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单元格代表。作者手稿；PMC 2014年7月14日发布。
以最终编辑形式发布为：
Cell Rep.2014年2月27日；6(4): 633–645.
2014年2月13日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.celrep.2014.01.027
预防性维修识别码：PMC4096300型
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院587225
PMID：24529706

SRC-2是协调代谢和昼夜节律的重要辅活化因子

埃林·斯塔西,1 雷纳·B·兰兹,1 毛建强,1 乔治·迈克利迪斯,1,2 朱博凯,1 妮科尔·凯特纳,1 纳吉雷迪·普特鲁里,1 埃林·雷内克,1 卢卡斯·雷内克,三 Subhamoy Dasgupta公司,1 亚当·迪安,1 康纳·R·史蒂文森,4 纳塔拉詹·西瓦苏布拉曼尼亚,1 阿伦·斯里库马尔,1 弗朗西斯科·德梅奥,1 布莱恩·约克,1 Loning Fu公司,1和伯特·奥马利1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

总结

哺乳动物生物钟的同步性是通过以BMAL1:clock异二聚体为中心的复杂转录和翻译反馈回路实现的。昼夜反馈回路的调节对于维持节律性至关重要，然而转录辅激活子在驱动BMAL1:CLOCK转录网络中的作用在很大程度上尚未探索。在这里，我们显示了昼夜肝类固醇受体辅激活子2（SRC-2）在光照期与BMAL1池蛋白广泛重叠的基因组中的募集，靶向为昼夜节律和代谢过程富集的基因。值得注意的是，SRC-2消融损伤了轮转行为，改变了几个外周组织中的昼夜基因表达，改变了肝代谢组的节律性，并解除了细胞自主代谢物的同步性。我们确定SRC-2是BMAL1:CLOCK的一个强有力的协调剂，并发现SRC-2在前馈回路中以BMAL1:CLOCK为靶点。总的来说，我们的数据表明SRC-2是BMAL1:时钟振荡器的转录辅激活子，并将SRC-2确立为哺乳动物昼夜钟的关键正调控因子。

简介

大多数生理系统都有以昼间光照和进食周期为中心的内在节律。位于下丘脑视交叉上核（SCN）内的中央哺乳动物起搏器与周围组织协调这种节律性，使全身生理同步。虽然SCN可以产生内源性昼夜节律，但外源性环境线索，如光和温度，有助于保持生理学与环境变化的精确同步。昼间循环的中断与心血管疾病、癌症和一些代谢紊乱的风险增加有关(Bass和Takahashi，2010年;Takahashi等人，2008年). 从分子上讲，基因的核心网络负责由基本螺旋环螺旋（bHLH）转录因子脑和肌肉ARNT-Like 1（BMAL1，ARNTL）和昼夜运动输出周期Kaput（CLOCK）的异源二聚体化引起的昼夜节律振荡。总之，这些转录因子通过转录和翻译反馈环的共同机制驱动昼夜基因表达(Asher和Schibler，2011年). 自我调节反馈环由BMAL1:CLOCK结合到启动子区的E盒元件形成期间(每1/2)以及隐色素(哭1/2)，其产物随后抑制BMAL1:CLOCK活性。另一个涉及核受体（NRs）的辅助反馈回路由BMAL1形成：控制维甲酸受体相关孤儿受体（ROR）表达的时钟，Rev-erb公司α（编号1d1）、和Rev-erb公司β（1d2个）表达式。ROR激活Bmal1型转录和Rev-erbα/β蛋白随后抑制Bmal1型(明石和Takumi，2005年;Asher和Schibler，2011年;Bugge等人，2012年;Cho等人，2012年;Preitner等人，2002年;Sato等人，2004年;Ueda等人，2002年). 总之，这些反馈回路被认为足以控制基因表达，以维持大多数生物过程的日常节奏。

外周组织（如肝脏）中的振荡器也具有由中央时钟协调的内源性循环，但可以通过其他线索（如类固醇激素和营养物质的可用性）以组织特定的方式进行调节。外周组织的昼夜节律与新陈代谢密切相关，因为外周时钟同步性可以通过新陈代谢线索改变，并且已知扰动会导致整体能量稳态、葡萄糖调节、脂肪酸代谢和进食行为的破坏(Asher和Schibler，2011年;Bass和Takahashi，2010年). 具体而言，核心时钟成分BMAL1的破坏会损害葡萄糖稳态，增加胰岛素敏感性，并降低20周后的全身肥胖(Hatanaka等人，2010年;Kondratov等人，2006年;Rudic等人，2004年). 同样，BMAL1异二聚体伴侣CLOCK的破坏也会导致糖耐量受损、CLOCK突变型肥胖增加、肝脂肪变性和肝代谢组的广泛破坏(Eckel-Mahan等人，2012年;Fustin等人，2012年;Marcheva等人，2010年;Rudic等人，2004年). 结合BMAL1和CLOCK靶点的肝脏全基因组定位，这些观察结果表明，初级昼夜转录因子在肝脏代谢调控中起着重要作用(Hatanaka等人，2010年;Kondratov等人，2006年;Rudic等人，2004年). 正如核心转录时钟成分可以调节代谢一样，许多肝脏代谢转录因子，如NRs ERR、PPARα、Rev-erbα/β和ROR，也被确定为时钟靶点的转录介质(明石和Takumi，2005年;Asher和Schibler，2011年;Bugge等人，2012年;Cho等人，2012年;Preitner等人，2002年;Sato等人，2004年;Ueda等人，2002年).

