美国国家科学院院刊。2004年5月11日；101(19): 7421–7426.
来自封面
hepoxilin A的鉴定三在炎症事件中：中性粒细胞在肠上皮细胞迁移中的必要作用
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Randall J.Mrsny女士
*加的夫大学药学院，英国威尔士加的夫爱德华七世国王大道红木大厦，CF10 3XF；†佐治亚州亚特兰大埃默里大学病理学系，邮编30322；‡马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院粘膜免疫实验室，MA 02129；§芝加哥大学病理学系，伊利诺伊州芝加哥市MC1000南马里兰州大道5841号，邮编60637-1470；和¶哈佛医学院微生物与分子遗传学系，马萨诸塞州波士顿02115
Andrew T.Gewirtz安德鲁·T·格威茨
*加的夫大学药学院，英国威尔士加的夫爱德华七世国王大道红木大厦，CF10 3XF；†佐治亚州亚特兰大埃默里大学病理学系，邮编30322；‡马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院粘膜免疫实验室，MA 02129；§芝加哥大学病理学系，伊利诺伊州芝加哥市MC1000南马里兰州大道5841号，邮编60637-1470；和¶哈佛医学院微生物与分子遗传学系，马萨诸塞州波士顿02115
达里奥·西卡迪
*加的夫大学药学院，英国威尔士加的夫爱德华七世国王大道红木大厦，CF10 3XF；†佐治亚州亚特兰大埃默里大学病理学系，邮编30322；‡马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院粘膜免疫实验室，MA 02129；§芝加哥大学病理学系，伊利诺伊州芝加哥市MC1000南马里兰州大道5841号，邮编60637-1470；和¶哈佛医学院微生物与分子遗传学系，马萨诸塞州波士顿02115
托尔·萨维奇
*加的夫大学药学院，红木大厦，爱德华七世国王大道，加的夫，威尔士CF10 3XF，英国；†佐治亚州亚特兰大埃默里大学病理学系，邮编30322；‡马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院粘膜免疫实验室，MA 02129；§芝加哥大学病理学系，伊利诺伊州芝加哥市MC1000南马里兰州大道5841号，邮编60637-1470；和¶哈佛医学院微生物和分子遗传学系，马萨诸塞州波士顿02115
布莱恩·P·赫尔利
*加的夫大学药学院，英国威尔士加的夫爱德华七世国王大道红木大厦，CF10 3XF；†佐治亚州亚特兰大埃默里大学病理学系，邮编30322；‡马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院粘膜免疫实验室，MA 02129；§芝加哥大学病理学系，伊利诺伊州芝加哥市MC1000南马里兰州大道5841号，邮编60637-1470；和¶哈佛医学院微生物与分子遗传学系，马萨诸塞州波士顿02115
詹姆斯·马达拉
*加的夫大学药学院，英国威尔士加的夫爱德华七世国王大道红木大厦，CF10 3XF；†佐治亚州亚特兰大埃默里大学病理学系，邮编30322；‡马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院粘膜免疫实验室，MA 02129；§芝加哥大学病理学系，伊利诺伊州芝加哥市MC1000南马里兰州大道5841号，邮编60637-1470；和¶哈佛医学院微生物与分子遗传学系，马萨诸塞州波士顿02115
贝丝·A·麦考密克
