国家协议。作者手稿；PMC 2014年7月14日发布。
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PMCID公司：项目经理4096497
尼姆斯：NIHMS602694标准
MitoPY1的制备及其在活细胞线粒体过氧化氢成像中的应用
美国加州大学伯克利分校霍华德·休斯医学院化学、分子和细胞生物学系。
摘要
线粒体过氧黄1（MitoPY1）是一种小分子荧光探针，可选择性追踪活体生物样本的线粒体，并对过氧化氢（H2O（运行）2)通过开启荧光增强。这种双功能染料使用三苯基鏻靶向基团和基于硼酸盐的分子开关来选择性地响应H2O（运行）2线粒体内活性氧（ROS）的过度竞争。MitoPY1可用于测量线粒体H2O（运行）2细胞培养和组织模型中的水平。在本方案中，我们描述了MitoPY1的合成以及如何使用这种化学工具来可视化线粒体H2O（运行）2在活细胞中。MitoPY1的制备预计需要7-10天，而涉及培养哺乳动物细胞显微镜检查的分析可以在1-2天内完成。
简介
ROS调节生物系统中各种不同的病理和生理事件，包括生长因子信号传导1，伤口愈合2、干细胞维护和神经发生三,4和昼夜节律5,6一个特定的活性氧是作为一种生理信号分子还是氧化应激和疾病的介质，取决于其特性及其在细胞内的位置7–9线粒体是内源性细胞H的主要来源2O（运行）2，一个特别重要的ROS10–13这主要是因为电子传输链的固有“泄漏性”，这意味着分子氧还原为水是不完美的，而无赖的还原当量可以逸出并与O反应2形成超氧物，迅速还原为H2O（运行）2(参考14). 与最近发现的线粒体氧化还原变化介导的生理过程的作用一致，包括生长信号和神经元放电15–17，开发了在该特定场所检测ROS的新方法18，包括小分子19–21和基于蛋白质的荧光传感器(参考文献。22–26和).
表1
| 工具 | 应用程序 | 赞成的意见 | 欺骗 | 裁判。 |
|---|
| MitoSOX公司 | 非特异性检测
线粒体活性氧水平，
超氧化物的检测
具体使用
选择性激发 | 对许多ROS敏感，但可以实现
条件超氧化物特异性，可见
一般ROS的激发和发射，
不需要转染 | 不可逆转，需要成熟
图像的成像技术
特别是超氧化物-
特定激发需要近紫外线
光和随后的光稳定性
问题可能导致误报 |
19
|
| 线粒体HR/线粒体AR | 线粒体的检测-
drial高反应性
氧气种类，包括
羟基自由基，过亚硝酸根
和次氯酸盐 | 针对一小类可见ROS
激发和发射，不需要
转染，光稳定性限制错误
积极因素 | 不可逆，不检测
一个特定ROS |
20
|
| 米托PY1 | 线粒体的检测-
干燥H2O（运行）2 | H（H）2O（运行）2特异性，与其他
针对不同种类的硼酸盐基染料
现场，可见激发和发射，
不需要转染，光稳定性
限制误报 | 不可逆，相对较慢的动力学 |
21
|
基于蛋白质
传感器 | 各种ROS的检测
在多个细胞器中 | 活性氧的可变特异性，遗传
可针对任何细胞器，而不是
需要添加外源小分子，
有利于长期监测
氧化还原状态，可逆 | 需要转染，通常依赖
半胱氨酸氧化、表达
氧化还原活性蛋白
一段时间可能改变氧化还原
系统状态 |
22–26
|
我们的实验室使用了H2O（运行）2-作为构建对内源性H有选择性反应的各种小分子探针的一般策略，将芳基硼酸盐介导转化为苯酚2O（运行）2其他竞争ROS4,27–32本方案描述了MitoPY1的处方型制备()，第一代H2O（运行）2-检测生命系统线粒体内这种特殊活性氧的特异荧光团21以及线粒体H成像程序2O（运行）2在培养细胞中。
