2HG并没有改变这些辅助因子用于其他氧化还原反应的可用性(图S4D). 报告的k支持这一点猫突变IDH1酶相对于野生型IDH1较小(Dang等人，2009年)并表明这些酶对细胞氧化还原状态的任何直接影响都是最小的。

室特异性辅因子追踪的验证

为了验证该系统追踪特定NADPH代谢的能力，我们在有[3-2H] 葡萄糖和测定的22HG池中的H。为了确保在诱导突变型IDH表达之前，细胞处于或接近同位素稳定状态，在添加强力霉素之前，用示踪剂培养细胞24小时。与[3]一致-2H] 通过氧化PPP产生葡萄糖的细胞溶质NADPH，2HG仅在[3-2H] mtIDH1-C细胞系中的葡萄糖而不是mtIDH2-M细胞系(图3E). 重要的是，在这些条件下，在αKG上几乎没有观察到标记，确保2HG上的标记是突变酶从NADPH中直接转移氢化物离子的结果。接下来我们询问标签是否来自[4-2H] 葡萄糖通过mtIDH1-C或mtIDH2-M结合到2HG中。值得注意的是，更多的2HG被标记自[4-2H] mtIDH2-M细胞中的葡萄糖比mtIDH1-C细胞中的葡萄糖多(图3F). 这些数据表明，从NADH到NADPH的H-转移是通过线粒体中间产物（例如苹果酸）或烟酰胺核苷酸转氢酶（NNT）发生的，而从NADH到NADPH的还原当量转移主要支持线粒体NADPH库。在具有内源性、杂合性IDH1和IDH2突变的细胞系中也观察到类似的结果(图S4E–F).

体外稳态酶动力学实验表明，反应的速率常数2与使用未标记底物进行的研究相比，H转移可能更低(Rendina等人，1984年). 这一现象对于阐明生化反应机制，包括我们系统中负责标记转移的许多反应，是一个非常有用的工具。然而，鉴于新陈代谢调控手段的多样性，以及理解哪些酶步骤对完整细胞中的通路具有速率限制所面临的挑战，同位素效应与细胞内代谢通量的相关性尚不明确。为了确定这种现象在我们的系统中的重要性，我们以不同的比率培养细胞[3-2H] H1299 mtIDH1-C细胞中葡萄糖和未标记葡萄糖以及脂肪生成NADPH和2HG下游标记的测定(图4A). 同样，我们滴定了[4-2H] 在H1299 mtIDH2-M细胞中用未标记底物标记葡萄糖，并观察标记转移到乳酸、苹果酸、天冬氨酸、富马酸、柠檬酸和2HG是否受到不同量标记底物的影响(图4B). 我们推断，如果反应速率受到2H同位素，使用未标记的底物将更受欢迎，当将未标记底物滴定到培养基中时，将观察到较少的标记相对转移。然而，在所有情况下，随着示踪剂被未标记的底物稀释，来自任一示踪剂的标记转移线性减少，这表明动力学同位素效应对这些实验的结果影响最小(图4A-B). 在内源性mtIDH1细胞（HT1080）中也观察到脂肪生成NADPH和2HG标记的线性减少，当我们滴定时，这些细胞表现出更高的2HG生成率[3-2H] 葡萄糖，进一步支持了同位素效应通过我们在完整细胞中追踪的反应对底物通量影响最小的概念(图4C).

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动力学同位素效应的影响最小[3-2H] 葡萄糖和[4-2H] 葡萄糖代谢

A）[3-2H] 用未标记的葡萄糖滴定葡萄糖，并将其添加到表达mtIDH1-C的H1299细胞中-2H] 葡萄糖转化为脂肪生成NADPH（左侧面板，标准化为100%[3-2H] 葡萄糖培养基富集）和2HG（右侧面板）被测量。虚线（左面板）表示[3]的1:1贡献-2H] 葡萄糖转化成脂肪生成NADPH以富集[3-2H] 培养基中的葡萄糖。B）[4-2H] 用未标记的葡萄糖滴定葡萄糖，并将其添加到表达mtIDH2-M的H1299细胞中-2H] 乳酸和苹果酸上的葡萄糖（左面板）；天冬氨酸、柠檬酸和富马酸（中间面板）；测量2HG（右侧面板）。C）[3-2H] 在携带内源性IDH1突变（R132C/+）的HT1080细胞中用未标记的葡萄糖滴定葡萄糖。[3]的贡献-2H] 葡萄糖转化为脂肪生成NADPH（左侧面板，标准化为100%[3-2H] 在用[3-2H] 用未标记的葡萄糖在0、25、50、75和100%浓度下稀释葡萄糖。所示数据显示为面板A（右面板）、B和C（右面板的）三个生物复制品的平均值±SD。数据表示面板A（左面板）和面板C（左面板的）至少三个生物复制的平均±95%置信区间