*加的夫大学药学院，英国威尔士加的夫爱德华七世国王大道红木大厦，CF10 3XF；†佐治亚州亚特兰大埃默里大学病理学系，邮编30322；‡马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院粘膜免疫实验室，MA 02129；§芝加哥大学病理学系，伊利诺伊州芝加哥市MC1000南马里兰州大道5841号，邮编60637-1470；和¶哈佛医学院微生物与分子遗传学系，马萨诸塞州波士顿02115
*加的夫大学药学院，英国威尔士加的夫爱德华七世国王大道红木大厦，CF10 3XF；†佐治亚州亚特兰大埃默里大学病理学系，邮编30322；‡马萨诸塞州查尔斯顿市马萨诸塞总医院粘膜免疫实验室，MA 02129；§芝加哥大学病理学系，伊利诺伊州芝加哥市MC1000南马里兰州大道5841号，邮编60637-1470；和¶哈佛医学院微生物与分子遗传学系，马萨诸塞州波士顿02115
由马萨诸塞州波士顿哈佛医学院John J.Mekalanos编辑，于2004年3月31日批准
摘要
中性粒细胞[多形核白细胞（PMNs）]被刺激穿越粘膜表面上皮屏障的机制在生物学上基本上尚不清楚。IL-8已被证明能刺激中性粒细胞离开局部粘膜炎症部位的血流，但中性粒细胞用于在相邻上皮细胞之间移动并穿过这些粘膜屏障顶端颈部紧密连接处的化学梯度尚未被识别。我们的研究不仅确定了该因子（以前称为致病性上皮化学引诱剂）为二十烷酸七叶皂苷A（eicosanoid hepoxilin A）三（庚烷A三)但也证明它是促进PMN募集到粘膜炎症部位的最后一步的关键因素。我们展示了hepA三由上皮细胞合成，并在刺激炎症事件的条件下从其顶端表面分泌。我们的数据进一步证实了hepA三通过在上皮紧密连接复合体上建立梯度来吸引PMN。hepA的功能意义三发现12-脂氧合酶途径（hepA所必需的）被破坏，证明PMN靶向炎症部位的肠腔三生产）可以显著减少PMN介导的组织损伤，表明hepA三是粘膜炎症的关键调节器。
细菌病原体不断地面对身体的上皮屏障，如胃肠道、呼吸道和生殖道的上皮屏障。多形核白细胞（PMNs）是一类对保护宿主免受此类病原体侵害至关重要的白细胞。先前的研究已经确定了IL-8等因子，IL-8是由上皮屏障基底外侧表面分泌的，这些因子建立了化学梯度，对PMN的激活和从血液中募集至关重要(1). 经过IL-8梯度后，PMN被吸引到上皮细胞的侧面。然而，迁移到细菌感染的实际部位，即肠腔内，需要一个额外的化学梯度的作用，该梯度跨越上皮顶部颈部的最后屏障，即紧密连接（TJ）复合体。任何能够在这种屏障上建立梯度的分子都具有独特的性质：从顶端而非基底外侧上皮细胞表面选择性分泌，渗透TJ以建立化学梯度的能力，以及防止PMN过度迁移的不稳定性质。这种因子的鉴定一直是上皮病理生物学中一个尚未解决的重要问题。
沙门氏菌病是世界范围内腹泻的常见病因，是上皮病理生物学的一个例子，在该病中，可观察到大量PMN迁移到内腔，在本例中，PMN迁移至小肠隐窝，以应对由鼠伤寒沙门菌PMN对上皮的作用，最终导致肠隐窝脓肿的形成和随后屏障功能的丧失，强调了不仅介导鼠伤寒沙门氏菌-诱导性肠炎(2,三)也包括与炎症性肠病相关的特发性疾病(4). 为了模拟肠粘膜发生的炎症事件，我们使用了体外的模型鼠伤寒沙门氏菌感染人类肠上皮细胞T84，以单层形式生长，以检测是否存在致病性上皮趋化因子（PEEC）并获得其初步特征。PEEC是一种小分子(M（M）第页<1500）刺激百日咳毒素敏感G蛋白偶联钙2+动员；然而，与其他已知的PMN化学引诱剂相比，即使在饱和浓度和存在诸如细胞松弛素等“引物”的情况下，它也不会诱导脱颗粒或氧化爆发(5)从而将PEEC与所有其他已知影响PMN趋化性的因素区分开来。使用T84-鼠伤寒沙门氏菌感染模型(6)，我们现在已经纯化并鉴定了一种从T84细胞单层顶端表面分泌的分子，该分子受到致病性但非致病性的鼠伤寒沙门氏菌并证明了这个分子，hepoxilin A三（庚烷A三)，重述PEEC之前确定的特征体外和体内.