线粒体过氧黄1（MitoPY1）。(一)合成方案。(b条)显示H的方案2O（运行）2-介导激活MitoPY1。
MitoPY1是一种双功能分子，结合了硼酸盐标记的黄嘌呤荧光团支架，用于选择性H2O（运行）2利用细胞器特异性质子梯度检测和三苯基膦靶向基团定位线粒体33–35.H型2O（运行）2-介导的MitoPY1的硼酸盐到苯酚的转化触发了底部环内酯的随后开放，从而暴露出荧光明亮的完全共轭的黄嘌呤荧光团(). MitoPY1选择性且有效地定位于各种常见哺乳动物细胞系的线粒体，在那里它可以对H的局部变化做出反应2O（运行）2荧光开启时的水平增加。MitoPY1能够可视化线粒体H2O（运行）2由小分子氧化应激诱导剂百草枯触发的生成。此外，MitoPY1最近被用于检测内源性H2O（运行）2在各种细胞培养模型中36,37以及测量线粒体H2O（运行）2大鼠肾髓质厚升支组织分离物的水平38这些研究表明，钠摄入导致线粒体H增加2O（运行）2这表明高血压和氧化应激之间存在联系。MitoPY1的优点包括ROS特异性、细胞器特异性检测、可见的激发和发射、能够将此探针与针对其他细胞器的基于硼酸盐的探针同时使用，以及能够将此技术用于组织或整个生物体而无需转染。缺点包括与H的不可逆反应2O（运行）2，慢于最佳反应动力学和目前只有单一发射颜色的可用性。
合成过程按100-mg规模进行描述，以产生10-mg范围内的MitoPY1，这足以进行许多生物分析。然而，我们发现这种合成过程是可扩展的，因此化合物1,2和三可以以克为单位生产，生产出数百毫克的MitoPY1，没有任何问题。此外，该合成过程可用于创建其他线粒体定位的双功能荧光探针。所使用的荧光支架允许在合成的最后阶段添加以线粒体为靶点的三苯基鏻基团，因此许多反应可能用于将其他保护或传感基团应用于化合物的苯酚1或者在化合物的微不足道的位置2.
在下面的过程中，我们描述了一个使用在盖玻片上生长的粘附哺乳动物细胞的示例实验。我们建议每种处理类型使用三个重复。预计会影响H的条件2O（运行）2在向培养基中添加MitoPY1后进行浓缩。对于阳性对照，我们建议用H2O（运行）2（步骤53）。如果需要，可以在步骤51中与MitoPY1溶液同时添加线粒体特异性控制染料，以确认MitoPY1信号的预期定位。
对于每种细胞类型，在应用影响H的条件之前，应进行初始实验，以确定用MitoPY1培养细胞的最合适时间长度2O（运行）2浓度。该时间间隔取决于基线H2O（运行）2细胞类型的产生和特定细胞或组织类型的染料吸收特性。
这里描述的方法被发现在检测线粒体H水平方面很有用2O（运行）2在各种人类细胞系和组织样本中。一个警告是，如果过亚硝酸根的浓度足够高，它也可能会使硼酸盐基团失去保护，但这种物质的浓度通常比过氧化物低得多39; 然而，必须始终进行适当的控制，以充分验证H的存在2O（运行）2在生物系统中。常见的控制措施包括服用抗氧化剂，如N-乙酰半胱氨酸，普通黄素抑制剂，如二苯碘铵和H2O（运行）2-特异性清除剂，如过氧化氢酶；另一种控制方法是通过基因操纵H的假定来源2O（运行）2此外，由于荧光信号受探针摄取、细胞内反应速率和细胞内H浓度的影响2O（运行）2，H内源性浓度的量化2O（运行）2具有挑战性。因此，除非在给定的生物模型中进行了广泛的校准，否则使用MitoPY1获得的数据最好以相对值（即控制与刺激、疾病与健康）来使用。
对于每种条件，应采集在不同领域拍摄的多张图像，并应至少重复三次实验，以获得各种条件下的平均荧光强度。或者，一旦使用显微镜来验证MitoPY1在每个新的生物模型中的定位，就可以使用流式细胞术来量化各种条件下的平均荧光强度。我们预计类似的协议也应适用于透明生物体，如斑马鱼胚胎或秀丽隐杆线虫，因为相关的硼酸盐基荧光探针已被证明有效体内32.