细胞质和线粒体中丝氨酸/甘氨酸代谢的特征

接下来，我们试图使用我们的报告系统来检查划分的代谢循环。构成叶酸介导的单碳代谢的反应存在于细胞质和线粒体中，尽管目前的文献尚不清楚这些反应是否在一个循环中相连和/或反应的方向(安德森等人，2011年;Nilsson等人，2014年;Tedeschi等人，2013年;Tibbetts和Appling，2010年). 在培养细胞中观察到丝氨酸和甘氨酸通过丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）相互转化(Jain等人，2012年;莱文托和鹰，1961年;Perry等人，2007年)但是13C追踪无法确定该过程的方向性、分区性和互连性。事实上，在与[U-13C类三]我们在A549 mtIDH1-C和mtIDH2-M细胞中观察到丝氨酸和甘氨酸的显著相互转化(图5A). MTHFD1（细胞溶质）和MTHFD2/MTHFD2L（线粒体）催化的反应利用NAD（P）H(图5B); 因此，我们假设2H丝氨酸和甘氨酸示踪结合我们的小室报告系统将使我们能够实验性地确定细胞质和线粒体中丝氨酸-甘氨酸交换反应的方向。丝氨酸碳-3上的氢转移到5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-methyleneTHF）然后通过MTHFD1/2发送给NADPH(图5B). 此外，甘氨酸裂解系统（GCS）存在于线粒体中，可以将氢从甘氨酸的碳二转移到5,10-亚甲基-THF并生成NADPH(图5B) (菊池等人，2008年).

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细胞质/线粒体中丝氨酸/甘氨酸代谢的特征

A）[U培养的A549 mtIDH1-C和mtIDH2-M细胞中的丝氨酸（左侧）和甘氨酸（右侧）标记-13C类三]丝氨酸。用[U培养细胞-13C类三]丝氨酸在dox诱导前24小时（0.1µg/mL）再持续48小时。中间面板显示丝氨酸和甘氨酸通过SHMT相互转化。绘制的数据表示三个生物重复的平均值±SD。B）通过SHMT和MTHFD催化的叶酸介导细胞溶质和线粒体隔室中的单碳代谢示意图。氘从[3,3转移-2H（H）2]丝氨酸用于含有SHMT和MTHFD的途径，并分别用细胞溶质和线粒体同工酶的红色或蓝色小圆圈表示。[2,3,3上的额外氘-2H（H）三]丝氨酸由橙色（胞质）或绿松石色（线粒体）圆圈表示。氘从[2,2转移-2H（H）2]甘氨酸显示为甘氨酸裂解系统（GCS）途径，由小绿圈表示。C）来自[3,3的2HG标签-2H（H）2]丝氨酸[2,3,3-2H（H）三]丝氨酸或[2,2-2H（H）2]A549 mtIDH1-C和mtIDH2-M细胞中的甘氨酸。在dox诱导（0.1µg/mL）之前，用任一示踪剂培养细胞24小时，再培养48小时。在来自[3,3的mtIDH1-C细胞的2HG上未检测到标签-2H（H）2]丝氨酸或[2,3,3-2H（H）三]丝氨酸，也没有在[2,2的2HG上检测到标签-2H（H）2]mtIDH1-C和mtIDH2-M细胞中的甘氨酸（用*表示）。D）用[3，3培养的A549 mtIDH1-C和mtIDH2-M细胞的脂肪酸标记-2H（H）2]丝氨酸[2,3,3-2H（H）三]丝氨酸或[2,2-2H（H）2]甘氨酸。在dox诱导（0.1µg/mL）之前，用示踪剂培养细胞24小时，再培养48小时。E）[3培养的A549 mtIDH1-C和mtIDH2-M细胞中的丝氨酸和甘氨酸标记-2H] 葡萄糖。在dox诱导（0.1µg/mL）之前，用示踪剂培养细胞24小时，持续48小时。数据表示面板C–E的至少三个生物复制品的平均值±SEM。