实验程序
PEEC的纯化和鉴定。从感染了鼠伤寒沙门氏菌如前所述，SL1344或VV341(6). 样品首先通过装有2000-Da截止膜的Amicon超滤装置（Millipore）。滤出物组分结合到Bakerbond spe十八烷基萃取柱（J.T.Baker）上，然后用水、己烷和最终甲醇洗脱。在真空下干燥甲醇部分，并将其重新悬浮在50:50（vol/vol）甲醇/2 mM Tris·HCl（pH 7.5）中，并注入Vydac（Hesperia，CA）C18（10μm；300Ω）半制备柱（10×250 cm）中，该柱与2 mM Tris-HCl（pH7.5）平衡。在10分钟内使用1-10%的甲醇梯度，然后在25分钟内使用10-60%的甲醇梯度，然后在45分钟内使用60-100%的甲醇梯度（均在室温下）来分离活性PEEC级分。使用Genesis C18（4μm，120μm）分析HPLC柱（4.6×150 mm），用5 mm三乙胺/乙酸（pH 7.2）平衡，分析在280 nm处无可检测吸光度和在214 nm处弱吸光度的活性组分。PEEC样品在60分钟内使用0-100%的线性甲醇梯度进行色谱分析，并使用负离子模式下的Finnigan LCQDeca HPLC/电喷雾质谱仪进行分析。对化合物的保留时间、UV光谱（UV6000LP光电二极管阵列检测器）和米/z（z）信号（Thermo Separation Products，加利福尼亚州圣何塞）。
细胞培养。基线电阻为650至1500 ohm·cm的T84单层膜2已使用(6). 获得PMN(7)来自不同的捐赠者，通过使用来自单个捐赠者的PMN在个别日期进行个别实验。在这些研究过程中，PMN的分离仅限于10个不同的捐赠者（重复捐赠）。PMN迁移结果表示为PMN细胞当量，根据每日标准PMN稀释曲线得出，该曲线完全穿过单层。
PMN迁移分析。描述了使用倒置T84单层细胞培养插入物进行的生理导向（基底侧至顶端）PMN跨上皮迁移分析(6). 如前所述，从正常志愿者中分离出人类PMN(2,7).
钙2+进场和脱粒。PMN细胞内[Ca2+]如前所述，在INDO-1负载的PMN中使用比率测量法通过荧光分光光度法进行测量(5). PMN脱颗粒是通过弹性蛋白酶和超氧化物歧化酶的释放来测量的，如前所述(8).
12-脂氧合酶（LO）和5-LO抑制剂治疗。对于12-LO抑制，HBSS（+）清洗的T84细胞单层在黄芩素（DMSO中1mM的储备浓度）存在下37°C孵育48小时。随后，鼠伤寒沙门氏菌将SL1344添加到T84单层的顶部表面，并在37°C下培养1 h后，将细胞清洗掉非粘附细菌，然后进行PMN迁移分析。对于5-LO抑制，用HBSS（+）清洗T84细胞，然后在咖啡酸存在下培养24小时（DMSO中22 mM的储备浓度）。这两种抑制剂均购自Biomol（宾夕法尼亚州普利茅斯会议）。
人类肠道异种移植物。详细描述了本研究中使用的人类胎儿小肠异种移植模型(9). 简言之，人类胎儿小肠(n个=3，孕龄10-14周），将皮下移植到c.B-17严重联合免疫缺陷小鼠体内，并在使用前10至20周内允许其发育。异种移植物感染≈5×107野生型鼠伤寒沙门氏菌SL1344在无菌HBSS（+）缓冲液中，100μl容量，腔内皮下注射。接受药物治疗的异种移植物在感染鼠伤寒沙门氏菌（在持续存在1μM黄芩素的情况下）。与之前的分析一致，异种移植物组织在感染后15小时被移除，广泛清洗，并在OCT复合物中快速冷冻。由训练有素的胃肠道病理学家以盲法评估肠道炎症的组织学严重程度，并根据（1）上皮细胞损伤，（2）充血和水肿，以及（3）PMN浸润进行排名（0-3）(10).