昼夜节律和代谢转录调控之间的类似串扰通过转录协同调节器的活性进行协调。NRs和其他转录因子利用协同调节器动态调节基因转录。一般来说，转录因子活性的调节是通过辅抑制因子沉默和辅激活因子增强基因表达来实现的。因此，协调剂对靶基因表达具有广泛的影响。例如，除了它们作为BMAL1:CLOCK的昼夜节律辅压因子的已知作用外，Per2和Cry1也被报道分别作为NRs Rev-erbα和GR的辅压因子，以促进时间细胞活动(Lamia等人，2011年;Schmutz等人，2010年). NRs的Per2和Cry1抑制通过其LXXLL基序与NRs的相互作用实现(Lamia等人，2011年;Schmutz等人，2010年). LXXLL基序在NR协同调节因子中很常见，包括类固醇受体辅激活因子（SRC）的p160家族。与许多其他协同调节剂一样，SRC的丢失具有深刻而多样的生理影响，从通过改变细胞周期控制增加致瘤潜能到通过破坏关键代谢过程改变能量稳态。具体而言，我们的实验室已确定类固醇受体辅活化因子-2（SRC-2、NCOA2、GRIP1）是肝脏代谢的必要调节剂(Chopra等人，2008年,2011). SRC-2通过调节空腹条件下的葡萄糖释放，成为机体能量稳态的关键介质(Chopra等人，2008年). SRC-2缺失也与胰岛素敏感性增加有关(Picard等人，2002年)和减少肥胖(Hartig等人，2011年). 此外，SRC-2的活性也被AMP-activated protein kinase（AMPK）直接调节，AMPK是一个关键的代谢变阻器，也是昼夜节律的重要传感器(Lamia等人，2009年;Um等人，2011年). AMPK激活SRC-2作为胆汁酸分泌的辅激活剂，胆汁酸是肠道吸收脂肪所必需的(Chopra等人，2011年).

鉴于SRC-2的广泛代谢影响，我们试图了解SRC-2对肝池和代谢组先前未知的暂时代谢影响。有越来越多的证据表明代谢和昼夜节律是相互关联的过程，并且已有关于辅激活物对不同过程和组织中转录因子的影响的知识，我们通过在昼夜循环的两个时间点对肝脏中SRC-2的顺反流分析来研究SRC-2在时间上的作用。在本文中，我们证明了SRC-2在昼夜节律周期的光阶段表现出优先结合。此外，我们发现SRC-2号机组表达是有节奏的，这与它的脑池占有率相一致。转轮实验还表明，SRC-2的缺失严重改变了昼夜行为节律。在进一步探索SRC-2对基因表达的时间效应时，我们发现SRC-2的缺失不仅破坏了一盒代谢基因，还破坏了几个组织中时钟的核心成分，包括肝脏、棕色脂肪组织（BAT）、白色脂肪组织（WAT）、心脏和骨骼肌。同样，SRC-2的丢失会破坏肝脏和细胞自主代谢产物的节律性。综上所述，这些研究结果表明，SRC-2是肝脏中BMAL1:CLOCK的转录辅激活子，它将代谢基因表达与肝外周时钟的适当维持结合在一起。

结果

SRC-2对肝细胞的差异性补充

为了更好地理解SRC-2在协调能量平衡中的时间功能，我们利用染色质免疫沉淀和深度测序（ChIP-seq）分析了SRC-2的肝脏染色质在小鼠昼夜周期的两个阶段的占有率，即光期的zeitgeber时间4（ZT4）和暗期的ZT18。我们发现，与ZT18（14376）相比，ZT4（22638）处SRC-2的总结合位点增加，但两个ZT之间存在广泛重叠（约78%的ZT18）(图1A). 对常见结合位点的分析表明，SRC-2在ZT4处的结合比在ZT18处更强，如SRC-2峰值强度的增加所示(图1Bi)以及平均峰值数量的增加(图1Bii). 根据SRC-2在直接控制基因表达中的作用，ZT4和ZT18处的SRC-2结合位点在转录起始位点（TSS）周围的基因最大区高度富集（图S1A-S1D）。此外，与已发表的SRC-2在调节肝脏代谢中的作用一致(Chopra等人，2008年,2011)，与推定的SRC-2靶基因相关的功能过程通常聚集在主要的代谢过程周围。特别是，ZT4在PPAR信号通路、脂肪酸代谢和泛素介导的蛋白水解方面比ZT18丰富(图1C，红色条）。来自ZT18的SRC-2结合位点的基因被富集用于不同的代谢过程，包括异种生物、药物和谷胱甘肽代谢，表明SRC-2在昼夜循环中具有不同的作用(图1C，蓝色条）。根据先前报道的SRC-2在初级胆汁酸合成中的作用，从SRC-2结合位点调用的ZT4和ZT18基因同样丰富(Chopra等人，2011年)以及昼夜节律。对SRC-2在ZT4和ZT18结合所共享的代谢靶点的选择位点的分析表明，先前报告的SRC-2靶点在ZT4TSS附近的结合增加(埃洛夫l6和Fasn基因) (Jeong等人，2006年)以及新增SRC-2目标（包括NR）的ZT4峰值增加(0b2个和Shp公司)和代谢目标(Ugp2型和Cyp7a1细胞)和昼夜节律目标(每1个)（图S1E）。有趣的是，我们还发现SRC-2针对其自身基因座(Ncoa2/SRC-2)（图S1E）。对ZT4和ZT18处SRC-2结合位点的DNA序列分析显示NR结合基序（HNF4α、PPARα、RAR和NR5a2）的预期丰度，SRC-2的结合位点也丰度为E盒基序，该基序已知能结合碱性螺旋环螺旋蛋白，如BMAL1和CLOCK(图1D).

