组蛋白H3乙酰化和H3-K4甲基化在人类基因组转录起始位点的独特定位

摘要

我们对组蛋白修饰和转录之间关系的大部分知识来自于以酵母为模型生物的精细研究(1-三). 基因的活性转录发生在两个根本不同的过程中，包括形成活性起始复合物，然后延伸(4). 起始与组蛋白乙酰化和甲基化有关，而酵母中的伸长不仅与组蛋白的乙酰化和甲酯化有关，还与伸长因子的补充有关。在酵母中，组蛋白H3-K9/14乙酰化和H3-K4甲基化不仅与启动子区域相关，还与编码区域相关，表明这些组蛋白修饰也可能在转录延伸中发挥重要作用(5-9).

这些概念为哺乳动物细胞的研究提供了大量背景，在哺乳动物细胞中，相同的组蛋白修饰与人类基因5′区的转录起始有关(10). 然而，平均酿酒酵母基因大小为2kb，酵母基因组比人类基因组紧凑得多，其中平均基因大小约为27kb，这主要是因为存在包含散布重复序列的大内含子(11,12). 人类基因5′起始位点两侧500 bp内的区域代表了总基因组的独特少数（≈1-2%），因此使用高度紧凑的酵母基因组产生的概念可能不具有普遍适用性，特别是在转录区域的染色质性质方面。事实上，最近的研究表明，在鸡和酵母的几个基因座上，H3-K4甲基化模式存在显著差异(13,14). 这促使我们提出这样一个问题：在人类基因组中，起始位点和更普遍的细长区域的组蛋白修饰模式是否相同。

为了回答这个问题，我们开发了一种称为ChAP的基因组扫描技术，该技术将染色质免疫沉淀（ChIP）分析与任意引物PCR（AP-PCR）的扫描能力相结合，以开发一种指纹识别方法，以无偏见的方式评估天然染色质结构的修饰模式。此屏幕不同于所谓的“芯片对芯片”分析(15)因为它不受应用于微阵列的序列的限制，而微阵列主要是编码区域；因此，它允许对整个哺乳动物基因组的随机样本进行分析，该基因组由≈99%的非蛋白编码DNA组成(12). 我们发现组蛋白H3的甲基化赖氨酸4（K4）和乙酰化K9/14均高度定位于转录活性人类基因的5′区，但在起始位点下游显著减少，这表明哺乳动物启动子具有与酵母中描述的类似的染色质构型。然而，大多数转录的DNA与这些修饰无关，即使在活性基因上也是如此。

材料和方法

细胞系和ChAP分析。所分析的两个细胞系T24和LD419按照参考文献所述进行培养和维持。16ChAP分析结合了ChIP分析和AP-PCR基因组筛查技术。

ChIP分析。参考文献中描述了ChIP分析的详细方法。17和18.使用10毫升抗甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）、10μl抗乙酰化H3-K9/14、10μl抗二甲基化H3-K4（纽约州普莱西德湖上游生物技术公司）、10微升抗三甲基化H3-K4（英国剑桥Abcam公司）或10μl正常小鼠IgG作为阴性对照（圣克鲁斯生物科技公司）。

AP-PCR。用三个或四个随机引物（GC-rich或GC-poor）的组合通过AP-PCR扩增出五微升ChIP DNA。如参考文献所述，分离感兴趣的片段。19和20。通过使用爆炸程序(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)加州大学圣克鲁斯分校人类基因组浏览器(http://genome.cse.ucsc.edu)、和cpg岛搜索器程序(网址：www.uscnorris.com/cpgislands) (21).

免疫沉淀DNA的PCR分析。扩增是通过使用Expand-DNA聚合酶（Roche Molecular Biochemicals）和5μl免疫沉淀DNA、5μl非特异性抗体阴性对照物（NAC）或1μl输入染色质实现的(17). PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。如有要求，可提供用于这些常规ChIP PCR的PCR条件和引物。

免疫沉淀DNA的实时PCR分析。使用DNA引擎光学系统（MJ Research，Cambridge，MA），使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶（Applied Biosystems）和5μl免疫沉淀DNA、5μl NAC样品或1μl输入样品（0.2%）进行定量PCR。Biosearch合成了荧光标记TaqMan探针。可根据要求提供引物和探针序列。所有PCR均在相同条件下进行：95°C 15 s，59°C 1 min，45个循环。对于每组PCR，包括已知量的DNA的滴定作为定量的标准。每个PCR集包括来自用抗乙酰化H3-K9/14、抗二甲基化H3-K4、抗三甲基化H3-K4免疫沉淀的ChIP样品和用非特异性抗体（NAC）免疫沉淀的ChIP样品的DNA。免疫沉淀DNA的比例计算为（带抗体的免疫沉淀样品的数量-NAC的数量）/（输入DNA的数量（1%）-NAC数量）。