材料
试剂
本方案中使用的所有化学品和反应都可能有害，因此应使用实验室工作服、手套和眼睛保护装置。
（4-碘丁基）三苯基鏻（IBTP），按别处所述制备40
2-（2,4-二羟基苯甲酰基）苯甲酸，如别处所述制备41
1-（3-羟基苯基）-哌嗪（Sigma-Aldrich，目录号651672）
N个-苯基-双（三氟甲基磺酰胺）（Sigma-Aldrich，目录号295973）
三氟乙酸（TFA；Sigma-Aldrich，目录号T6508）
Fmoc-Cl（Sigma-Aldrich，目录号160512）
钯（dppf）氯2·中国2氯2（Sigma-Aldrich，产品目录号379670）
哌啶（Sigma-Aldrich，目录号104094）
Bis（pinacolato）diboron（Sigma-Aldrich，目录号473294）
乙酸钾（Sigma-Aldrich）
过氧化氢，30%（wt/vol）（H2O（运行）2; Sigma-Aldrich）
硅胶60
硫酸钠
碳酸钠（Na2一氧化碳三; Sigma-Aldrich）
碳酸氢钠（NaHCO三; Sigma-Aldrich）
二甲基亚砜，HPLC级（EMD）
色谱用乙酸乙酯（Fisher Scientific）
色谱用己烷（Fisher Scientific）
色谱用甲醇（Fisher Scientific）
色谱法用二氯甲烷（Fisher Scientific）
二乙醚（无水；Fisher Scientific）
甲苯（无水；Fisher Scientific）
乙腈（从CaH中蒸馏2)
N、 N个-二甲基甲酰胺（DMF；无水；SureSeal，Sigma-Aldrich）
微孔纯化水
DMEM（Invitrogen）
谷氨酰胺（Sigma-Aldrich）
FBS（西格玛-阿尔德里奇）
聚乙烯-我-赖氨酸（Sigma-Aldrich）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS；Sigma-Aldrich）
成像实验用细胞（参见试剂设置）
试剂设置
用于成像的细胞，生长在玻璃盖玻片上
在24孔板中的培养基中培养细胞，以便在玻璃盖玻片上成像，盖玻片涂上最适合细胞系的基质。哺乳动物细胞系HEK 293T、Cos-7、HeLa和CHO。通常使用K1。细胞培养的一个典型示例如下：简单地说，HEK 293T细胞在添加10%（vol/vol）FBS和谷氨酰胺（2 mM）的DMEM中培养。成像前一天，将细胞传代并置于18 mm玻璃盖玻片中，盖玻片上涂有聚赖氨酸（50μg ml）−1)在24孔板的每个孔中。用于成像的粘附细胞生长到50-80%的汇合处。
设备设置
培养皿
在我们的实验室中，将盖玻片上的细胞转移到培养皿中，并使用水浸显微镜物镜进行分析；该方案可以很容易地适用于带油基物镜的盖玻片架和倒置显微镜，或任何其他培养技术，用于制备细胞、组织或生物体以供显微镜观察。应避免使用含有血清和酚红的培养基。
程序
Fmoc-哌嗪奈洛多的合成（1）
10–12小时，加上净化
1∣检查重型压力瓶和盖子是否有裂缝或破裂，并确保带o形环的螺纹特氟龙盖密封良好。
确保压力瓶完好无损，以避免爆炸。 2∣向烧瓶中添加1.24 g（4.8 mmol，1.0当量）2-（2,4-二羟基苯甲酰基）苯甲酸和853 mg（4.8 mm ol，1.0等量）1-（3-羟基苯基）哌嗪。添加一个可以在烧瓶中自由旋转的磁性搅拌棒。
3∣将烧瓶内容物溶解在约20 ml TFA中。
TFA具有腐蚀性和挥发性，应在通风橱中处理。 4∣将带o形环的特氟龙盖牢牢拧入到位，以确保压力瓶完全密封。
5∣用夹子将烧瓶牢牢固定在室温（20–25°C）油浴中，油浴放置在带搅拌器的温控加热元件上。
6∣在开始加热之前，在加热元件周围放置防爆罩。
出于安全考虑，请确保如果重物烧瓶破裂，则不会有任何内容物喷出防爆罩。 7∣在搅拌烧瓶的同时，将油浴加热至95°C。
8∣3小时后，关闭加热元件，让反应冷却至室温。
9∣混合物完全冷却后，从油浴中取出烧瓶并小心地取下盖子。
10∣向500毫升烧杯中添加300毫升乙醚和搅拌棒。
11∣在乙醚剧烈搅拌的同时，缓慢地将重量级烧瓶中的内容物倒入乙醚中。应形成红色沉淀。
12∣使用低真空通过中等烧结过滤器过滤乙醚。
13∣一旦液相通过熔块，立即关闭真空并开始将固体滤液溶解在甲醇中。
可能是由于残留TFA的存在，固体沉淀物在过滤后立即开始形成油，这就是为什么在过滤完成后立即将固体溶解成甲醇很重要的原因。 14∣将甲醇溶液转移到一个500毫升的圆底烧瓶中，并使用旋转蒸发器和加热水浴在减压下干燥。去除所有溶剂后，应保留红色固体。然后，可以将该粗产品储存在室温下，用于以下反应，无需进一步净化。
15∣将含有磁性搅拌棒的15 ml Schlenk管在130°C的电炉中干燥至少4小时。
16∣开始N的流动2冲洗N中的空气2行。从步骤15开始，用磁力搅拌棒将干燥的15毫升Schlenk管从烤箱中取出，趁热将N2管路连接到管子。将橡胶隔膜连接到Schlenk管上，并将针插入隔膜。打开Schlenk管上的阀门，在N的流量下冷却反应容器2.