结果
PEEC的识别。在感染野生型后，从极化T84细胞单层的顶端表面收集PEEC的粗制品鼠伤寒沙门氏菌SL1344型(5); 活性增强制剂增加PMN细胞溶质[Ca2+]并诱导PMN在原始T84细胞单层间迁移(5). 与温育后获得的条件顶端培养基鼠伤寒沙门氏菌菌株VV341是SL1344的一种非致病性等基因衍生物，通过删除hilA基因该基因不能诱导PMN跨上皮迁移，被用作阴性对照，而类似的制剂不能显示这些活性。使用半制备型HPLC方法确定PEEC活性的单峰(). HPLC分析表明，收集的馏分含有一种主要成分(). 在负离子模式下运行的HPLC/电喷雾MS[液相色谱/MS（LC/MS）]确定了335个突出质量和693个不太突出的质量(). 串联质谱分析表明，693质量与Na一致+较低单体质量的盐二聚体。对具有这些质量特征的已知分子的扫描突出了花生四烯酸代谢物的二十烷酸类。已发现PEEC活性不耐酸（数据未显示），该特征用于进一步确定其特性。从商业来源获得了几种具有PEEC活性的花生四烯酸代谢物，并分析了其在酸性条件下的分解曲线。一个分子，hepA三在这些条件下，在用于识别PEEC的LC/MS系统中形成具有特定保留时间的离散质量时，与PEEC表现相同(). 在PEEC和真实花生四烯酸代谢物甲基化后进行了类似的比较研究，只有hepA三发现与PEEC具有相似的特征（数据未显示）。
PEEC的标识。(A类)从暴露于鼠伤寒沙门氏菌SL1433（实线追踪）或VV341（较轻的虚线追踪）。(B类)使用收集的PEEC馏分的中性甲醇进行HPLC分析，显示一个突出的峰，保留时间为18.5分钟(C类)负离子模式质量分布为18.5分钟峰值，突出峰值在335处，次要峰值在693处。(D类)PEEC材料在酸中培养过夜后的HPLC分析曲线和负离子电喷雾MS分析。(下部) (顶部)质量118，保留时间10.3分钟(中部)质量为239，保留时间为17.6分钟(底部)质量325，保留时间19.1分钟。
检查与LO活性有关的代谢途径。证实hepA三作为PEEC，我们检查了合成hepA是否三（钙生物化学）可以重现PEEC的生物活性。强加的hepA三跨T84细胞单层的梯度诱导PMN迁移，并诱导PMN[Ca增加2+] ()以剂量依赖的方式（未显示数据）。与PEEC类似，但与IL-8和甲酰甲氧基-甲氧基-苯丙氨酸等化学引诱剂相反，hepA三根据弹性蛋白酶释放评估，未诱导PMN脱颗粒（数据未显示）。与hepA类似的多种生物活性脂质三分析了它们诱导PMN迁移和细胞内[Ca2+]PMN增加(). 花生四烯酸，脂质代谢的前体，产生hepA三也刺激了一些PMN的迁移，并诱导了细胞内PMN[Ca2+]增加。含羟基的花生四烯酸代谢物(对)-羟基二十烷-5Z，7E，14Z-四烯酸[12(对)-HETE]}或5和12个碳[5的羟基(S公司),12(对)-二羟基二十碳五烯酸-5Z、8Z、10E、14Z-四烯酸（DiHETE）；也称为6-反白三烯（LT）B4（长期借款4)]还产生了可测量的PMN趋化活性水平(). 长期借款4刺激PMN显著迁移和细胞内[Ca2+]我们系统中PMN的增加()，但这些作用与PEEC不同，因为该化合物也能诱导PMN脱颗粒，这与其之前在炎症事件中显示的功能一致(11). hepA中碳11和碳12的环氧化物结构耦合三也存在于hepoxilin B中三但位于不同的手性方向，并且发现该类似物是无活性的(). 高效液相色谱法三也包含8-OH基团，但该部分不足以重建PEEC活性[例如，8(S公司)-HETE]。酮症酸钠-6E、8Z、11Z、14Z四烯酸先前已被证明可刺激嗜酸性粒细胞迁移(12)并动员细胞内PMN[Ca2+] (13)但该化合物仅诱导了低水平的PMN迁移，并没有刺激细胞内PMN[Ca的动员2+] (). 因此，hepA三其前体DiHETE是唯一能诱导PMN迁移和Ca的物质2+无脱颗粒事件时的动员。