结果和讨论

对人膀胱癌细胞株T24进行治疗就地使用甲醛，并使用针对MeCP2、H3-K9/14乙酰化和H3-K4二甲基化的抗体进行标准ChIP。使用随机的GC-丰富或非GC-丰富的10-mer引物集和聚丙烯酰胺凝胶上显示的放射性产物，通过AP-PCR扩增免疫沉淀物中的DNA(图1一个). 放射自显影显示，作为非特异性抗体阴性对照（NAC）的正常小鼠IgG中不存在的免疫沉淀物在滑道中出现条带。这些条带也存在于基因组DNA（输入DNA）的稀释样品中。信息带被认为存在于免疫沉淀通道中而不存在于NAC通道中。我们使用MeCP2抗体作为非活性染色质的标记(17,18). 活性标记（乙酰化的H3-K9/14和二甲基化的H3-K4）产生的带是耦合的，但与MeCP2产生的带不同。这一结果表明AP-PCR凝胶上活性和非活性染色质标记相互排斥，并证明了ChAP分析的实用性和有效性(图1一个). 在这些实验中，我们为每个AP-PCR使用了三到四个随机引物（GC-rich或GC-poor）。一般来说，通过为每个AP-PCR选择不同的引物组合，我们每个反应获得≈10-20条信息带。我们共分析了20个AP-PCR（GC-rich和GC-poor引物各10个），获得了由乙酰化H3和二甲基化H3-K4抗体沉淀的288条信息带。这些DNA物种或弱或未被MeCP2沉淀，约85%的条带显示出H3-K9/14乙酰化和H3-K4二甲基化之间的强烈一致性（数据未显示）。在大多数情况下，0.2%输入控制车道上的信息带也很弱。这些结果表明，在人类基因组中，H3-K9/14乙酰化和H3-K4二甲基化最常出现在相同的DNA序列中。

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图1。

典型的ChAP分析和常规ChIP分析验证。用甲醛处理T24细胞，并用MeCP2特异性抗体（非活性标记物）、乙酰化H3-K9/14和二甲基化H3-K4免疫沉淀。最终沉淀的DNA用于AP-PCR和常规ChIP-PCR。(一个)ChAP分析（结合了ChIP和AP-PCR）。使用放射性标记的AP-PCR产物生成ChAP指纹分析凝胶。箭头代表具有潜在有趣图案的条带，随后从凝胶中分离并测序。实心箭头表示由活性染色质标记物（乙酰化H3-K9/14和二甲基化H3-K4）特异性抗体沉淀的条带，而开放箭头表示由非活性标记物抗体MeCP2沉淀的条带。(B类)用标准ChIP分析确认条带。使用常规ChIP分析对从ChAP分析中随机选择的16条带进行了检测。输入DNA，样本代表每次实验的总输入染色质（0.2%）。

288条信息带中的57条是从凝胶中随机切下、克隆和测序的。对16个随机选择的片段进行常规ChIP分析，以确认分离的染色质片段上两个活性标记的共有性(图1B类)和RT-PCR实验表明，所有16个基因均已表达（数据未显示）。活性标记沉淀的DNA经ChIP-PCR后出现了明显的强条带。在所分析的所有16条带的免疫沉淀物中也观察到类似的结果，表明ChAP分析可靠地反映了这些修饰模式。大约15%（288个片段中的43个），例如G7-7、G4-1、G6-8和G10-8(图1B类)，显示AP-PCR凝胶中强度的差异。尽管这些差异在传统的ChIP分析中不明显，但定量差异可以通过实时PCR分析记录下来（见图。​图3三和​和44).