17∣在玻璃器皿冷却至室温后，添加1.09 g来自步骤14的粗产物、845 mg（3.27 mmol，0.68当量）Fmoc-Cl和686 mg（8.16 mmol，1.7当量）NaHCO三同时继续N的流动2.用隔膜重新密封试管，用针头和注射器加入20ml无水乙腈，在室温下N的气氛下搅拌反应混合物2.
18∣3小时后，将反应混合物倒入分液漏斗中，并添加100 ml乙酸乙酯。摇晃并分离各层，用水冲洗有机层三次（每次100 ml），用氯化钠盐水（100 ml）冲洗一次，摇晃并像之前一样分离。
19∣取有机层，用约10 g无水硫酸钠干燥10-15分钟，让溶液静置，偶尔搅拌，直到其完全半透明，固体硫酸钠在烧瓶中自由移动。通过有凹槽的滤纸对混合物进行重力过滤，并通过旋转蒸发去除溶剂。
20∣使用1:1己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱纯化（柱直径：5–8 cm；硅胶柱高度：25–40 cm），得到654 mg化合物1红色固体，总收率约39%。R（右）（f）复合1=0.33（己烷中50%乙酸乙酯）；静置5分钟后，在硅胶TLC板上显示为亮红色。
化合物的特性和纯度可以通过质子核磁共振波谱确定(1H NMR），碳NMR光谱(13C NMR）和质谱（MS）。
该产品可以在−20°C的暗处储存至少一周，但通常应尽快在下一步中使用。
Fmoc-哌嗪甲醛的合成（2）
24小时，加上净化
21∣将15 ml Schlenk管和磁力搅拌棒在130°C的电炉中干燥过夜。
22∣在N流量下冷却玻璃器皿2如步骤16所述。
23∣向Schlenk管中添加400 mg（0.64 mmol，1.0当量）化合物1，458 mg（1.28 mmol，2.0当量）N个-苯基双（三氟甲基磺酰胺）和340 mg（3.21 mmol，5.0当量）Na2一氧化碳三.
24∣用橡胶隔膜密封试管，并用针头和注射器添加8 ml无水DMF。
25∣在室温下N的气氛下搅拌反应混合物过夜（10–12小时）2，Schlenk管用铝箔覆盖以阻挡光线。
26∣将反应物倒入分液漏斗中，加入100毫升乙酸乙酯。摇晃并分离各层，用水冲洗有机层三次（每次冲洗100 ml），如前所述摇晃并分开。
27∣取有机层，用约10g硫酸钠干燥10-15分钟，用有凹槽的滤纸进行重力过滤，并通过旋转蒸发去除溶剂。
28∣使用1:1己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱纯化产品（柱直径：3–5 cm；硅胶柱高度：30–45 cm）。这将产生222 mg化合物2以46%产率呈白色固体。R（右）（f）复合2=0.69（己烷中50%乙酸乙酯）；静置5-10分钟后，产品斑点呈淡红色。可通过以下方法确定化合物的特性和纯度1核磁共振氢谱，13C核磁共振和质谱。
此时，固体可在−20°C的暗处储存至少3-6个月。
Fmoc-哌嗪羟硼酸盐的合成（3）
8-12小时，加上净化
29∣在130°C的电炉中干燥15 ml压力管和磁力搅拌棒过夜。
30∣带化合物2，钯（dppf）氯2·中国2氯2双（pinacolato）二硼酸盐、醋酸钾、无水甲苯和15 ml压力管，并将带o型环的特氟龙盖拧入惰性气体手套箱。或者，惰性气体手套袋应足以保持O2和H2后续步骤中的O。
31∣在手套箱中工作时，添加222 mg（0.29 mmol，1.0当量）化合物268 mg Pd（dppf）Cl2·中国2氯2（0.08 mmol，0.25当量），74 mg双（品那克拉托）二硼酸盐（0.29 mmol），1.0当量），82 mg（0.80 mmol，2.8当量）醋酸钾和10 ml无水甲苯至压力管。用盖子将管道密封，并将反应容器从手套箱中取出。