表1。
生物活性油脂的PEEC特性评价
| 测试的化合物* | PMN迁移† | [加利福尼亚州2+]增加‡ |
|---|
| 12-LO代谢产物 | | |
| 12（右）-HETE | 16 ± 2 | + |
| 12（S）-黑特 | 12 ± 5 | − |
| 5（S），12（R）-迪赫特 | 55 ± 6 | + |
| 高效液相色谱法三 | 99 ± 4 | + |
| 肝素B三 | 7.1 ± 1 | − |
| 5-LO代谢物 | | |
| 5（S）、6（R）-迪赫特 | 15 ± 1 | − |
| （±）5,6-EET | 11 ± 1 | − |
| 长期协议4 | 16 ± 0.2 | − |
| 长期借款4 | 65 ± 1 | + |
| 长期资本4 | 5.3 ± 1 | − |
| 有限公司4 | 6.2 ± 1 | − |
| 5-KETE公司 | 19 ± 2 | − |
| 15-LO代谢物 | | |
| 15（S）-黑特 | 12 ± 1 | − |
| 15（S）-HETrE | 3.4 ± 0.4 | − |
| 8-LO代谢物 | | |
| 8（S）-黑特 | 15 ± 1 | − |
| 多不饱和脂肪酸 | | |
| 花生四烯酸 | 38 ± 4 | + |
| 亚油酸 | 3.1 ± 0.3 | − |
| 13（S）-h节点 | 5.3 ± 0.7 | − |
| 鞘磷脂 | | |
| C2神经酰胺 | 10 ± 1 | − |
| C6神经酰胺 | 6.8 ± 0.8 | − |
| C16神经酰胺 | 13 ± 0.9 | − |
| C2二氢神经酰胺 | 7.1 ± 0.6 | − |
| C6二氢神经酰胺 | 6.2 ± 0.7 | − |
PEEC/HepA呼气末正压通气三建立渐变体外和在体内.使用LC/MS，我们量化了完整hepA的水平三在病原体刺激后从极化上皮细胞单层的顶端和基底外侧表面收集的上清液中，观察到两个重要的发现：第一，建立了顶端到基底外侧的梯度（210 pmol hepA三在90分钟孵育后，心尖室vs.基底外侧室为130 pmol）；其次，这个分子极不稳定。在两个单独的实验中，hepA平均损失50%三T84单层细胞在82分钟（77和87分钟）和43分钟（49和37.5分钟）出现在基底外侧室。高效液相色谱法三两个隔间的衰减都是指数级的t吨1/2通过分析每个数据集的对数线性分析的最佳拟合线的斜率来确定值(). 高效液相色谱法三水平也与在体外迁移模型。化学和酶活性（环氧化物水解酶）都可以迅速作用，使酶12-LO生成的环氧化物水合，从而生成完全不活泼的分子三羟基乙酸(14). 这种快速破坏可能是正常PEEC功能的一个关键方面，因为长寿命分子不仅可能随着时间改变TJ的梯度，还可能导致急性刺激引起的持久炎症事件，可能导致炎症相关病理。因此，hepA的不稳定性质三（PEEC）是平息PMN相关炎症的一个重要特征，因此，我们的许多实验都使用了hepA三浓度远高于可能需要的浓度体内在那里，它可以以一种规定的方式持续合成和分泌。