为了研究这些室特异性途径，我们用[3,3-2H（H）2]丝氨酸或[2,3,3-2H（H）三]丝氨酸和未标记甘氨酸或[2,2-2H（H）2]甘氨酸和未标记丝氨酸以及测定的2细胞溶质或线粒体2HG中的H。引人注目的是，我们检测到标签来自[3,3-2H（H）2]丝氨酸和[2,3,3-2H（H）三]2HG上的丝氨酸仅存在于mtIDH2-M细胞中，这强烈表明丝氨酸到甘氨酸的转换主要发生在这些细胞的线粒体中，MTHFD2/MTHFD2L反应是氧化性的(图5C和图S5A-C). 我们没有观察到[2,2的2HG标记-2H（H）2]表达突变型IDH的细胞中的甘氨酸(图5C)，表明大多数线粒体甘氨酸是由SHMT2生成的（而不是甘氨酸输入），或者标签在GCS中丢失。与缺少标签转移一致2在mtIDH1-C细胞中，H标记的丝氨酸或甘氨酸对2HG的作用，我们检测到这些示踪剂在脂肪生成的NADPH池中的作用很小(图5D). 为了进一步证实MTHFD1的方向，我们用[3-2H] 葡萄糖，其特异性标记胞浆NADPH。我们观察到2H来自[3-2H] 葡萄糖与丝氨酸结合表明细胞溶质MTHFD1可以在这些细胞中以还原方向运行(图5E). [3中缺少甘氨酸标记-2H] 葡萄糖证实标记转移到丝氨酸是从5,10-亚甲基四氢呋喃获得的(图5E,S5D系列). [2,3,3中没有标签-2H（H）三]丝氨酸或[3,3-2H（H）2]mtIDH1-C产生的脂肪酸或2HG上的丝氨酸也与MTHFD1对这些细胞中NADPH池的最小贡献相一致，尽管这些方法不能排除其他反应的通道。[3标记丝氨酸的穿梭-2H] 葡萄糖通过MTHFD1/SHMT1进入线粒体，通过MTHFD2/SHMT2分解代谢，这可能是我们在用[3-2H] 葡萄糖(图3E). 总之，这些数据提供了丝氨酸代谢有助于细胞中线粒体NADPH再生的直接证据。

讨论

我们开发了一个系统，可以区分NADPH的分区池，证明了完整细胞的细胞质和线粒体中丝氨酸/甘氨酸代谢的方向性和相互关联性。在所研究的细胞中，丝氨酸转化为甘氨酸主要发生在线粒体中，MTHFD2/MTHFD2L催化的反应有助于NADPH的生成。有趣的是，从[2,3,3-2H（H）三]丝氨酸和[3,3-2H（H）2]观察到丝氨酸到线粒体2HG，表明SHMT2的丝氨酸代谢是线粒体NADPH和甘氨酸库的贡献者。这些数据也为用于嘌呤合成的甲酸盐的细胞质来源可以在某些细胞中由线粒体衍生的假说提供了直接的实验支持。此前，人们试图确定叶酸介导的单碳代谢的方向性，但依靠表达数据，无法区分不同的分区(Nilsson等人，2014年)，数学建模(Scotti等人，2013年;Tedeschi等人，2013年)或分离线粒体制剂(巴洛和阿普林，1988年). 区分划分的氧化还原途径的重要性被大量潜在途径所强调，这些途径与细胞溶质和线粒体之间还原当量的穿梭有关(Tibbetts和Appling，2010年). 例如，通过柠檬酸盐/αKG的特定于细胞室的代谢循环(萨扎诺夫和杰克逊，1994年;Ward等人，2010年)，苹果酸/丙酮酸(Jiang等人，2013年;Son等人，2013年)，脯氨酸(Hagedorn和Phang，1983年;Nilsson等人，2014年)和丝氨酸被认为对哺乳动物细胞生理学很重要。尽管碳追踪越来越多地与遗传方法相结合，以暗示隔室特异性同工酶在这些过程中的作用，但对打破这些循环的遗传耗竭策略的适应可能会混淆解释。本文描述的报告系统通过提供完整细胞中的区室化反应活性和方向的直接可视化，规避了涉及NAPDH的反应的这些问题。