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小鼠肝脏SRC-2在ZT4和ZT18的回肠分析

（A） 比较ZT4和ZT18小鼠肝脏SRC-2 ChIP-seq间隔的维恩图。

（B） 以对数形式绘制的重叠结合位点的峰值强度2SRC-2（ZT4）在SRC-2上（ZT18）相对于ChIP峰值数量（i）和条形图形式（ii）***p＜0.001。数据以平均值±SEM的形式绘制。

（C） 选择SRC-2 ZT4和ZT18靶点的丰富注释进行DAVID基因功能比较分析。

（D） ZT4/ZT18SRC-2结合区共有的顶部富集的SeqPos基序，按转录因子的DNA结合结构域分组。

（E） hd-qPCR表达SRC-2号机组在光照和暗期，携带WT雄性小鼠（各5只）的WAT、BAT、心脏、骨骼肌和肝脏中。数据以平均值±SEM的形式绘制。*p<0.05。

（F） 在ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22对夹带WT小鼠肝脏SRC-2进行代表性免疫印迹。

（G） SRC-2 24小时昼夜节律募集到埃斯拉通过ChIP-qPCR检测肝组织中相对于ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22输入的启动子。

（H） SRC-2 24小时昼夜补充的验证埃斯拉通过ChIP-qPCR检测肝组织中相对于CT4、CT10、CT16和CT22输入的启动子。

考虑到许多NR表现出时间节律，并且ZT4的池蛋白SRC-2的占用大约是ZT18的两倍多，我们探索了SRC-2号机组在几个关键代谢组织（即肝脏、BAT、WAT、心脏、骨骼肌和SCN；图S1F）中使用高密度定量PCR（hdqPCR）。我们确定了时间上的组织特异性差异SRC-2号机组表达，但通常SRC-2号机组与暗相相比，在光相表达更高(图1E). 特别是在肝脏，SRC-2号机组与ZT18相比，ZT2的表达明显更高，这与光照期SRC-2池占用率增加一致(图1A、1E和S1F），这与肝脏SRC-2蛋白的循环一致。我们观察到SRC-2在ZT2的光相表达最高，而在ZT18的暗相表达降低了约4倍(图1F). 为了继续探索SRC-2在时间背景下对靶点的调控，我们在肝脏中对SRC-2进行了24小时的ChIP-qPCR，发现SRC-2以时间方式与特定启动子区域结合，如图所示埃斯拉在两个ZT中超过24小时(图1G)和昼夜节律时间（CT；图1H)条件（图S1G）。

SRC-2和BMAL1 Cistromes广泛重叠

我们继续探索SRC-2在昼间代谢转录中的作用，基于ChIP-seq数据、SRC-2的ChIP-qPCR和SRC-2光相表达结果的一致性，重点研究SRC-2对光相的作用。我们探索了ZT4处SRC-2基因组占据率与已知在光照期表现出有节奏的基因组募集和峰值活性的转录因子之间的可能关系。SRC-2顺反子的基序分析结果(图1D)引导我们研究E盒结合BMAL1:CLOCK（BMAL1:NPAS2）转录异二聚体。异二聚体任何一种成分的缺失都会导致代谢紊乱，类似于在SRC-2号机组烧蚀，烧蚀(Chopra等人，2008年,2011). 由于BMAL1是CLOCK和NPAS2的非冗余异二聚体伴侣，我们将SRC-2 ChIP-seq数据与公布的CT4小鼠BMAL1肝池蛋白重叠(Koike等人，2012年;Rey等人，2011年)，并发现SRC-2（ZT4）和BMAL1池的广泛收敛。对这些潜在靶点的分析表明，约68%具有BMAL1结合位点的基因在基因启动子区域内至少包含一个SRC-2结合位点(图2A). Motif分析表明SRC-2（ZT4）和BMAL1的重叠峰主要富集于E盒，许多SRC-2结合位点与已知昼夜基因的BMAL1位点重叠(每1/2/3,哭泣2,12月1/2日,数据库管理员,12月1/2日,陀螺2,烟酰胺磷酸核糖基转移酶,特夫,埃斯拉,PPARα,波尔、和Rev-erbα/β) (图2B和S2A），表明SRC-2可能是BMAL1:CLOCK异二聚体的转录协同调节剂。不足为奇的是，与BMAL1和SRC-2共享基因相关的功能过程在昼夜节律和其他已知的BMAL1代谢功能方面高度丰富，包括糖酵解/糖异生、丙酮酸和脂肪酸代谢以及胰岛素信号(Dufour等人，2011年;Hatanaka等人，2010年;Rey等人，2011年;图2C).

