美国国家科学院院刊。2004年5月11日；101(19): 7209–7210.
鼠标中的修饰屏幕：是时候推进反向遗传学了
澳大利亚维多利亚州3050帕克维尔皇家墨尔本医院扶轮骨髓研究实验室
在过去的十年里，阿马约对生物学的关注是人类和小鼠基因组的测序。在确定了它们的组成基因后，当务之急是了解这些基因所起的生理、细胞和生物化学作用，并确定如何利用这些知识来改进对许多疾病的治疗，但治疗方案有限。尽管从酵母、苍蝇等低等生物的基因筛选中已经获得了大量关于基本过程的知识(1)和蠕虫，是老鼠占据了特殊的位置，因为最近不仅可以进行大规模的基因筛查(2,三)但它的基因组也可以被精确地操纵，以模拟人类疾病，即所谓的反向遗传学。在最近一期PNAS上发表的一篇里程碑式的文章中，Carpinelli等。(4)已经证明，可以建立人类疾病（先天性血小板减少症）的小鼠模型，并确定导致改善或治愈的突变。在这样做的过程中，他们证明了基因修饰筛选在低等生物中的作用是如此强大(5,6)，在小鼠中也是可行的，他们已经表明，这项技术可能应用于人类疾病治疗靶点的发现和验证。当人们将他们的研究提出的关于血细胞形成调控的问题混为一谈时，很明显，这篇文章将引起广泛的遗传学家和细胞生物学家以及生物制药行业的人们的兴趣。
识别遗传途径
血小板输注是血小板减少症的有效治疗方法，尽管供应有限、输注相关毒性以及血小板同种抗体的发展迫切需要替代治疗。不幸的是，血小板生成素（TPO）是血小板生成的血统特异性调节因子，在治疗贫血或粒细胞集落刺激因子治疗化疗引起的中性粒细胞减少症方面，其疗效远远低于促红细胞生成素。卡尔皮内利等。(4)使用未合子小鼠Mpl公司是TPO的受体，用于识别血小板生成的其他调节器。Mpl公司-/-小鼠有10%的正常血小板数量(7). 男性Mpl公司-/-用强诱变剂处理小鼠N个-乙基-N个-亚硝基脲（ENU），最常见的是诱导AT到TA的颠倒。利用七种不同表型性状的研究(8)，以及最近的直接测序(9)据预测，ENU治疗小鼠的每个精子都会包含约50个基因的突变。ENU处理百万像素-/-小鼠与雌性交配Mpl公司-/-小鼠产生1575 G1每只小鼠50个基因突变的后代，其基因组35000个基因的覆盖率约为2倍。G公司1对小鼠进行显性表型筛查，在本例中为遗传性血小板减少症的抑制因子。他们报告了5个突变G1血小板计数高于平均血小板计数至少3 SD的小鼠Mpl公司-/-小鼠，其中两种动物将这种特性传给了后代。这两个可遗传的突变体与129/Sv菌株杂交，产生一组F2通过简单序列长度多态性（SSLP）分析对小鼠进行定位。这两个突变都映射到一个10Mb区域，该区域包含c（c）-Myb公司基因以及一系列其他已知或推测的基因。当使用候选基因方法时c（c）-Myb公司发现DNA结合或亮氨酸拉链结构域的点突变。这些突变体是c（c）-Myb公司; 然而，观察到杂合性c（c）-Myb公司(10)和一个低形态等位基因c（c）-Myb公司(11)血小板计数升高提供了有力的旁证。也许最引人注目的是纯合子c（c）-Myb公司在存在或不存在TPO信号的情况下，突变株的血小板计数同样较高。TPO是否通过下调c-Myb表达来提高血小板数量尚待确定。
正向遗传筛选的一个重要优点是能够在不预先了解表型遗传调控的情况下识别基因。c（c）-Myb公司1991年通过胚胎干细胞同源重组产生敲除等位基因后，首次被认为是造血调节因子(10). 与许多其他基因敲除一样，胚胎致死性排除了对c（c）-Myb公司在成人造血中。尽管五-Myb公司与鸡的巨核细胞生成调节有关(12)，又过了12年c（c）-Myb公司在小鼠中证明了其在血小板生成中的作用(11). 的确，低形态c（c）-Myb公司等位基因是偶然出现的，因为新霉素选择盒干扰了c（c）-Myb公司.Carpinelli的研究等。(4)已识别c（c）-Myb公司作为血小板生成的调节器，在2年内没有任何遗传偏见，而且几乎可以肯定的是，与应用于c（c）-Myb公司。应该认识到c（c）-Myb公司最近发表的基因敲除等位基因使突变体变得简单多了c（c）-Myb公司(11). 