其他亚细胞隔室在真核细胞中也有不同的代谢需求，可以通过设计突变IDH酶的定位和/或监测来用类似的方法进行探测2其他代谢物之间的H转移。内质网（ER）是蛋白质折叠、二硫键形成、长链脂肪酸延伸和甾醇还原的重要部位；因此，NADP+/内质网内的NADPH比率可以影响多种细胞和生理过程(Banhegyi等人，2009年;Kardon等人，2008年;Szaraz等人，2010年). 该方法也可用于量化NADP+/特定细胞器中的NADPH比率和特定隔室中NADPH的周转率。改变突变IDH酶的辅因子选择性，或依赖NADH依赖的另一种异种代谢物的产生，同样可以用于可视化利用NADH的分区反应。最后，这些数据可以与划分的数据进行集成13C代谢通量分析（MFA）模型，以更好地了解辅因子代谢在代谢工程应用或疾病模型中的作用(Ruhl等人，2012年). 因此，这种方法开辟了观察复杂细胞代谢过程的新途径，并提高了我们对正常和疾病状态下代谢的理解。

实验程序

细胞培养和同位素标记

所有细胞系均保存在补充有10%FBS、100 U/mL青霉素/链霉素和4 mM L-谷氨酰胺的DMEM中。pSLIK-mtIDH细胞系（见下文）如上所述保持不变，但FBS被替换为无Tet-free FBS（Clontech）。使用自动细胞计数器（Nexcelom）或血细胞仪测定细胞数量。对于pSLIK-mtIDH细胞系的同位素标记实验，细胞在无葡萄糖和谷氨酰胺的DMEM中的6孔培养板中培养，补充10%透析的无Tet-free FBS、100 U/mL青霉素/链霉素、4 mM L-谷氨酰胺和10 mM或15 mM合适的氘化葡萄糖示踪剂（[3-2H、 95%或98%]葡萄糖或[4-2H、 94%或98%]葡萄糖）分别孵育24小时或48–72小时（Omicron和Cambridge Isotope Laboratories，Inc.）。在胆固醇标记实验中，亲本H1299细胞在补充有1%FBS的DMEM中培养两代，然后用[3-2H] 葡萄糖。在添加盐酸多西环素（0.1µg/mL水溶液：Sigma）之前，细胞在示踪培养基中培养24小时，以诱导突变IDH表达并积累2HG。同位素标记甘氨酸和丝氨酸示踪剂培养基由定制的无酚红、葡萄糖、丙酮酸钠、氨基酸和碳酸氢钠的DMEM（Hyclone Laboratories，Inc.）补充10%透析的无Tet-free FBS、3.7 g/L碳酸氢盐和DMEM水平的L-精氨酸、L-胱氨酸、L-glutanine、L-组氨酸、L-异亮氨酸、，L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，在水酸（pH 2.0）中制备成100倍储备。A549 pSLIK mtIDH1-C和mtIDH2-M细胞在补充有[2,3,3-2H（H）三98%]丝氨酸或[3,3-2H（H）298%]丝氨酸和未标记甘氨酸（0.4 mM）（剑桥同位素实验室公司），或[2,2-2H（H）2，98%]甘氨酸和未标记丝氨酸（0.4 mM）（剑桥同位素实验室有限公司）。在添加强力霉素（0.1µg/mL）之前，细胞在示踪培养基中培养24小时，再培养48小时。