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肝基因组SRC-2占有率分析显示昼夜节律靶点丰富

（A） 维恩图表示具有SRC-2（ZT4）和BMAL1（CT4）的独特重叠基因(Koike等人，2012年)通过ChIP-seq分析延伸基因启动子区域（EPR）内的结合位点。

（B） 在数据集的SRC-2/BMAL1重叠部分发现的昼夜节律基因和E盒序列基序。

（C） 具有共享BMAL1和SRC-2结合位点的靶点的基因功能分析。

（D） SRC-2和BMAL1 24小时昼夜补充情况每1个通过ChIP-qPCR检测肝组织中相对于输入的启动子。

（E） 招募SRC-2加入每1个WT和Bmal1型−/−ZT6和ZT18小鼠。

（F） BMAL1招募至每1个WT和SRC-2号机组−/−ZT6和ZT18的小鼠。

（G） 共同转染的SRC-2、BMAL1、CLOCK和Cry1表达结构在每1个-HepG2细胞中驱动荧光素酶基因的启动子。Cry1表达被用作对照，以证明转录抑制。

（H） 上的事务激活分析每1个-荧光素酶启动子与SRC-2和siBMAL1。

（一） 上的事务激活分析每1个-荧光素酶启动子与BMAL1和siSRC-2。

（J） WT小鼠肝脏中BMAL1与SRC-2在ZT6的共免疫沉淀。

为了验证SRC-2在选定的昼夜节律靶基因中的时间池占有率以及SRC-2与BMAL1可能的共现性，我们在24小时内对小鼠肝脏进行了ChIP每1个启动子出现在ZT6，此时BMAL1的富集也达到最高(图2D和S2B）。接下来，我们调查了SRC-2招募是否每1个启动子依赖于BMAL1。在Bmal1型−/−我们发现，与野生型（WT）小鼠相比，ZT6小鼠的SRC-2招募实际上减少了，这表明BMAL1是SRC-2富集所必需的(图2E). 然而，我们发现BMAL1招募与SRC-2在每1个ZT6和ZT18的启动子SRC-2号机组−/−老鼠(图2F). 有趣的是，肝脏BMAL1和SRC-2 ChIP实验显示SRC-2号机组启动子（图S2C-S2E）。再次，我们发现Bmal1型SRC-2向其自身启动子的募集受损，但在SRC-2型−/−肝脏（图S2C-S2E）。总的来说，我们的ChIP-qPCR结果表明SRC-2和BMAL1蛋白可以共同占据昼夜节律靶点，每1个，以及SRC-2号机组发起人。

然后我们瞬时转染培养细胞以测试SRC-2对BMAL1的调节：CLOCK介导的转录每个1和SRC-2号机组启动子，并发现SRC-2的过度表达增强了BMAL1:CLOCK活性(图2G和S2F）。为了确定SRC-2转录共激活是否依赖于BMAL1:CLOCK异二聚体，我们使用小干扰RNA（siRNA）来耗尽Bmal1型。我们发现SRC-2与每1个和SRC-2号机组与控制水平相比，启动子受损(图2HS2G和S2H）。同样，siRNA缺失SRC-2号机组单独损害两个每1个和SRC-2号机组发起人(图2I、S2I和S2J）。鉴于SRC-2能够对BMAL1:CLOCK异源二聚体进行反式作用，并且它们的肝池收敛，我们研究了肝脏中SRC-2和BMAL1:CLOCK之间可能的内源性相互作用。我们发现内源性肝脏SRC-2免疫沉淀与ZT6处的BMAL1对应于SRC-2蛋白的峰值表达(图2J). 我们总结了细胞培养中的这些结果，内源性SRC-2与BMAL1和CLOCK共免疫沉淀（图S2K）。我们使用体外下拉来确定SRC-2是否可以直接与BMAL1相互作用，并发现含有LXXLL氨基酸基序（730–1121）的SRC-2区域是BMAL1结合所必需的（图S2L），这表明SRC-2可能与BMALl的界面类似于其与其他NR的交互作用(Li等人，2004年;Ye等人，2011年). 总的来说，这些数据表明SRC-2可以直接与BMAL1和CLOCK相互作用，并充当BMAL1:CLOCK异二聚体的转录辅激活剂。这些事件可能由与BMAL1:CLOCK异二聚体的暂时相互作用驱动。