HepA3以梯度方式发挥作用。(A类)hepA比率三基底外侧表面退化（如对数线性图所示）。衰退是指数级的。t吨1/2通过对每个数据集的最佳拟合分析确定值。复杂的降解事件妨碍了准确传输速率的计算。(B类)高效液相色谱法三在T84单层基底外侧室加入4500 pmol后恢复。数据点表示两项独立研究的平均值，并表示hepA的量三基底外侧表面恢复较低。(C类)5μg/ml基底侧添加hepA的效果三PMN迁移上的（散列条）通常由野生型感染引起（黑色条）鼠伤寒沙门氏菌，顶部添加5μg/ml hepA三或100 mM甲酰-甲亚砜基亮氨酸-苯丙氨酸（fMLP）。数据（表示为平均值±SD）表示至少两个重复至少三次的实验中的一个。统计分析（学生t吨测试）的原始数据显示差异，*,P（P）<0.025和**,P（P）<0.010，与各自的控制相比。
接下来我们检查了合成hepA的能力三在顶部应用后，在完整的TJ屏障上建立化学梯度。尽管hepA的不稳定性三排除了计算准确hepA的尝试三穿过TJ的运输速度，完整的hepA三在顶部应用4500 pmol后，可以在基底外侧室显示(). 高效液相色谱法三添加到T84细胞单层的基底外侧表面，以消除趋化梯度的建立，显著减少由以下两种因素引起的PMN迁移鼠伤寒沙门氏菌或hepA三添加到这些单层的顶部表面(). 更快的hepA三基底外侧室的降解（与顶端室相比）体外T84感染模型的应用鼠伤寒沙门氏菌可能解释了否定hepA的不完整结果三这些研究中的梯度(). 总的来说，我们的结果表明hepA三可以在上皮TJ上建立梯度，这是一种预期的化学引诱剂需求，其作用是将PMN从这些细胞的侧膜吸引到粘膜组织的腔中。此外，hepA的破坏三梯度麻痹PMN的迁移。
hepA对PMN迁移的刺激作用三似乎通过Ca发生2+细胞内受体激活诱导的信号传导(15)导致钙的重组2+PMN内从内质网进入线粒体(16). 高效液相色谱法三与人类中性粒细胞中一个未知受体结合显示出明显的特异性(17)与我们的研究结果类似()进一步支持hepA的全面鉴定三作为PMN跨上皮TJ迁移的刺激物，不会过早脱颗粒(5)以前称为PEEC。
我们的假设是，PMN渗出和进入上皮间点主要由上皮细胞基底外侧表面分泌的细胞因子（如IL-8）介导，而PEEC（hepA三)上皮细胞顶面分泌的PMN会在TJ上形成浓度梯度，将PMN吸入粘膜腔。检查此概念体内，我们使用了人类异种肠道移植模型(9)其中管腔内应用3μg（在100μl缓冲液中）纯化的细菌鞭毛蛋白，以刺激基底侧IL-8的释放，诱导尿毒症(1,18). 添加后30分钟开始（或动物对照组中的缓冲液），hepA三（在200μl缓冲液中加入5μg）或载体缓冲液，使用皮下注射的Alzet泵在24小时内给药，该泵通过导管以8μl/小时的速率输送到肠腔内（持续输送肝素三由于其不稳定的性质，是必需的）。这种方法为PMN渗出/上皮间隔离（鞭毛蛋白）提供了单独的刺激，并刺激了PMN在TJ的运动（hepA三). 通过肠组织中PMN衍生髓过氧化物酶含量量化PMN进入肠腔的运动，表明异种移植物同时暴露于鞭毛蛋白和hepA三髓过氧化物酶活性（58±9单位/100毫克蛋白质）高于鞭毛蛋白单独处理（38±6单位/100毫升蛋白质）。用hepA治疗三与只接受缓冲液的动物（每100mg蛋白质10±8单位）相比，在缺乏鞭毛蛋白的情况下（20±11单位/100mg蛋白质）对这些水平没有显著影响。这些结果与我们的假设一致，即不同的促炎化学引诱剂依次调节PMN从血液到肠腔的运动，而hepA三是在粘膜炎症过程的最后一步发挥作用的因子。