32∣在110°C的温度控制微波反应器中加热管子4小时。
33∣反应冷却到室温后，小心打开压力管，用50 ml二氯甲烷稀释反应，将所有内容物转移到100 ml的圆底烧瓶中，然后通过旋转蒸发去除溶剂。
34∣使用1:1己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱纯化产品（柱直径：1–3 cm；硅胶柱高度：20–30 cm）。这将产生151毫克化合物三以74%产率呈白色固体。R（右）（f）复合三=0.69（己烷中50%乙酸乙酯）；在运行TLC板后，产物斑点是无色的，但在硅胶TLC板上静置5分钟后变为亮红色。化合物的同一性和纯度可以通过1核磁共振氢谱，13C核磁共振和质谱。
此时，固体可在−20°C的暗处储存至少1-2个月。
MitoPY1（4）的合成
36–48小时，加上净化
35∣添加35 mg（48μmol，1.0当量）化合物三将反应物稀释至20ml闪烁瓶中，并用5ml 15%（vol/vol）哌啶溶液在乙腈中稀释反应物。用铝箔覆盖反应物，防止其受到光照。
36∣在室温下搅拌反应30分钟后，使用小瓶转接器通过旋转蒸发去除溶剂。
37∣移动装有干燥Fmoc-脱保护化合物的闪烁瓶三再加上盛装其他所需试剂和设备的容器——IBTP、碳酸氢钠、脱气无水乙腈和一个闪烁瓶，盖在惰性气体手套箱中。干燥试剂可以预先装入小瓶，但溶剂应单独添加在手套箱中。通常，我们将干燥部件存放在手套箱中，以确保它们保持干燥。
38∣向含有Fmoc-脱保护化合物的闪烁瓶中添加55 mg（96μmol，2.0当量）IBTP、30 mg（240μmol、5.0当量）碳酸氢钠、5 ml无水乙腈和搅拌棒三.用铝箔覆盖反应容器，并在室温下在惰性气体手套箱中搅拌。
我们发现，如果三苯基鏻暴露于大气中的氧和/或氢，则在该特定反应过程中容易降解2O、 这就是为什么我们试图保持反应为无氧和氢2尽可能无O型。只要注意防止氧气进入反应，也可以使用标准的无空气技术在Schlenk管或惰性气体手套袋中进行反应。 39∣24小时后，从手套箱中取出反应容器，通过槽式滤纸重力过滤混合物，并通过旋转蒸发除去溶剂。
40∣使用4.5:4.5:1二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱纯化产物（柱直径：1–3 cm；硅胶柱高度：20–30 cm）。这将导致35 mg MitoPY1以76%的产率作为浅粉红色固体。R（右）（f）复合4=0.59（4.5:4.5:1二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇）。由于硅胶上的硼酸盐脱保护作用，产品可能无法通过TLC轻易检测到，应使用液相色谱-质谱（LC-MS）等其他分析技术来确认产品的存在。化合物的特性和纯度可以通过以下方法确定1核磁共振氢谱，13C核磁共振、质谱和光谱测量().
5μM MitoPY1对H的荧光开启响应2O（运行）2.时间点表示添加100μM H后的0、5、15、30、45和60分钟2O（运行）2.在503 nm处激发。
色谱柱应尽快运行，因为硼酸盐基团在二氧化硅上停留太久时容易降解。
此时，固体可以在−20°C的黑暗中储存数月。我们建议将产品储存在装有干燥剂的拉链袋内的小瓶中。
干燥MitoPY1储备的制备
12-16小时
41∣制备5 mM的MitoPY1（MW 863 g mol−1，假设Cl−反离子）通过每ml甲醇溶剂溶解4.3 mg MitoPY1。或者，如果产物的产率太低，无法提供准确的质量测量，可以使用MitoPY1的摩尔消光系数（510 nm，ε=14200万−1厘米−1). 在这种情况下，可以通过将1μl储备溶液溶解到1 ml HEPES中并测量吸光度来检查MitoPY1储备溶液的浓度。然后可以根据这些测量值对存量进行校正，直到浓度准确为止。