SRC-2调节昼夜行为

我们随后检查了基因的影响SRC-2号机组通过分析WT和SRC-2号机组−/−小鼠在12小时光照/12小时暗照（24小时L/D）周期和恒定黑暗（24小时D/D周期）中。我们发现，在L/D夹带条件下，SRC-2的丢失显著改变了昼夜运动行为(图3A). 观察到的表型谱SRC-2号机组−/−L/D周期中的小鼠表现为轻度阶段的跑步活动所表现的阶段性高级行为(SRC-2号机组−/−,图3A，左侧面板）以完成心律失常行为(SRC-2号机组−/−,图3A，右侧面板）。突变小鼠的异常行为模式持续存在于缺乏环境光信号的情况下（24小时D/D周期）。L/D循环期间量化的运动活性表明SRC-2号机组−/−小鼠表现出双峰运行模式，第一次活动的小峰值出现在光照期的后期，第二次活动的大峰值出现在暗相(图3B). 有趣的是，主要活动峰值的幅度在SRC-2号机组−/−老鼠(图3C). 因此，与90%以上活动发生在黑暗期的WT小鼠不同SRC-2号机组−/−小鼠处于分散状态，40%处于光相，只有60%处于暗相(图3C). 尽管SRC-2号机组消融对突变群体的平均周期长度没有显著影响，如WT和SRC-2号机组−/−小鼠，它在个体内产生了相当大的周期长度日变化SRC-2号机组−/−老鼠(图3D和S3A–S3C）。综上所述，上述观察结果表明SRC-2号机组扰乱中央时钟，从而改变L/D活动幅度。

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SRC-2的消融破坏中枢时钟节律

（A） 男性WT和SRC-2号机组−/−（n=6）同窝小鼠在L/D和D/D条件下的运动活动。

（B） WT和SRC-2型−/−（n=6）小鼠L/D。

（C） 时间百分比WT和SRC-2型−/−（n=6）小鼠在12小时光照期和12小时黑暗期跑步。

（D） WT和SRC-2号机组−/−D/D条件下的小鼠。

（E） 根据华盛顿哥伦比亚仪器综合实验室动物监测系统（CLAMS）和SRC-2型−/−（n=9–10）只小鼠。数据以平均值±SEM表示。*p<0.05，**p<0.01，与WT小鼠相比。

昼夜节律时钟的改变被认为可以促进几种代谢病理生理学。利用发现的昼夜节律缺陷SRC-2号机组−/−我们研究了小鼠的日摄食行为。根据公布的数据(Chopra等人，2008年)，我们发现WT和SRC-2号机组−/−24小时以上的小鼠（数据未显示）。然而SRC-2号机组−/−小鼠比WT小鼠提前大约85分钟移动，反映了动作图中的阶段性高级行为(图3E). 和其他组织一样，我们发现SRC-2号机组SCN中的表达，峰值表达与肝脏中的表达一致（图S1F和S4A）。为了消除外部光信号的影响，我们检测了自由运行条件下（D/D）的昼夜节律基因表达，发现核心昼夜节制基因表达存在显著差异(Bmal1型,每1个、和哭泣1）主要位于SRC-2的CT22和CT4−/−小鼠（图S3D）。这些结果表明，SRC-2在SCN内起作用，有助于维持中央时钟振荡。

总之，我们的数据表明SRC-2号机组在运动活动和可能的进食行为中导致阶段性进展表型，并表明SRC-2在协调昼夜节律和代谢方面的更复杂的相互作用。

SRC-2调节外围时钟节奏

主时钟和外周时钟之间的相互作用对于维持血压、新陈代谢、消化和内分泌信号等过程是必要的(莫霍克等人，2012年;Ptitsyn等人，2006年). 观察到的强烈行为缺陷SRC-2型运动轮的消融使我们研究了SRC-2在几个外周时钟中的作用。

我们使用hd-qPCR检测SRC-2号机组肝脏、心脏、骨骼肌、BAT和WAT的消融。我们分析了ChIP-seq数据集中专为共享SRC-2和BMAL1结合位点而选择的48个基因，重点是核心昼夜节律基因、参与协调代谢盒的NR和几个代谢靶点（表S1）。SRC-2型缺失显著改变了所有外周时钟的时间表达模式，但以组织特异性的方式(图4A). 我们观察到肝脏中的基因变化最多，主要在ZT2和ZT22发现改变的基因。在肝脏内，WT和SRC-2号机组−/−在许多昼夜节律基因中发现了小鼠，包括Bmal1型,时钟,每1/2,Npas2型、和哭泣1以及时钟稳定基因波尔,12月1日、和折旧摊销前利润(图4B). 我们还发现编码NRs的基因发生了变化(Shp公司[0b2个],埃斯拉,Rev-erbβ、和Hnf4a型;图4C)和几个代谢目标(陀螺2,埃洛夫l6,利达、和传真2) (图4D). 我们还研究了SRC-2缺失对WT和SRC-2肝脏特异性敲除小鼠（LKO）昼夜节律基因表达的影响，发现SRC-2仅在肝脏中缺失，SCN完整，但仍存在异常的昼夜循环（图S4A）。与肝脏最相似的是BAT，其中ZT2-ZT6和ZT18-ZT22的基因发生了更多的变化，昼夜节律基因也发生了变化(波尔,每1个、和哭泣2)和几个代谢基因(数据网关2和Pnpla2型; 图S4B）。一般来说，所分析的所有组织都显示昼夜节律振荡器的时间表达发生了变化。与肝脏ChIP-seq揭示的代谢过程类似，我们发现WAT、心脏和骨骼肌也显示出参与葡萄糖代谢的基因的变化(预测值k4和预测值k1)，脂质合成(传真2,埃洛夫l6、和Dgat2型)和丙酮酸代谢(预测值k4和预测值k1; 图S4B–S4E）。总的来说，与其他组织相比，骨骼肌和心脏的变化最小，有趣的是，尽管心脏和骨骼肌具有相似的代谢目标，但我们发现这些组织的变化发生在不同的阶段（骨骼肌中的ZT6和心脏中的ZT18；图4A).