解放PEEC/HepA三需要12-LO活动。有几种LO酶可以从花生四烯酸或其代谢物的5、8、12或15个碳的羟基残基中选择性地放置环氧结构。只有花生四烯酸代谢物在5或12碳修饰后才能刺激PMN迁移或[Ca]2+]动员(). 如果真的是hepA三作为PEEC的功能，12-LO而非5-LO活性的破坏应破坏其生物活性。T84细胞单层与咖啡酸的孵育，咖啡酸是5-LO的抑制剂（LTB所需的酶4合成），未能影响由鼠伤寒沙门氏菌感染(). 相比之下，添加12-LO抑制剂黄芩素以剂量依赖的方式抑制PMN的迁移(). 此外，我们检测了1μM黄芩素对心尖hepA范围的作用三（PEEC）分泌(). 从未感染的（-）或鼠伤寒沙门氏菌-在缺乏（负）或存在（+）1μM黄芩素的情况下感染T84单层，然后将其添加回初始T84单层以评估这些条件培养基刺激PMN迁移的潜力。本试验中通过1μM黄芩素的存在评估PEEC生物活性的降低水平，该水平与测定的hepA相关三级别（未显示数据）。总之，这些结果表明黄芩素可以有效地减少hepA的合成三在T84单层中鼠伤寒沙门氏菌感染，并且这种抑制并不影响与PMN渗出相关的基底侧信号事件。
(A类)PMN跨上皮迁移鼠伤寒沙门氏菌（白色条）不受特定5-LO抑制剂咖啡酸（黑色条）的影响。PMN在未感染的T84单分子膜（-）上的转运也显示出来。(B类)在类似的研究中，12-LO抑制剂（黄芩素）诱导了剂量依赖性抑制（黑条）。*,P（P）< 0.025; 学生的t吨测试。(C类)从未感染的T84单层（-）或感染后从T84单层收集的废顶端培养基中测定PEEC生物活性鼠伤寒沙门氏菌SL1344型(6)用1μM黄芩素（Plus）或溶剂对照（Minus）处理，然后添加到幼稚T84单层膜的顶部室以诱导PMN迁移。用1 mM fMLP的顶端涂敷处理的单层作为迁移试验的阳性对照。*,P（P）< 0.05; 学生的t吨测试。(D类)在不存在缓冲液的情况下注射缓冲液的异种移植物的对照肠上皮鼠伤寒沙门氏菌. (E类)鼠伤寒沙门氏菌这些异种移植物的SL1344感染导致红细胞（黑箭头）大量扩散，粘膜和粘膜下层有大量PMN浸润（星号）。图示为早期隐窝脓肿形成（白色开放箭头）。(F类)1小时前将黄芩素导入异种移植物管腔鼠伤寒沙门氏菌SL1344感染预防了与鼠伤寒沙门氏菌感染体内模型。在这些组织中详细测量IL-8(24). fMLP，甲酰-甲亚砜基-亮氨酸-苯丙氨酸。
基于这些体外研究结果，我们接下来评估了黄芩素对鼠伤寒沙门氏菌人小肠异种移植模型的病理学研究(9). 这些移植物感染鼠伤寒沙门氏菌导致严重的组织病理学改变，红细胞在粘膜和粘膜下层大量播散，PMN明显浸润(). 感染的异种移植物还显示出隐窝脓肿、隐窝增生、绒毛尖端萎缩、血管充血、中性粒细胞边缘化、中性粒细胞核浸润和水肿，结果与人类沙门氏菌病的临床表现一致(). 相比之下，小鼠感染了鼠伤寒沙门氏菌与对照感染小鼠相比，巴巴叶素治疗后的发病率显著降低，异种移植组织与从未接触细菌的异种移植非常相似(). 上皮损伤、充血、水肿和PMN浸润的盲法组织病理学评分显示，黄芩素治疗可减少与鼠伤寒沙门氏菌异种移植物至少减少50%[以统计显著的方式(10)]所有评估类别(). 由于hepA的不稳定性三作为评估黄芩素对12-LO通路抑制作用的一种方法，我们监测了12-LO途径的主要代谢物12的管腔分泌(S公司)-海特(19)ELISA（分析设计，密歇根州安阿伯）。收集的流质来自鼠伤寒沙门氏菌-未经黄芩素治疗的受感染异种移植物含有114.5ng/ml12(S公司)-HETE，而从鼠伤寒沙门氏菌-黄芩素治疗动物感染的异种移植物含有21.5ng/ml12(S公司)-HETE（来自两种不同动物的平均量）。尽管鼠伤寒沙门氏菌感染刺激了组织IL-8水平的增加（对照组为52±11 pg/mg，对照组为225±30 pg/mg鼠伤寒沙门氏菌感染），黄芩素治疗不会影响这种增加，因为鼠伤寒沙门氏菌感染（200±53 pg/mg）。这些数据表明鼠伤寒沙门氏菌-通过抑制12-LO途径介导的组织损伤，该途径可阻止hepA三顶端分泌物。