42∣将溶液等分为20μl份，放入PCR试管中。
43∣将试管置于干燥器中，在弱真空下隔夜，避光，以去除试管中的溶剂。密封PCR管，并将其储存在带有干燥剂的拉链袋中，温度为−20°C。
MitoPY1干库存可在−20°C的黑暗条件下储存数月。
MitoPY1活性验证
2-6小时
44∣从冰箱中取出一小份干燥的MitoPY1，并将其加热至室温。用20μl二甲基亚砜稀释内容物，制成5 mM储备溶液。
一旦稀释，由于硼酸盐可能降解，应在当天使用MitoPY1溶液。
45∣通过向2 ml DPBS中添加2μl MitoPY1并混合内容物，在DPBS中制备2 ml 5μM MitoPY1储备液。将溶液分成两份单独的1毫升。
46∣制作100 mM H储备溶液2O（运行）2通过添加11μl 30%（wt/vol）H2O（运行）2转化为989μl的H2O.通过添加1μl 100 mM H，将步骤36中的一份MitoPY1溶液作为阳性对照2O（运行）2储备以获得100μM H的最终浓度2O（运行）2并添加1μl H2O表示另一部分为阴性对照。
47∣立即开始使用荧光计读取阳性和阴性对照样品的荧光强度，用503-nm的光对其进行激发，并根据仪器的能力收集发射光谱或在530nm处收集。或者，只要仪器的灵敏度足够，就可以使用平板读取器监测反应过程。H2O（运行）2-经处理的阳性对照样品的荧光强度应随时间增加()，而阴性对照应保持不变。
活细胞的MitoPY1标记
变量；30-90分钟
48∣从冰箱中取出一小份干燥的MitoPY1，并将其加热至室温。用20μl二甲基亚砜稀释内容物，制成5 mM储备溶液。
稀释后，应在当天使用MitoPY1溶液。
49∣通过向2 ml DPBS中添加4μl MitoPY1并混合，制备2 ml 10μM的MitoPY1溶液。
50∣从培养箱中取出24孔板细胞，并从两个孔中取出细胞生长培养基。向每个孔中添加1 ml 10μM MitoPY1 DPBS溶液，并将细胞板放回培养箱中。
线粒体特异性控制染料，如MitoTracker系列，可以与MitoPY1同时添加。我们普遍发现，25–100 nM的MitoTracker深红与MitoPY1最兼容，因为它相对于MitoPY1发生红移，并且在照射时不会产生大量的ROS。 51∣15–90分钟后，根据所用细胞类型的染料吸收速率，从培养箱中取出24孔板细胞。通过去除MitoPY1溶液并用1 ml新鲜、温暖的DPBS替换它来清洗井。重复一次DPBS清洗。
52∣一口井采用实验条件处理，另一口井采取控制条件处理。作为阳性对照，用100μM H刺激2O（运行）2应该执行。为此，制备100 mM H溶液2O（运行）2通过添加11μl 30%（wt/vol）H2O（运行）2转化为989μl的H2O.向一个孔中添加1μl该溶液和1μl H2O至控制井。将24孔板的细胞放回培养箱中。
53∣15–90分钟后，将细胞从培养箱中取出，并用1毫升温热的DPBS清洗两次（我们认为15分钟是观察强烈反应所需的最短时间，而90分钟是不含血清的培养基中细胞保存时间的保守上限，否则会影响结果）。将两个盖玻片转移到一个35毫米的培养皿中，培养皿中含有3毫升热的DPBS。
根据所测试的条件，可以相应地调整该协议。对于过夜治疗，只需在添加MitoPY1溶液之前清洗细胞。由于将比较对照细胞和受刺激细胞之间的荧光强度，因此对于直接比较而言至关重要的是，每次实验都要使用一个同时装载与受刺激细胞相同的MitoPY1原液的对照细胞载玻片。
MitoPY1标记细胞成像
变量；1–12小时
可以在中找到故障排除建议.