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SRC-2缺失导致肝脏外周生物钟基因表达异常

（A） 使用hd-qPCR阵列对核心代谢组织中不同ZT处观察到的基因变化进行图形化汇总表示。

（B） hd-qPCR分析携带WT和WT的肝脏中的时间节律基因表达SRC-2号机组−/−（n=3-5）只小鼠。

（C） NR基因表达的hd-qPCR分析。

（D） 代谢基因的hd-qPCR分析。每个分析基因的最大值均归一化为1。

（E） WT和ZT18中ZT2、ZT10和ZT18NEFAs、甘油三酯和胆固醇的血浆分析SRC-2号机组−/−（n=3-5）只小鼠。数据以平均值±SEM表示。与WT小鼠相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

由于我们确定的许多SRC-2靶点都报告了代谢功能，我们接下来研究了是否消融SRC-2号机组可能影响循环血浆代谢物的振荡。基于比色法的分析显示，ZT10在SRC-2号机组−/−小鼠血浆中非酯化脂肪酸（NEFA）含量显著增加SRC-2号机组−/−ZT18时的甘油三酯，胆固醇浓度在SRC-2号机组−/−和WT小鼠(图4E). 血浆代谢物的昼夜循环改变可能是SRC-2靶向代谢基因的时间破坏的结果，正如我们通过hd-qPCR所表明的那样。

SRC-2消融改变肝脏代谢产物

随后，我们回去研究WT和SRC-2型−/−老鼠。我们的实验室之前已经确定，SRC-2的丢失会对喂食和禁食小鼠的代谢产物产生全身影响，但令人惊讶的是，在SRC-2号机组−/−肝脏(York等人，2013年). 最近的数据表明，除了转录组中观察到的节律性外，代谢组还受到昼夜节律调节，如肝脏特异性Bmal1型−/−鼠标和时钟−/−鼠标(Eckel-Mahan等人，2012年;Fustin等人，2012年). 因此，我们分析了WT和SRC-2号机组−/−小鼠在脂质/脂肪酸途径、糖酵解/糖异生、三羧酸循环（TCA）循环中的能量代谢和核苷酸合成中的代谢产物。我们再次观察到SRC-2号机组−/−小鼠表现出对循环代谢物放松调节的时间效应(图5A、S5A和S5B）。大多数观察到的变化发生在ZT2和ZT10，这与我们最初的ChIP-seq和基因表达研究一致。更具体地说，我们观察到的代谢物变化在与碳代谢和糖酵解/糖异生相关的过程中富集(图5B). 这些发现支持了与SRC-2和BMAL1顺反池重叠预测的过程相关的功能(图2B). 此外，对糖酵解/糖异生和TCA循环中的选定代谢物（包括葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸/果糖-6-磷酸（G6P/F6P）、酮戊二酸和丙酮酸）的分析表明，SRC-2的缺失以时间依赖的方式改变了肝脏代谢物的流量(图5C).

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SRC-2缺失会干扰肝代谢组的节律性

（A） WT和SRC-2号机组−/−小鼠在ZT10。

（B） ZT10改变的重要代谢物的功能分析。

（C） WT和SRC-2号机组−/−ZT2、ZT10和ZT18组小鼠（n=3-5）。数据以平均值±SEM的形式绘制。*与WT小鼠相比，p<0.05。

SRC-2代谢节律的调节是细胞自主的

我们通过使用细胞自主系统来消除任何相关的组织特异性内源性昼夜节律影响，将系统调节与细胞自主代谢调节以及SRC-2丢失进行了比较。我们从SRC-2型弗洛克斯动物（图S6A），然后用GFP腺病毒（Ad-GFP）或Cre-regunusse-GFP腺病毒（Ad-Cre-GFP。使用SRC-2号机组在MEFs的敲除中，我们仍然观察到几个昼夜节律基因的基因表达发生了改变，包括Bmal1型,每1个、和哭泣1，在Ad-Cre-GFP中SRC-2号机组弗洛克斯中小企业基金(图6A). 与qPCR在循环MEF和肝脏中的结果类似(图4B)，我们看到SRC-2号机组在MEF中每2个（图S6B）。接下来，我们比较了WT和SRC-2号机组−/−小鼠的昼夜节律数据来自于一生的生理学。与组织特异性数据一致，核心昼夜节律基因的表达在SRC-2号机组−/−肝细胞（图S6C）。