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图3。

5′区乙酰化H3和二甲基化H3-K4水平与基因体的比较HTATIP2型(一个)以及手动1(B类). 结果来自三个独立的ChIP分析的三个独立实时PCR。(一个和B上部)实心方框表示外显子，箭头表示潜在的转录起始位点。三角形（基因5′区域的填充三角形和基因体的开放三角形）表示通过实时定量PCR分析的区域。(一个和B下部)误差条表示从三个独立实验中获得的标准偏差。

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图4。

(一个)地图第16页基因位点通过外显子2跨越启动子上游区域。箭头指示转录起始位置。灰色框表示CpG孤岛，阴影框表示重复元素。地图下方的水平条表示通过实时定量PCR扩增的10个DNA区域（≈78-112 bp）的位置。(B类)组蛋白修饰图第16页在LD419成纤维细胞系中分别用乙酰化H3-K9/14、二甲基化H3-K4和三甲基化H3-K4抗体免疫沉淀的位点（区域1-10），其表达第16页（填充条）和T24癌细胞系，其不表达第16页（开放式酒吧）。误差条表示从三到五个独立实验中获得的标准偏差。

活性标记抗体的57条免疫沉淀带表明，几乎所有带都与基因相关(表1)值得注意的是，57个片段中有33个（58%）位于数据库中已知基因或EST转录起始位点两侧500 bp以内(图2一个). 在分析的57个片段中，只有16个（28%）位于基因体内（定义为转录起始点下游500 bp或更远的任何区域），而57个片段当中有8个（14%）位于主要由重复元件组成的非基因区域(12). 活性染色质标记沉淀的条带高度定位于基因的5′区，与引物的GC含量无关。因此，富含GC的引物（G系列）的40个片段中有23个和缺乏GC的引物（P系列）的17个片段中有10个定位在5′区。位于基因5′区的33个片段中，有20个符合人类5′区预期的CpG岛标准(12,21). 这些结果表明，谱带的分布取决于抗体，而不是由于GC-PCR引物的扩增有偏。

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图2。

(一个)5′区（位于EST基因转录起始位点或5′端两侧500bp内）和基因体（基因中转录起始位点下游500bp或更远的任何区域）的图谱。(B类)比较乙酰化K9/14-H3和二甲基化H3-K4靶向条带中的5′区和基因体，以及这些区域在整个人类基因组中的预期分布。其他，非基因地区。(C类)乙酰化的H3-K9/14和二甲基化的H3-K4抗体免疫沉淀的38个区域的5′起始位点序列的大小和位置，距离最近的转录起始位点1 kb。每个水平条代表从AP-PCR凝胶中克隆和测序的单个条带，并相对于GenBank数据库中的起始位点进行定位。垂直条表示每个200-bp窗口中所示位置相对于起始位置的序列数。灰色框表示转录起始位点两侧500 bp范围内的区域。

接下来，我们将染色质片段的分布与人类基因组中的预期频率进行了比较(图2B类). 为此，我们使用了人类基因组的完整序列，其中包含2.91千兆碱基的DNA和≈35000个基因(12). 基因的5′区代表基因组的一小部分（1-2%），假设每个基因平均有两个转录起始位点。因此，乙酰化H3-K9/14和二甲基化H3-K9抗体免疫沉淀的57（58%）片段中，33个片段的出现频率比随机预测的至少高30倍(P（P）< 0.0001). 每个基因在5′起始位点附近38条带的优先位置清晰可见，如图所示图2C类组蛋白乙酰化的H3-K9/14和甲基化的H3-K4抗体免疫沉淀的序列峰值在200-bp窗口内，包括转录起始位点及其下游。

ChAP分析可能是无偏见的，它提供了令人信服的证据，表明活性染色质标记优先位于转录起始位点附近，在那里它们很容易被用于ChIP的抗体识别。接下来，我们通过研究从AP-PCR凝胶中分离的两个基因的转录起始位点和下游区域的H3-K9/14乙酰化和H3-K4二甲基化水平，利用实时PCR的定量能力验证了数据，即HIV-1Tat相互作用蛋白2基因(HTATIP2型)和完整的内核膜蛋白基因(人1). 定量被扩展到包括对人类LD419正常膀胱成纤维细胞和T24膀胱癌细胞组蛋白修饰状态的分析。我们还测量了两种细胞系中三甲基化H3-K4的水平，因为这种组蛋白修饰最近被证明只局限于酵母中的活性基因(6,8) (图3). 实时PCR的定量结果再次证明，这两个基因的转录起始位点附近存在所有三个标记，并证实这些标记在起始位点相对于下游区域的富集程度是6到122倍(图3). 检测到正常细胞和癌细胞起始位点之间标记物水平的数量差异，但实际上在这两种细胞类型中都表达的两个基因的下游区域中，这些修改都不明显（数据未显示）。