表2
| 步骤 | 问题 | 可能的原因 | 解决方案 |
|---|
| 34 | 反应失败 | O（运行）2和/或H2反应中的O | 确保反应在无空气条件下进行，并确保
试剂尽可能干燥 |
| 40 | 产品棒
到列 | 二氧化硅可以使频那醇失去保护
生成硼酸
具有亲水性且非常困难
离开柱子 | 尽快运行色谱柱，使溶剂始终流动
净化 |
| 47 | 产品确实如此
没有回应
H（H）2O（运行）2 | 最终制剂中的杂质 | MitoPY1的纯化需要在运行色谱柱之间取得平衡
速度足够快，以确保频那醇脱保护不会发生且速度较慢
足以净化可能的污染物，尤其是三苯基鏻
副产品，往往会在列中划出条纹 |
| 54 | 高荧光
中的背景
细胞 | 硼转化苯酚 | MitoPY1应储存在干燥、凉爽的条件下，以保持
硼酸盐。硼脱保护会产生荧光产物
从而增加实验的背景荧光
降低检测灵敏度。应注意获取MitoPY1
尽可能纯净 |
| 低荧光
的背景
细胞 | 去保护品那醇 | MitoPY1的硼酸形式的细胞渗透性较差，这导致
染料积累较少，检测灵敏度较低。股票
可以通过LC-MS检查MitoPY1的硼酸盐与硼酸盐的比率
酸，在最后的制备中主要是硼酸盐。
MitoPY1应在加入水溶液后立即应用于细胞
缓冲液，因为硼酸盐会慢慢转化为硼酸
H的存在2O（运行） |
掌握适当的前体，合成和纯化MitoPY1(4)预计需要7-10天。成像实验需要1-2天的培养细胞。
步骤1–20，合成芴甲氧羰基哌嗪视黄醇(1)：10-12小时，加上净化
步骤21–28，合成Fmoc-哌嗪羟三磷酸(2)：24小时，加上净化
步骤29-34，合成Fmoc-哌嗪羟硼酸盐(三)：8-12小时，加上净化
步骤35-40，合成MitoPY1(4)：36–48小时，加上净化
步骤41–43，准备干燥的MitoPY1储备：12–16小时
步骤44-47，验证MitoPY1活性：2-6小时
步骤48-53，活细胞的MitoPY1标记：可变；30-90分钟
步骤54，MitoPY1标记细胞成像：可变；1–12小时
预期结果
用MitoPY1检测线粒体H2O（运行）2
MitoPY1具有类似于YFP的光谱特性。具体而言，在pH值为7的20 mM HEPES中，MitoPY1具有两个主要的可见区域吸收(λ防抱死制动系统=489纳米，ε=14300万−1厘米−1; 510纳米，ε=14200万−1厘米−1)和微弱的发射(λ相对长度单位=540 nm，⌀=0.019）。MitoPY1与H的反应2O（运行）2通过转化为MitoPY1ox触发荧光增强()在510 nm处具有一个主吸收带(ε=22300万−1厘米−1)和增强的排放(λ相对长度单位=528 nm，⌀=0.405）。MitoPY1选择性检测H2O（运行）2一系列其他潜在竞争活性氧，包括超氧物、一氧化氮、次氯酸盐和羟基自由基。
显示了MitoPY1检测H氧化应力水平的能力2O（运行）2在活HeLa细胞的线粒体中。
线粒体H成像2O（运行）2在含有MitoPY1的活细胞中。将10μM MitoPY1在37°C的DPBS中加载HeLa细胞45分钟。然后将培养基换成含有25 nM Mitotracker Deep Red和1μM Hoechst的新鲜DPBS。添加H后2O（对照）或100μM H2O（运行）2，将细胞在37°C下培养60分钟。(一–d日)然后用MitoPY1对对照细胞成像(一)，Mitotracker深红色(b条)、覆盖MitoPY1（绿色）、Mitotracker深红色（红色）和Hoechst（蓝色）(c（c）)或亮场和赫斯特（蓝色）叠加(d日). 比例尺，40μm。(e（电子）–小时)H（H）2O（运行）2-处理后的细胞用MitoPY1成像(e（电子）)，Mitotracker深红色(（f）)、覆盖MitoPY1（绿色）、Mitotracker深红色（红色）和Hoechst（蓝色）(克)或亮场和赫斯特（蓝色）叠加(小时). 比例尺，40μm。(我–我)H区域2O（运行）2-处理过的细胞表示为e（电子）放大，显示MitoPY1(我)，Mitotracker深红色(j个)、覆盖MitoPY1（绿色）、Mitotracker深红色（红色）和Hoechst（蓝色）(k个)或亮场和赫斯特（蓝色）的叠加(我). 比例尺，10μm。
分析数据
Fmoc-哌嗪奈洛多（1）
收率：39%，红色固体。1核磁共振氢谱（CDCl三，400兆赫）：δ7.99（1H，d，J型=7.6赫兹），7.74（2H，d，J型=7.6赫兹），7.57–7.66（2H，m），7.55（2 H，d，J型=7.6赫兹），7.37（2H，t，J型=7.2赫兹），7.29（2H，t，J型=7.2赫兹），7.14（1H，d，J型=7.6赫兹），6.71（1H，d，J型=2.0赫兹），6.65（1H，dJ型=2.0赫兹），6.49–6.63（4小时，米），4.47（2小时，天，J型=6.4Hz）、4.22（1H，J型=6.4赫兹），3.55（4H，bs），3.14（4H、bs）。13C核磁共振（CDCl三，100 MHz）：δ170.03、159.59、155.23、152.82、152.65、152.58、152.41、143.76、141.29、134.92、129.63、129.15、128.81、127.73、127.07、127.00、125.06、124.82、124.18、129.97、112.59、112.18、110.35、109.87、102.82、102.33、67.37、47.99、47.25、43.20（宽倍数）。HR-FABMS：为[M计算+]623.2171，发现623.2182。