稳定表达诱导型标记突变型IDH的细胞系的建立

为了产生多西环素诱导的突变型IDH（mtIDH）细胞系，通过PCR扩增IDH1-R132H和IDH2-R172K的全长cDNA，并克隆到p3xFLAG-CMV14载体（Sigma）中，以生成C末端标记结构。然后通过PCR扩增IDH1-R132H–FLAG和IDH2-R172K–FLAG的cDNA，并克隆到pEN_TTmcs进入载体中，以重组到pSLIK-hygro慢病毒载体（这两个载体均来自Addgene(Shin等人，2006年)). 慢病毒是通过用pSLIK-hydo-IDH1-R132H或pSLIK-hydo-IDH2-R172K质粒以及慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE和pRSV-Rev以及包膜质粒pMD2.G（均来自Addgene）转染HEK-293T细胞而产生的。转染48小时后收集含有慢病毒颗粒的上清液，用于感染亚融合的H1299和A549细胞。受感染的细胞在用350µg/mL潮霉素（Invitrogen）进行筛选10天后恢复24小时。使用0.1µg/mL盐酸多西环素（Sigma）诱导蛋白质表达24–48小时。

蛋白质表达分析和细胞分离

对于全细胞提取物，细胞在RIPA缓冲液中溶解。如前所述制备线粒体和细胞质部分(Vander Heiden等人，1997年). 简单地说，在缓冲液A中收集细胞（250 mM蔗糖、20 mM HEPES、10 mM KCl、1.5 mM MgCl21 mM EDTA、1 mM EGTA、1 m M DTT、1×EDTA无蛋白酶抑制剂鸡尾酒片（罗氏）[pH7.4]），并使用机械均质机（加利福尼亚州红木市H&Y Enterprise）进行破碎。在750 xg离心以去除未溶解的细胞和细胞核后，通过10000 xg离心25分钟分离线粒体。所得颗粒在缓冲液A中再次悬浮，代表线粒体部分。将剩余的含有细胞质和膜蛋白的上清液以100000xg离心1小时。最后旋转的上清液代表S100分数。使用针对FLAG（DYKDDDDK Tag：细胞信号转导）、IDH1（Santa Cruz）、IDH2（Abcam）、细胞色素C（克隆号7H8.2C12，Abcam。

代谢物提取和GC-MS分析

如前所述，使用甲醇/水/氯仿提取极性代谢物和脂肪酸(Metallo等人，2012年). 将亲代和pSLIK-mtIDH细胞培养在6孔或12孔培养板中，并相应调整示踪培养基和提取缓冲液的体积。前面已经描述了极性代谢物和脂肪酸的衍生物(Metallo等人，2012年). 简言之，通过在吡啶（或MOX试剂（Thermo Scientific）中与2%甲氧基胺盐酸盐（MP Biomedicals）孵育，然后添加N-叔丁基二甲基硅基-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）和1%叔丁基二甲基氯硅烷（t-BDMCS），衍生极性代谢物以形成甲氧基二氟乙酰胺衍生物（Regis Technologies）。非极性组分，包括三酰基甘油酯和磷脂皂化为游离脂肪酸，并通过与2%H孵育酯化形成脂肪酸甲酯2SO公司4甲醇或使用甲基-8试剂（Thermo Scientific）。使用DB-35MS柱（30m×0.25mm i.d.×0.25µm，安捷伦J&W Scientific）对衍生样品进行GC-MS分析，该柱安装在与安捷伦5975C质谱仪（MS）接口的安捷伦7890A气相色谱仪（GC）中。通过整合代谢物离子片段确定质量同位素分布(表S1)并使用根据Fernandez等人(Fernandez等人，1996年).

NAD+、NADH、NADP+和NADPH的提取及LC-MS/MS分析

NADPH的提取方案基于Fendt等人之前描述的一个方案(Fendt等人，2013年)简单地说，细胞在6孔板中培养30分钟，在冰冷水中清洗一次，然后立即在液氮中淬火。将200µL冰冷提取缓冲液（40:40:20乙腈/甲醇/200 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，pH 9.2）直接添加到细胞中。在冰上刮取细胞，并在4°C下离心清除。将50µL上清液转移到聚丙烯小瓶中，并使用Q Exactive Benchtop LC-MS/MS（Thermo Fisher Scientific）分析样品。