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SRC-2删除显著干扰细胞自主时钟

（A） 同步MEF昼夜节律基因表达的qPCR分析SRC-2号机组弗洛克斯感染Ad-GFP或Ad-Cre-GFP的小鼠。数据表示每个时间点Ad-GFP最大基因表达的三倍，归一化为一，用平均值±SEM表示。*p<0.05与WT。

（B） 同步MEF中碳代谢代谢表型微阵列的热图SRC-2号机组弗洛克斯Hr10感染Ad-GFP或Ad-Cre-GFP的小鼠（n=3）。数据以平均值±SEM的形式绘制。*与WT小鼠相比，p<0.05。

（C） SRC-2作为BMAL1的作用示意图：核心时钟基因的时钟转录辅激活子。

接下来，我们探讨了SRC-2在肝脏代谢表型中的细胞自主作用SRC-2号机组−/−老鼠。根据肝脏代谢组，定量分析表明SRC-2号机组缺失改变了细胞的代谢表型，特别突出了碳水化合物使用的差异。我们发现Ad-GFP和Ad-Cre-GFP在碳代谢方面存在差异SRC-2号机组弗洛克斯MEF在糖酵解和糖异生途径中富集（表S2）。代谢产物吸收和利用的动力学分析表明SRC-2号机组消融在第10小时产生更强的影响（Hr10；图6B)与Hr2或Hr18相比（图S6D和S6E），表明SRC-2在细胞自主代谢调节中起着关键作用。总的来说，这些数据表明SRC-2对于以细胞自主方式维持代谢节律非常重要。

我们的模型提出，SRC-2在昼夜节律时钟的光照期充当BMAL1:CLOCK异二聚体的转录辅激活子。值得注意的是，SRC-2还在前馈环中靶向其自身的启动子作为BMAL1:CLOCK昼夜节律靶点(图6C).

讨论

我们对SRC-2的集体分析强烈表明，它在协调外周时钟的昼夜节律和代谢基因表达方面发挥着系统性作用。昼夜节律的控制在很大程度上取决于中枢和外周时钟的协调节律，在分子水平上由BMAL1:CLOCK异二聚体驱动。我们已经证明SRC-2是BMAL1:CLOCK的转录协同调节器，SRC-2的缺失扰乱了源于中心时钟的昼夜节律，这一点可以从肝脏外周时钟转录组和代谢组下游的异常运转轮行为中看出。此外，我们通过HuGE Navigator调查了重叠的SRC-2和BMAL1靶点在人类流行病学中的相关性，并发现人类疾病（如糖原贮积病1型和冯·吉尔克病）中的富集（表S3；Chopra等人，2008年)以及我们之前观察到的几种精神障碍SCR-2号机组−/−老鼠(Stashi等人，2013年). 我们还发现SRC-2可能与其他疾病相关，包括血栓形成、早衰和与昼夜节律有关的睡眠障碍，所有这些都与BMAL1有关(Bunger等人，2000年;Kondratov等人，2006年;Somanath等人，2011年).

我们还证明，SRC2缺失在细胞自主水平上扰乱了代谢节律。令人惊讶的是SRC-2号机组消融对中枢生物钟和外周生物钟有如此巨大的影响，因为它在生物钟调节中起着以前未被证实的协同调节作用。

辅激活子和辅抑制子被公认为通过放大或抑制基因表达来协助昼夜节律转录调控。其他协调剂也被描述为在昼夜节律中起作用，包括NCoR与HDAC3、PGC1-α、RIP140、JARID1a、MAP1a、TRAP150，以及其他一些影响NRs和BMAL1活动的协调剂：时钟(Curtis等人，2004年;DiTacchio等人，2011年;Feng等人，2011年;Lande-Diner等人，2013年;Li等人，2013年;Liu等人，2007年;Poliandri等人，2011年). 我们认为，SRC-2积极调节昼夜基因表达的能力很大程度上是通过共同激活BMAL1:CLOCK和SRC-2靶向其自身启动子实现的，可能是为了加强前馈回路中的基因表达。这表明SRC-2在调节生命系统的动态多参数代谢和昼夜节律反应中具有生理功能(图6C).

新陈代谢和昼夜节律调节之间的联系是没有争议的。在其他昼夜节律突变小鼠模型中可以看到代谢失调和相关病理。例如，类似于SRC-2型−/−老鼠Bmal1型突变体不仅有中枢和外周时钟的破坏，而且还表现出糖异生受损、胰岛素敏感性增加、不孕和脂肪增生缺陷(Chopra等人，2008年,2011;Hatanaka等人，2010年;Kondratov等人，2006年;Picard等人，2002年;Rudic等人，2004年). 我们的数据表明，SRC-2具有令人惊讶的强大的昼夜节律表型，并通过积极刺激BMAL1:clock的转录活性，对分子钟起到重要的协同调节作用。此外，SRC-2还可能与AMPK或其他能量敏感分子一起发挥作用，以帮助嵌入昼夜节律和代谢转录调控(Lamia等人，2009年;Um等人，2011年).