表2。
组织病理学量化
| 损坏 | 充血和水肿 | PMN渗透 |
|---|
| 缓冲区控制 | 0.1 ± 0.0 | 0.6 ± 0.2 | 0.2 ± 0.1 |
| 沙门氏菌 | 1.1 ± 0.3* | 2.3 ± 0.5* | 1.7 ± 0.4* |
| 沙门氏菌+黄芩素 | 0.7 ± 0.2† | 1.3 ± 0.2†‡ | 0.8 ± 0.2†‡ |
讨论
最有可能的是，PMN向上皮间位点的募集是通过基底外侧分泌NF-κB调节的趋化因子（如IL-8、上皮中性粒细胞激活肽-78、生长相关癌基因蛋白-α和单核细胞趋化蛋白）的作用发生的(1,5,6,20,21). 在这个位置，由于邻近上皮细胞颈部存在的TJ的限制作用，PMN在TJ上的迁移需要一个独特的因子，我们以前称之为PEEC。目前的研究支持将该因子确定为类二十碳六烯酸hepA三，因为它满足之前指定给PEEC的所有标准，刺激PMN在上皮屏障TJ的趋化性，但不诱导过早脱颗粒进入感染腔部位。高效液相色谱法三在低至30-40 nM的浓度下，其功能似乎正常，但极不稳定，因此可能在粘膜表面感染的活跃期持续产生。我们的研究旨在确定PEEC并确定其作用体内使用肠道感染模型鼠伤寒沙门氏菌值得注意的是，我们已经确定12-LO抑制是一种潜在的策略，可以通过阻止关键因子hepA的产生来阻止与这些感染相关的炎症结果三参与中性粒细胞最终迁移至肠腔。
本研究所证明的显著发现与之前未被认识到的极化上皮细胞产生和释放hepA的能力有关三以矢量方式，一旦从受感染粘膜表面的顶面释放出hepA三能够在上皮TJ上建立化学梯度，刺激PMN迁移，而不会过早脱颗粒。据推测，正是PMN的脱颗粒导致了许多与粘膜感染相关的炎症(22). 肠上皮细胞对中性粒细胞运动的调控可能在对食源性病原体的先天免疫反应和介导与炎症性肠病相关的活动性闪光事件中起着关键作用。虽然上皮细胞可能产生大量hepA三只有对病原体定植的反应，hepA才有可能三在IBD等条件下，由于12-LO活性在该疾病的活性部位被诱导，因此其生成受到了失调调节(23). 尽管目前尚不清楚hepA三由于感染，hepA从所有粘膜表面的顶面分泌三在人类肺部感染铜绿假单胞菌（B.P.H.和B.A.M.，未发表的意见）。因此，不同病原体在身体不同粘膜表面诱导事件可能会使用一些刺激性决定因素。事实上，上皮性hepA的药理学调节三generation可能为治疗上皮性炎症疾病提供一种新的合适的治疗策略。
致谢
我们感谢Yang Wang、Jim Bourell和Tom Patapoff在LC和LC/MS协议方面的帮助。感谢Cecil Pace-Asciak对hepA甲基化的建议三这项工作得到了国家卫生补助金研究所DK-56754（B.A.M.）、DK-47622（J.L.M.）和DK-2792（A.T.G.）的支持。
笔记
本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。
缩写：PMN，多形核白细胞；致病性上皮化学引诱剂PEEC；庚烷A三，hepoxilin A3；TJ，紧密连接；LT，白三烯；LO，脂氧合酶；12(对)-HETE，羟基二十碳-5Z，7E，11Z，14Z-四烯酸；LC/MS、液相色谱/MS。
工具书类
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