Fmoc-哌嗪甲醛（2）
收率：46%，白色固体。1核磁共振氢谱（CDCl三，400兆赫）：δ8.04（1H，d，J型=7.2赫兹），7.76（2H，d，J型=7.6赫兹），7.69（1H，dt，J型=1.2，7.6赫兹），7.64（1H，dt，J型=7.6，1.2赫兹），7.57（2H，d，J型=7.2赫兹），7.38（2H，t，J型=7.2赫兹），7.30（2H，dt，J型=1.2，7.2赫兹），7.23（1H，d，J型=2.4赫兹），7.16（1H，d，J型=7.2赫兹），6.94（1H，dd，J型=2.4，8.8赫兹），6.88（1H，d，J型=8.8赫兹），6.70（1H，d，J型=2.0赫兹），6.66（1H，d，J型=8.8赫兹），6.61（1H，dd，J型=2.0，8.8赫兹），4.48（2H，d，J型=2.4赫兹），4.23（1H，t，J型=2.4赫兹），3.56（4H，bs），3.16（4H，bs）。13C核磁共振（CDCl三，100兆赫）：δ169.18、155.09、152.77、152.49、152.18、151.85、149.93、143.83、141.31、135.37、130.14、130.06、128.73、127.73、124.07、126.36、125.23、124.86、123.87、119.98、119.86、116.52、112.78、110.42、108.77、102.23、81.96、67.29、47.87、47.30、43.33（宽倍数）。HR-FABMS：针对[MNa计算+]777.1494，发现777.1501。
Fmoc-哌嗪羟羟硼酸盐（3）
收率：74%，白色固体。1核磁共振氢谱（CDCl三，400兆赫）：δ8.02（1H，d，J型=6.4赫兹），7.77（3H，t，J型=7.6赫兹），7.56–7.68（4小时，米），7.37–7.45（3小时，米，J型=8.0Hz）、7.22（1H，J型=6.8赫兹），6.81（1H，d，J型=8.0赫兹），6.69（2H，d，J型=7.6赫兹），6.59（1H，dd，J型=2.4，8.8赫兹），4.50（2H，d，J型=6.8赫兹），4.26（1H，t，J型=6.4赫兹）、3.60（4H，bs）、3.16（4H、bs）、1.35（12H，s）。13C核磁共振（CDCl三，100兆赫）：δ169.65、155.09、153.44、152.69、152.31、150.84、143.88、141.34、153.09、129.70、129.27、128.73、128.04、127.75、127.25、127.09、126.37、125.07、124.90、123.82、123.44、121.60、120.01、112.27、109.47、102.60、84.20、82.85、67.29、48.13、47.34、24.86（未观察到硼酸盐附着碳的信号）。HR-FABMS：针对[MNa计算+]733.3082，发现733.3085。
MitoPY1（4）
产量：76%，淡粉红色固体。1核磁共振氢谱（CDCl三/10%CD三外径，300 MHz）：δ7.96（1H，d，J型=7.2赫兹），7.76-7.83（3小时，米），7.55-7.75（15小时，米，J型=8.0，1.2赫兹），7.09（1H，d，J型=7.2赫兹），7.71（1H，d，J型=7.6赫兹），6.67（1H，d，J型=3.2赫兹），6.60（1H，d，J型=8.8赫兹），6.56（1H，dd，J型=2.0，8.8赫兹），3.36-3.47（2H，米），3.23-3.29（4H，米。13C核磁共振（CDCl三/10%CD三外径，125 MHz）：δ170.08、153.13、152.27、150.08、135.30、135.28、133.55、133.47、130.64、130.54、129.81、129.17、128.64、127.09、126.16、124.97、123.85、123.36、121.31、118.00、117.32、84.23、83.36、74.96、56.25、52.33、49.95、24.61、20.07（耦合至31P未被解析）。31P核磁共振（CDCl三/10%CD三外径，162 MHz）：δ23.80. HR-FABMS：为[M计算+]827.3781，发现827.3780。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）（GM 79465）的支持。C.J.C.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。B.C.D.是简·科芬儿童医学研究纪念基金会（Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research）的研究员。V.S.L.认可安进获得研究生奖学金。
工具书类
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