我们的研究强调SRC-2是BMAL1:CLOCK的一个有效转录辅激活子，在先前已知的SRC-2的生理重要性和其在昼夜节律中新认识的作用之间提供了一个整体联系。鉴于SRC-2的众多代谢作用及其在生殖和现在的昼夜节律中的已知作用，这项工作进一步巩固了SRC-2在系统中的重要性，旨在提供一种将这些过程联系起来的机制。通过这种方式，SRC-2已经发展成为能量积累、能量储存、繁殖、细胞增殖和（如图所示）昼夜节律钟的主要集成商(O'Donnell等人，2012年;Chopra等人，2008年,2011;Gehin等人，2002年;Hartig等人，2011年;Picard等人，2002年). 对于这些相互关联的生理过程，主调节器的进化优势是显而易见的。仅通过失去SRC-2，我们就显示了整体生理学的破坏，因此得出结论，SRC-2可能在能量、昼夜节律和生殖的调节轴中发挥比以前想象的更大的作用。

实验程序

动物

The generation ofSRC-2号机组−/−,SRC-2号机组弗洛克斯,SRC-2 LKO、和Bmal1型−/−之前描述过老鼠(Bunger等人，2000年;Chopra等人，2011年;Gehin等人，2002年). 同类WT和SRC-2号机组−/−所有研究均使用雄性同窝小鼠（年龄为10-20周），MEF生成除外。在组织收集RNA和蛋白质之前，所有小鼠在严格的温度控制和随意食物（正常食物，2920X；Teklad Global）和12小时L/D条件下饮用水至少2周。贝勒医学院动物护理和研究委员会批准了所有动物研究。

ChIP-Seq公司

通过Active Motif对ZT4和ZT18处死的C57BL/6J WT肝裂解物进行ChIP-seqSRC-2号机组−/−使用小鼠SRC-2抗体346A（Bethyl Laboratories）在ZT4进行肝脏裂解。使用ELAND软件将Illumina的基因组分析仪2识别出的约2400万个读数映射到小鼠基因组（Build37.1/mm9）。只有在前28个bp中唯一映射且不超过两个错配的序列被保留并用作有效读取。峰值调用由MACS 1.3.7.1执行（选项：p值=1×10−10和MFOLD 30）。

ChIP序列数据分析

Galaxy/Cistrome的SeqPos图案工具（v1.0.0）(http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/root)在整个SRC-2 ChIP-seq区间集（20599个区间）上用于从头（MDscan算法）和基于参考（Transfac、JASPAR、pbm和hPDI数据库）的序列模体分析，Galaxy/Cistrome对CEAS工具的实现用于染色体和基因组注释的富集分析。DAVID（注释、可视化和集成发现数据库）生物信息资源v6.7(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)用于蛋白质编码基因以鉴定富集的生物学主题。对于数据集成和宏基因组数据分析，SRC-2和BMAL1的结合位点(Koike等人，2012年)与小鼠参考基因注释相关(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih。gov/genemos/MapView/Mus_musculus/sequence/BUILD.37.1），并形成一个关系数据库系统，便于查询和数据共享。

炸薯条

从WT或所选敲除小鼠中分离肝组织，并在指定的ZT处快速冷冻。使用SimpleChIP酶染色质IP试剂盒（细胞信号）分离染色质，并按照制造商的建议进行操作。以3μg/ml的浓度使用SRC-2（Bethyl）和BMAL1（Abcam）抗体。使用基因特异性引物和SyberGreen技术（Applied Biosystems）对总输入DNA进行标准化qPCR。所有ChIP引物序列均可根据要求提供。

补充材料

补充数据

单击此处查看。（130万，pdf）

致谢

我们感谢C.Ljungberg和IDDRC RNA原位杂交核心的工作人员在尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development）的BCM IDDRC拨款5P30HD024064-23的支持下进行了全原位杂交染色。我们感谢MMRU的工作人员在美国农业部/农业研究所儿童营养研究中心的小鼠代谢研究室测量食物摄入量，该研究室由美国农业部农业研究所资助(https://www.bcm.edu/cnrc/mmru). 我们还要感谢V.Putluri在代谢表型微阵列方面的帮助。本研究得到了NIH（NCI F31CA171350 to E.S.，NIDDK PO1 P01 DK59820，3U19DK062434-10W1 to B.W.O’M.）和韦尔奇基金会（Q1521）的资助。此外，空间科学促进中心（CASIS）综合OMIC奖（向B.Y.、R.B.L.、A.S.和B.W.O.）提供了资金支持。部分资金支持由NIH拨款R01 CA137019-01A（给L.F.）和P01 DK59820、CPRIT RP120092（给A.S.和N.P.）以及与F.DeMayo的基因工程小鼠共享资源提供。这项工作的内容完全由作者负责，不一定代表NIH或尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康和人类发展研究所的官方观点。

脚注

加入人数

ChIP-seq数据集已保存在NCBI基因表达总览中，可通过登录号访问GSE53039标准.

补充信息

补充信息包括补充实验程序、六张图和三张表，可在以下网站上与本文一起找到：http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.01.027.

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