鉴于基因组中<20%的基因具有特定功能，正向遗传筛选的一种更可能的情况是，不能使用候选基因方法，需要更精细的绘图，然后对已知或假定的基因进行测序，并进行互补研究，以证明野生型基因可以拯救表型。事实上，在这项筛选中已经鉴定出另外两种抑制突变体，它们与c（c）-Myb公司而且，并非出乎意料的是，尚未有报道（D.J.Hilton，个人通讯）。ENU诱变的优势之一是能够识别在没有深入的结构功能知识的情况下通过反向遗传学不可能识别的低形态等位基因。这个c（c）-Myb公司突变体识别对c（c）-马来西亚令吉结构分析不易预测的功能。这为设计靶向c-MYB这些区域的小分子以治疗缺乏功能性Tpo或Mpl基因的人类血小板减少症奠定了基础(13,14). 也许更有趣的是以c-MYB为靶点治疗或预防化疗诱导的血小板减少症的潜力。
识别功能缺失突变
修改器屏幕在鼠标中的成功应用具有深远的意义。到目前为止，修饰筛选仅限于低等生物，例如黑腹果蝇(15). Carpinelli的研究等。(4)代表了第一个在小鼠中发布的大规模修改屏幕，这项研究雄辩地证明了修改屏幕相对于野生型小鼠屏幕的优势。如上所述，修饰语筛选可以定义遗传途径，在这种情况下，证明c（c）-马来西亚令吉和多协议标签可能存在于相同的途径中，这是以前的研究中没有认识到的c（c）-Myb公司此外，修饰筛选为检测表型变化提供了更灵敏的背景。在本研究中Mpl公司-/-小鼠可以检测到c（c）-Myb公司单位：G1老鼠。尽管ENU可以诱导激活突变，但功能丧失突变更为常见，只有在纯合突变的小鼠中才能检测到，即G三老鼠。虽然显性筛选需要1000-2000只小鼠才能达到饱和，但隐性筛选需要至少20G的分析三来自每个独立G的动物2因此，血统和劳动密集度是主屏幕的20倍。因此，报道的全基因组隐性筛查相对较少(16,17). 简化小鼠隐性筛选的一种方法是基于染色体区域的筛选(18). G公司1ENU处理雄性小鼠的后代与携带染色体缺失或反转的小鼠杂交。G公司2在删除的染色体中遗传基因突变的后代将显示表型(19-21). 用外壳颜色基因或荧光标记标记染色体区域可以追踪突变染色体。对含有染色体缺失的胚胎干细胞进行ENU诱变也可以识别G基因的隐性突变1老鼠(22). Carpinelli的研究等。证明修改屏幕可以更容易地识别G中的功能丧失突变1老鼠。杂合的c（c）-Myb公司野生型基因背景下的小鼠血小板计数只有非常轻微的增加，因此使用野生型小鼠进行筛查时不会发现G基因突变1老鼠。具有讽刺意味的是，另一个小组在野生型遗传背景下进行全基因组筛查，也发现了c（c）-Myb公司，但仅在G中三老鼠。修饰筛选也更有可能检测到使表型恶化的基因，因为潜在的突变减少了机体的代偿性变化储备。例如Mpl公司-/-尽管造血干细胞数量减少了10倍，但小鼠的外周血红细胞和白细胞数量正常(23). 因此，调节造血干细胞的基因可能更可能在ENU诱变筛选中检测到Mpl公司-/-背景。
药物发现的修饰筛选
在小鼠身上成功的改良筛选为使用人类疾病小鼠模型的类似筛选铺平了道路，前提是它们满足几个先决条件。小鼠模型的表型需要具有高度渗透性，而遗传背景的影响很小，以便于绘制突变图。理想情况下，需要在断奶后不久识别表型，以缩短动物的饲养时间。需要6个月以上住房的表型不太实用。表型筛查也需要高通量，以便每周对大量小鼠进行分析。本研究中使用的自动血液分析等分析(4)特别适合。单基因疾病将是最适用的疾病模型。例如，血红蛋白病或遗传性凝血障碍（如因子V莱顿）小鼠模型的修饰剂将是理想的。癌症小鼠模型，如第53页这种缺陷也可能有助于识别修改肿瘤发生的基因。相比之下，由于遗传背景的影响，通过正向遗传方法对糖尿病等复杂遗传特征的剖析更具问题性。
ENU对低等生物体的诱变作用已被很好地证明可用于发育研究。尽管大多数实验室将继续使用小鼠进行反向遗传学，但卡宾利的研究等。(4)应该为其他人提供勇气，在他们感兴趣的生物过程中追求类似的方法。现在是时候将修饰筛选应用于小鼠的生理和疾病过程，并最终将此方法用于设计用于治疗目的的小分子。
笔记
参见第页的配套文章6553第101卷第17期。
工具书类
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