我们扩展了我们的研究范围，包括了对该基因转录单位7-kb区域组蛋白修饰的详细分析第16页两种细胞类型中的基因(图4一个). 我们之前已经描述了第16页详细介绍启动子，以便我们能够研究一个特征明确的启动子区域(22)而不仅仅是一个5英尺的起点。我们实验室以前的工作表明，在第16页启动子，这种甲基化与组蛋白去乙酰化和H3-K4低甲基化有关(17,18). 定量实时PCR分析显示，在LD419成纤维细胞的转录起始位点（区域4-7）周围，分别存在乙酰化的H3-K9/14和H3-K4二甲基化和三甲基化的“气泡”，它们积极表达该基因(图4B类) (17,18). 该区域对转录活动至关重要(22)与此区域的T24细胞相比，LD419细胞中两个活性染色质标记物的富集度约为40至51倍。然而，位于LD419细胞转录起始位点两侧的区域3和8中的二甲基和三甲基K4-H3以及乙酰化K9/14-H3显著减少。由于区域3和区域8之间的距离约为≈2 kb（近似于平均酵母基因的大小），这些标记的富集表明这些组蛋白修饰局限于≈12-14核小体的气泡。这种距离可能是组蛋白H3乙酰化和H3-K4甲基化在酵母紧密编码区中没有显著降低的原因。如前所述HTATIP2I公司和手动1由ChAP方法确定(图3)，在远离启动子的区域，两个活性染色质修饰的水平显著降低。这些发现表明，在人类基因中，这些组蛋白修饰可能参与转录的启动和/或启动和延伸之间的过渡，可能局限于启动子区域，正如先前在酵母中所描述的那样(1,4). 然而，人类基因由于其巨大的内含子结构，在转录延伸方面具有不同的染色质组织。我们的发现也为以前的研究提供了更多的全球支持，这些研究显示了鸡和酵母中截然不同的组蛋白修饰模式(13,14).

我们的结果由ChAP分析获得，并由更定量的实时PCR证实，表明人类基因中至少有两种潜在的转录起始和延伸机制。H3-K9/14乙酰化和H3-K4甲基化可能是转录起始和起始与延伸之间的过渡阶段所必需的，但可能不能在整个转录区域用RNA聚合酶II（pol II）追踪。我们早期的研究表明，含有重CpG甲基化、MeCP2结合和核酸酶不可接近性的区域并不阻止转录延伸，这表明了这种可能性(17,18). 或者，H3-K9/14乙酰化可能在人类pol II进展后不久“重置”到未修饰状态，因为已经证明组蛋白脱乙酰化酶Hos2与酵母中活性基因和脱乙酰化组蛋白H3和H4的编码区相关(2,23). 与乙酰化相比，组蛋白甲基化不容易可逆，似乎没有二甲基和三甲基化H3-K4的核小体可能被人类pol II穿过。人类基因的转录区具有比酵母大得多的转录单位，可以保持去乙酰化构象，以避免来自隐秘启动子（包括与转座元件相关的启动子）的不当转录起始。最近，研究表明组蛋白H3.3沉积在活性染色质上富集(24,25). 组蛋白H3.3也比H3具有相对较高的组蛋白修饰富集度，包括二甲基和三甲基化的K4和乙酰化的K9/14(26). 我们在本研究中使用的抗二甲基和三甲基H3-K4和乙酰化H3-K9/14的抗体不仅针对H3，也针对H3.3。因此，我们的结果表明，人类活性基因的5′区可能比转录区具有更高的组蛋白H3.3水平。

因此，ChAP检测是一种快速而稳健的比较方法，可以以无偏见的方式分析组蛋白编码在基因组中的分布和变化。重要的是，它使我们能够检查整个基因组，而不是受到编码序列可用性的限制，编码序列在整个人类基因组中只占很小的比例。对修饰组蛋白和其他染色质蛋白的特异性抗体的可用性不断增加，使得ChAP成为比较这些修饰的相对分布的理想方法，不仅在单个基因组中，而且在不同细胞类型之间。H3-K9/14乙酰化和H3-K4甲基化与基因5′区的强烈关联表明，这些区域可能在基因组其余区域的背景下作为“信标”而突出，从而可以通过ChAP分析和可能的转录起始因子轻松识别它们。

致谢

笔记

本文直接（第二轨道）提交给PNAS办公室。

缩写：ChIP，染色质免疫沉淀；AP-PCR，任意引物PCR；甲基CpG结合蛋白2；NAC，非特异性抗体阴性对照。

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