为了在24小时时测量NAD（P）H，将细胞培养在10 cm的平板中。用示踪剂孵育24小时后，约1×107将细胞在冰冷的0.9%盐水中洗涤，并立即在−80°C的1mL 80%甲醇中骤冷。在干冰上刮取细胞，并在4°C下离心清除。将清除的上清液转移到Eppendorf管中，使用CentriVap（Labconco）在真空下干燥，在水中重新悬浮，并立即使用UFLC XR HPLC（马里兰州哥伦比亚岛岛津）和AB SCIEX Qtrap®5500质谱仪（马萨诸塞州弗拉明翰市AB SCEEX）将其装载到XSELECT HSS XP 150 mm×2.1 mm×2.5µm（Waters®，Milford，MA）上在负离子模式下运行。使用Fernandez等人改编的内部软件，对质量同位素分布进行了自然丰度校正(Fernandez等人，1996年). 有关色谱分离、质谱和数据采集的其他信息，请参阅补充实验程序.

同位素光谱分析（ISA）

ISA方法将测量的棕榈酸酯质量同位素分布与使用棕榈酸酯合成反应网络模拟的分布进行了比较，即消耗14个NADPH分子形成一个棕榈酸酯分子。还生成了肉豆蔻酸和硬脂酸盐合成模型，其中12或16个NADPH分子被消耗以分别形成一个肉豆蔻酸或硬脂酸分子。脂肪生成NADPH池相对富集的参数[2H] 示踪剂和脂肪酸的百分比从头开始合成物是使用INCA代谢通量分析软件包从最佳拟合模型中提取的(图S2) (杨，2014). 通过评估测量和模拟棕榈酸酯质量同位素分布之间的残差平方和对小通量变化的敏感性，估算了这两个参数的95%置信区间(Antoniewicz等人，2006年).

细胞增殖试验

第-1天，将1/10汇合的10cm培养皿中的细胞接种在六孔板的六个六孔中。24小时后，细胞在自动细胞计数器（Nexcelom）上计数，该时间点被视为T0T时0，所有其他时间点的培养基更改为−/+dox培养基（水中0.1µg/mL盐酸多西环素（Sigma））。每24小时对技术副本和生物副本中的细胞进行计数。每48小时更换一次培养基，以防止培养基中多西环素降解。

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集锦

  • 的使用2追踪细胞NAD（P）H代谢的H稳定同位素
  • 戊糖磷酸途径对胞浆NADPH贡献的定量
  • 区分细胞溶质和线粒体NADPH的报告系统
  • 解析其他相同的分区氧化还原反应的方向

补充材料

01

单击此处查看。（320万，pdf）

致谢

我们感谢Michael Pacold、Elizaveta Freinkman、David Sabatini和Bernhard Palsson提供设备访问权限。我们感谢Patrick Ward和Craig B.Thompson提供IDH1-R132H和IDH2-R172K的cDNA。Eric L.Bell和Sarah-Maria Fendt提供了建议和试剂。这项工作得到了NIH拨款P30CA147882、U54-CA121852-09和R01CA168653的部分支持，以及科赫研究所/DFHCC桥梁项目、科赫研究院前沿研究基金、Burroughs Wellcome基金、Damon Runyon癌症研究基金会、美国癌症学会拨款IRG#70-002、DOD拨款W81XWH-13-1-0105、，加州大学癌症研究协调委员会拨款和塞尔学者奖。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

作者贡献

C.A.L.和S.J.P.进行了稳定同位素示踪实验，并制备了用于GC-MS和LC-MS分析的样品。N.I.V.和C.R.G.进行了稳定同位素示踪实验，并通过GC-MS分析了样品。C.R.G协助进行了丝氨酸和甘氨酸示踪实验以进行GC-MS的分析。C.A.L.和S.J.P.在GC-MS上运行和分析样品。B.P.F、D.Y.G.、D.M.和A.M.F.开发了方法，并在LC-MS上进行了样品运行。C.A.L和S.J.P分析了在B.P.F.和D.M.S.J.P协助下通过LC-MS获得的数据，建立了同位素光谱分析方法，并进行了脂质建模。C.A.L.产生诱导突变型IDH表达系统。C.M.M.、M.G.V.H.、C.A.L.和S.J.P.设计了实验。C.A.L.、S.J.P、C.M.M.和M.G.V.H.设计了这项研究，分析了所有数据，并撰写了手稿。

作者声明没有利益冲突。

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